CN104255500A

CN104255500A - 一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法

Info

Publication number: CN104255500A
Application number: CN201410510795.0A
Authority: CN
Inventors: 朱诚; 孙骏威; 王飞娟; 江琼; 丁艳菲
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2034-09-29
Also published as: CN104255500B

Abstract

本发明公开了一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：（1）红腺悬钩子的消毒和接种；当年11月至次年3月之间，剪取带腋芽的茎段接种到WPM基本培养基中；（2）丛生芽的诱导；（3）不定芽的增殖；（4）再生植株的生根培养；（5）炼苗移栽：待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过5cm时，拿出再生植株，将植株定植于珍珠岩、泥炭的混合基质中，适应3-5d后即可移栽大田中。采用本发明的方法，能够快速地获得红腺悬钩子植株，利于产业化生产。采用本发明方法，红腺悬钩子丛生芽的诱导率高达95%，不定芽增殖率可达8.6，植株生根率、移栽成活率可达95%以上。

Description

一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法

技术领域

本发明属于植物培养技术领域，具体涉及一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法。

背景技术

红腺悬钩子(Rubus sumatranus Miq.)，又名牛奶莓、虎泡、灯笼泡、七月泡、马泡、红刺苔等，为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属的一种直立或攀援灌木，因小枝、叶轴、叶柄、花梗和花序均被紫红色腺毛而得名。红腺悬钩子广泛分布于湖北、湖南、江西、安徽、浙江、福建、台湾、广东、广西、四川、贵州、云南、西藏等省。生长于山地、山谷疏密林内、林缘、灌丛内、竹林下及草丛中。花期4~6月，果期7~8月。果实为聚合果，长圆形，桔红色，味甜。可供生食，亦可加工成果酱、果酒和果汁等。陈炳华(2000)通过对其果实营养成分的研究认为有较高的营养价值和医疗保健作用，应加以重视和开发。在秋季，采挖红腺悬钩子的匍匐枝的细根及块根，洗净，晒干后可入药。性寒，味苦；具清热解毒、开胃、利水等功效，主治产后寒热腹痛，食欲不振，水肿，中耳炎。同属多种植物的组培快繁已有报道，但红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的报道尚未见。悬钩子属植物采用的基本培养基绝大部分为MS培养基或改良MS培养基，极少为其它培养基，如裂叶悬钩子采用的是改良NN69培养基。采的外植体主要为茎段，通过直接诱导丛生芽或先诱导愈伤组织再分化的方式，而叶片、叶柄等主要采用的是直接诱导不定芽。茎段直接诱导丛生芽的激素组合一般是6-BA和NAA的组合或6-BA和IBA的组合，也有6-BA和NAA的组合诱导茎段产生愈伤组织并分化的报道（地被悬钩子）；叶片直接产生不定芽主要采用的是BA和 IAA 的组合、BA和NAA的组合、TDZ和NAA的组合及ZT和NAA的组合。生根主要用的基本培养基是1/2浓度，主要采用的是NAA，还有采用IBA，也有采用NAA与IAA混合使用，也有体外使用0.5 g/L IBA浸下再生根的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种成活率高，利于实现产业化生产的红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法。

为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）红腺悬钩子的消毒和接种

当年11月至次年3月之间，剪取带腋芽的茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒12-17 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（2）丛生芽的诱导

当年11月至次年3月之间，剪取带腋芽的茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒14-15 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0 mg/L ，IAA 0-5.0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7.0 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（3）不定芽的增殖

将上一步诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0mg/L ，IAA 0-5.0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（4）再生植株的生根培养

切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到12.5%-100% WPM，NAA 0-1.0 mg/L ，IAA 0-2.0 mg/L，AC 0-2.0 mg的生根培养基中；

（5）炼苗移栽

待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水小心将残留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：（1-5）的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28℃之间。待新叶长出，即可揭开薄膜并叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后即可移栽大田中。

作为优选方案：在所述滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒的时间为14-15 min。

作为优选方案：所述步骤（2）中WPM基本培养基中添加了TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/L ，IAA 0.5 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L。

作为优选方案：所述步骤（3）中WPM基本培养基中添加了TDZ 0.5 mg/L ，6-BA 1.0 mg/L ， IAA 1.0 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L。

作为优选方案：所述步骤（4）中的生根培养基为50-100%WPM，NAA 0.2 mg/L ，IAA 0.5 mg/L，AC 0.1 -0.2 mg/L。

作为优选方案：所述步骤（5）的混合基质中珍珠岩与泥炭的重量比为 1：5。

与现有技术相比较，本发明的有益效果是：采用本发明的方法，能够快速地获得红腺悬钩子植株，利于产业化生产。采用本发明方法，红腺悬钩子丛生芽的诱导率高达95%，不定芽增殖率可达8.6，植株生根率、移栽成活率可达95%以上。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：

（1）红腺悬钩子的消毒和接种

当年11月至次年3月之间，剪取带腋芽的茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒14-15 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培养基中培养，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)。外植体成活率达98%。

步骤（1）为预实验，用以选取最佳的丛生芽进行诱导。

（2）丛生芽的诱导

当年11月至次年3月之间，从步骤（1）中丛生芽苗剪取带腋芽的茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒14-15 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/L ，IAA 0.5 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7.0 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)。30 d后统计发现，不定芽诱导率在95%，不定芽数在7.0，而且不定芽叶色浓绿，生长良好，株高和茎粗适中。

（3）不定芽的增殖

将上一步诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有TDZ 0.5 mg/L ，6-BA 1.0 mg/L ， IAA 1.0 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L的WPM基本培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)。30 d后统计发现，增殖倍数8.6，且无玻璃化苗，植株粗壮，且生长较快。

（4）再生植株的生根培养

切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到50-100%WPM，NAA 0.2 mg/L ，IAA 0.5 mg/L，AC 0.1 -0.2 mg/L的生根培养基中，30 d时统计发现，最早6 d就可以生根，生根率可达95%以上，根数5.5根，根粗适中，适于炼苗移栽。

其中50-100%WPM指的是培养基中WPM基本培养基的浓度，其它物质的浓度不受影响。50% WPM就是指WPM基本培养基配方里的所有物质用量为原来的1/2。

（5）炼苗移栽

待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水小心将残留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠岩，泥炭重量比为1： 5的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28℃之间。待新叶长出，即可揭开薄膜并叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后即可移栽大田中，移栽成活率可达95%以上。

文中涉及的缩略词：

AC 活性炭

6-BA 6-苄氨基腺嘌呤

CH 水解酪蛋白

IAA 吲哚乙酸

NAA 萘乙酸

TDZ 噻苯隆(脱叶脲)

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于步骤（1）：红腺悬钩子的消毒和接种：当年11月至次年3月之间，剪取带腋芽的茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒12-17 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)。30 d后统计发现，污染率10%以下，成活率在70%-98%，以滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒14-15 min为最佳消毒时间，既消毒完全又不损伤外植体，无污染，外植体成活率达98%。

表1 不同消毒时间对污染率和成活率的影响

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于步骤（2）：丛生芽的诱导：当年11月至次年3月之间，剪取带腋芽的茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒14-15 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0 mg/L ，IAA 0-5.0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7.0 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min。接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)。30 d后统计发现，不定芽诱导率介于0-92.5%之间，不定芽数为1.0-7.2之间，其中以WPM，TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/L ，IAA 0.5 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L效果最佳，不定芽诱导率在95%，不定芽数在7.0，而且不定芽叶色浓绿，生长良好，株高和茎粗适中。结果还表明，6-BA对于丛生芽的诱导效果较弱，TDZ较强，两者组合效果更佳；IAA对于不定芽的诱导和不定芽数并无影响，不过可以促进不定芽的生长；水解酪蛋白可轻微促进不定芽的生长，对不定芽的诱导和不定芽的数量并无影响。

表2 不同处理对丛生芽诱导的影响

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于步骤（3）：不定芽的增殖：将上一步诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0mg/L ，IAA 0-5.0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)。30 d后统计发现，各培养基中不定芽的增殖倍数在1.0-8.6之间，高的生长素和细胞分裂素均容易产生玻璃化现象，表现最佳的培养基为WPM，TDZ 0.5 mg/L ，6-BA 1.0 mg/L ， IAA 1.0 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L，其增殖倍数在8.6，且无玻璃化苗，植株粗壮，且生长较快。

表3 不同处理对不定芽增殖的影响

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于步骤（4）：再生植株的生根培养：切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到12.5%-100% WPM，NAA 0-1.0 mg/L ，IAA 0-2.0 mg/L，AC 0-2.0 mg的生根培养基中，30 d时统计发现，最早生根时间6-10 d，生根率在52.5-95%，根数在1.9-6.0之间，说明较易生根，WPM基本培养基的浓度对于生根基本无影响，只不过太低的浓度下生根的再生植株生长柔弱；活性炭对于不定芽的生根影响也不大，有轻微的促进作用，但高浓度的活性炭却有阻碍作用，再生植株生长柔弱；最佳的组合为50-100%WPM，NAA 0.2 mg/L ，IAA 0.5 mg/L，AC 0.1 -0.2 mg/L，生根时间早，最早6 d就可以生根，生根率可达95%以上，根数5.5根，根粗适中，适于炼苗移栽。

表4 不同培养基对生根的影响

对比实施例1至5可知，实施例1为最优选的实施例，实施例1的每个步骤均采用了实施例2至5所述的最佳培养条件，能够获得最高的红腺悬钩子植株产量。

Claims

1.一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）红腺悬钩子的消毒和接种

当年11月至次年3月之间，剪取带腋芽的茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒12-17 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（2）丛生芽的诱导

当年11月至次年3月之间，剪取带腋芽的茎段，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒14-15 min，然后用无菌水充分浸洗3次，以正常的极性方向接种到添加有TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0 mg/L ，IAA 0-5.0 mg/L，CH 0-1.0 mg/L的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7.0 g/L， pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；接好外植体的培养基先置于黑暗中10 h，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（3）不定芽的增殖

（4）再生植株的生根培养

（5）炼苗移栽

待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水小心将残留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：（1-5）的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28℃之间；待新叶长出，即可揭开薄膜并叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后即可移栽大田中。

2. 根据权利要求1所述的一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：在所述滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒的时间为14-15 min。

3. 根据权利要求1所述的一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（2）中WPM基本培养基中添加了TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/L ，IAA 0.5 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L。

4. 根据权利要求1所述的一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（3）中WPM基本培养基中添加了TDZ 0.5 mg/L ，6-BA 1.0 mg/L ， IAA 1.0 mg/L，CH 0.1-0.2 mg/L。

5. 根据权利要求1所述的一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的生根培养基为50-100%WPM，NAA 0.2 mg/L ，IAA 0.5 mg/L，AC 0.1 -0.2 mg/L。

6. 根据权利要求1所述的一种红腺悬钩子组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（5）的混合基质中珍珠岩与泥炭的重量比为 1：5。