CN109349110A

CN109349110A - 一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法

Info

Publication number: CN109349110A
Application number: CN201811428539.1A
Authority: CN
Inventors: 李操; 黎柳青
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-02-19

Abstract

本发明公开了一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，包括以下步骤：采集野生植株枝条、对枝条叶芽的灭菌及高温钝化脱毒、灭菌及初代培养、继代培养与快速增殖、诱导生根、移栽练苗、假植移栽、假植苗管理。本发明解决了传统种植甜叶悬钩子种苗来源及数量限制的问题，也解决了甜叶悬钩子内生菌的去除及病毒感染问题，得到甜叶悬钩子脱毒组培苗,确保了产量的增加及质量提高，为大面积种植展示了广阔的前景。

Description

一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体的说涉及一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法。

背景技术

甜叶悬钩子，俗称甜茶；拉丁文学名：Rubus suavissimus S．Lee,属蔷薇科，悬钩子属植物。野生分布于广西昭平、金秀、平乐等地海拔在200-1000米以上的山地。在民间，尤其是在瑶族、壮族等少数民族中有悠久的使用历史，主要是采摘野生甜叶悬钩子的叶子阴干，一般作茶饮用及加工食品用（甜味剂）。但长久以来，在瑶族地区更是作为一种著名瑶药使用，治病救人。据2002年出版的《中国瑶药学》记栽：【性味功能】味甘、涩、性平；清热解毒、清肺、补益、利尿消肿、止痛收敛、活血疏风。【传统应用】治感冒发热咳嗽、咽喉肿痛、小儿消化不良、无名肿毒、毒蛇咬伤、糖尿病、肾炎、小便不利、风湿骨痛、胃肠炎、痢疾、高血压、酒精中毒。

近年来，研究人员对甜叶悬钩子的叶子有效成分进行提取，成分包括甜茶素、黄酮甙、茶多酚、蛋白质、维生素（A、B、C、E、K）、20多种氨基酸（含18种人体必需的氨基酸）、微量元素（钙、铁、锌、硒）等；而甜茶素提取物的甜度是白糖的300倍，但其热量只有蔗糖的百分之一；具有降低血压、降低血糖、降血脂，抗过敏，抗氧化、润喉祛痰等功效。是一种难得的功能性植物，具有广阔的开发前景。

通过对甜茶产区的了解，最早人工栽培的面积较小，种苗的来源于野生的实生苗，由种子落地后萌发，种子萌发率低。进入20世纪八十年代后，由于人们认识到甜叶悬钩子的药用价值，才由封闭的瑶乡进入人们的视野。于是当地村民开始大面积种植，面积的扩大,种苗的来源成了最大的问题。因而人们尝试利用枝条进行扦插，但极难成功。原因在于甜叶悬钩子的髓心较大，韧皮部薄，不易形成愈伤组织，且在落叶前已把营养运输到根部。因此传统的种苗主要来源：一是分株繁殖，即利用母株枝根萌发的幼苗进行移栽；二是分根繁殖，即在春雨季节，水平支根上出现许多白色突起的不定芽，此时挖取支根，切段，斜插或浅埋均可。

传统种植带来如下三个问题：

一是受种苗来源及数量限制。无论分株繁殖或分根繁殖，增殖系数低，一年只能分一次。农户及种植公司短时不能获得稳定的种苗而不能大面积种植，难产生规模效益。

二是内生菌及病毒逐代积累使种性下降退化。通过调研发现许多种植户的甜叶悬钩子到第三年后，成片甜叶悬钩子都会发生枯死。又需开荒重新种植。针对这一问题，多年来产区的一般做法是新开荒地种植的甜叶悬钩子套种杉木等经济林。三年后，甜叶悬钩子枯死后杉树苗也已高出草面，这块地就变成了经济林，15年后经济林成材砍去，这块林地再烧荒再套种，如此15-18年一循环。

以上两点可看出大面积的种植受限于种苗的来源及品质的稳定。

三是传统的种植模式毁林开荒不可持续。随着“绿水青山就是金山银山”为主旨的生态文明理念渐入人心，良好的生态环境是可持续发展的根本保证。

若采用脱毒组培苗，一可免除种苗内生菌、病毒逐代积累使种性下降、退化及带病传播的危险。种植后种性稳定，产量高。二是短期内可大量增殖，大面积种植带来可靠的种苗保证。确保产量增加和品质的提高。

通过查新，目前国内对甜叶悬钩子脱毒苗的研究未见报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，解决了人工种植甜叶悬钩子内生菌的去除及病毒感染问题，得到脱毒甜叶悬钩子组培苗,可增加产量及提高质量，为大面积种植展示了广阔的前景。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，包括以下步骤：

（1）野生植株枝条的采集；

（2）对枝条叶芽的灭菌及高温钝化脱毒：将所述枝条的叶片先剪去，再切取长4-5cm且带一个以上叶芽的茎段，分别置于250ml的烧杯中，再加150ml清水及少量的灭菌洗衣粉茎段，振荡1分钟，静置2h后，用镊子取出用自来水冲洗干净，再置于干净的接种碟中，接着送入恒温箱中高温钝化脱毒；

（3）灭菌及初代培养：于无菌工作台中，进行灭菌处理，后在接种碟中从茎段切下叶芽，先剥去叶芽外的鳞片，切取1-2mm的茎尖作为外植体，再转入甜叶悬钩子初代培养基中进行初代培养；

（4）继代培养与快速增殖：待所述芽丛长到3-4cm时，转入甜叶悬钩子继代培养基中进行继代培养；

（5）诱导生根：待所述芽丛增殖长大株高达到5-6cm时，将植株转入甜叶悬钩子诱导生根培养基，进行诱导生根，得到脱毒试管苗；

（6）将脱毒试管苗进行移栽、假植移栽，并对假植苗进行管理即可得到脱毒组培苗。

优选的，所述步骤(1)中，在每年7-8月进行野生枝条的采集，这是甜叶悬钩子生长最旺盛的季节，于晴朗的午后，紫外线强，杂菌少。选择生长健壮、茎粗、叶张大而厚及皮刺少的野生植株，剪取25-30cm长且带多个长1.5cm的叶芽的枝条，后将枝条置于保鲜袋带回，此类芽增殖力最强，接种后抽芽快、分化能力强，是用于组织培养的最佳材料。

优选的，所述步骤(2)中，所述高温钝化脱毒，温度为39℃，时间为2h；因甜叶悬钩子的髓心大易失水，温度过高、时间过长会导致细胞活力下降。

优选的，所述步骤(3)的初代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：

0.6-1.0mg/L6-BA+1.0-1.5mg/LKT+0.1-0.25mg/LNAA+10mg/LVc+4.5-4.8%蔗糖+0.57-0.6%琼脂+0.5g/L活性炭 PH5.5-5.8。

优选的，所述步骤(4)的继代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：

0.8-1.2mg/L6-BA+1.5-2.0mg/LGA3+0.1-0.15mg/LNAA+10mg/LVc+4.5-4.8%蔗糖+0.57-0.6%琼脂+1.0g/L 活性炭PH5.5-5.8。

在初代培养、继代培养中，利用4.5-4.8%较高的蔗糖浓度目的在于易诱导木质部的形成。维生素C、活性炭综合使用的目的在于能较好地吸附有毒有害物质，防止有毒有害物质的积累。因为外植体脱分化、芽丛（愈伤组织）再分化过程中易产生次生代谢物，培养基变褐，种苗易死亡，而添加维生素C和活性炭就很好地解决这一难题。

优选的，所述步骤(5)的诱导生根培养基在1/2MS培养基的基础上含有以下成分：

0.2-0.5mg/LNAA+0.5-0.8mg/LIBA+4.5-4.8%蔗糖+0.57-0.6%琼脂+1.0g/L活性炭PH5.5-5.8。

优选的，所述步骤(3)的初代培养、步骤(4)的继代培养和步骤(5)的诱导生根培养都在培养室中进行，培养条件为：温度26-28℃，光照2500-2800Lux，相对湿度80-85%。

优选的,所述步骤(4)中，继代培养应不超过8代。

优选的,所述移栽练苗为将苗株连同培养瓶一起移至室外环境中放置2-3d,再打开瓶盖2-3d，干燥时雾喷清水保湿。

优选的,所述假植移栽为炼苗后将甜叶悬钩子试管苗夹出用清水冲洗干净根部的培养基，摆到有网格的篮子里荫干植表的水份，再假植于营养杯中，并淋透水，所述假植苗的管理为将假植苗放在保湿，保温，防虫的大棚内，做好保水保肥等各项工作。

本发明具有如下优点：

本发明通过对外植体进行高温钝化而达到脱毒及去除内生菌的目的：

1.在高温环境下，病毒分子处于钝化状态，增殖受到强烈的抑制，通过胞间连丝传导受阻，而这个温度及时间对甜叶悬钩子细胞属于耐受温度范围，对外植体伤害不大；

2. 在高温环境下内生菌也处于抑制状态，扩散受阻。由于茎尖分生区没有维管束，分离切取1-2mm的茎尖作外植体，与带内生菌的母体及时分离，内生菌没有感染的机会；

3.采用甜叶悬钩子脱毒苗可避免种苗内生菌、病毒逐代积累使种性下降的危险；

4.可避免种植到第三年后，成片甜叶悬钩子发生退化枯死的风险；

5.通过对甜叶悬钩子初代培养基、继代培养基与诱导生根培养基最优设计，25-30d可继代一次，增殖系数达到7-8倍以上，短时间可获得大量的种苗，为大面积种植带来可靠的种苗保证，同时确保了产量增加和品质的提高。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围：

实施例1

一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，包括以下步骤：（1）采集野生植株枝条：在7月份, 甜叶悬钩子生长最旺盛的季节，于晴朗的午后，紫外线强，杂菌少，选择生长健壮、茎粗、叶张大而厚及皮刺少的野生植株，剪取25cm长且带多个长1.5cm的叶芽的枝条，后将枝条置于保鲜袋带回，此类芽增殖力最强，接种后抽芽快、分化能力强，是用于组织培养的最佳材料；（2）对枝条叶芽的灭菌、高温钝化脱毒：将枝条的叶片先剪去，再切取长4cm且带一个以上叶芽的茎段，分别置于250ml的烧杯中，再加150ml清水及少量的灭菌洗衣粉茎段，振荡1分钟，静置2h后，用镊子取出用自来水冲洗干净，再置于干净的接种碟中，接着送入恒温箱中高温钝化脱毒，温度39℃，时间为2h；因甜叶悬钩子的髓心大易失水，温度过高时间过长会导致细胞活力下降；（3）灭菌及初代培养：经高温钝化后，取出茎段，在无菌工作台中，进行灭菌处理，后在接种碟中从茎段切下叶芽，先剥去叶芽外的鳞片，切取1-2mm的茎尖，再将茎尖部分转入甜叶悬钩子初代培养基进行初代培养；培养室中的温度为26℃，光照控制为2500Lux，相对湿度为80%；初代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：0.6mg/L6-BA+1.0mg/LKT+0.1mg/LNAA+10mg/LVc +4.5%蔗糖+0.57%琼脂+0.5g/L活性炭 PH 5.5。（4）继代培养与快速增殖：开始时茎尖变绿，此时周边长出许多绿色的生长点，尔后逐渐长大成芽丛，待茎尖长到3cm时，可以转入甜叶悬钩子继代培养基进行第一次继代，之后每25d继代一次；继代培养不超过8代, 以防发生变异。继代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：MS+0.8mg/L6-BA+1.5mg/LGA3+0.1mg/LNAA+10mg/LVc+4.5%蔗糖+0.57%琼脂+1.0g/L活性炭PH5.5。（5）诱导生根：增殖到一定数量及株高达到5-6cm时，将植株转入甜叶悬钩子诱导生根培养基进行诱导生根；诱导生根培养基在1/2MS培养基的基础上含有以下成分：0.2mg/LNAA+0.5mg/LIBA+4.5%蔗糖+0.57%琼脂+1.0g/L活性炭 PH5.5。（6）移栽练苗：将培养瓶从培养室中移到室外2d,再打开瓶盖2d，干燥时雾喷清水保湿；（7）假植移栽：炼苗后将甜叶悬钩子试管苗夹出用清水冲洗干净根部的培养基，摆到有网格的篮子里荫干植表的水份，再假植于营养杯中，并淋透水；（8）假植苗管理：将假植苗放在保湿，保温，防虫的大棚内，做好保水保肥等各项工作。

实施例2

一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，包括以下步骤：（1）采集野生植株枝条：在8月份, 甜叶悬钩子生长最旺盛的季节，于晴朗的午后，紫外线强，杂菌少，选择生长健壮、茎粗、叶张大而厚及皮刺少的野生植株，剪取30cm长且带多个芽长2.5cm的叶芽的枝条，后将枝条置于保鲜袋带回，此类芽增殖力最强，接种后抽芽快、分化能力强，是用于组织培养的最佳材料；（2）对枝条叶芽的灭菌、高温钝化脱毒：将枝条的叶片先剪去，再切取长4-5cm且带一个以上叶芽的茎段，分别置于250ml的烧杯中，再加150ml清水及少量的灭菌洗衣粉茎段，振荡1分钟，静置2h后，用镊子取出用自来水冲洗干净，再置于干净的接种碟中，接着送入恒温箱中高温钝化脱毒，温度39℃，时间为2h；因甜叶悬钩子的髓心大易失水，温度过高时间过长会导致细胞活力下降；（3）灭菌及初代培养：经高温钝化后，取出茎段，在无菌工作台中，进行灭菌处理，后在接种碟中从茎段切下叶芽，先剥去叶芽外的鳞片，切取1-2mm的茎尖，再将茎尖部分转入甜叶悬钩子初代培养基进行初代培养；培养室中的温度为28℃，光照控制为2800Lux，相对湿度为85%；初代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：1.0mg/L6-BA+1.5mg/LKT+0.25mg/LNAA+10mg/LVc+4.8%蔗糖+0.6%琼脂+0.5g/L活性炭 PH5.8。（4）继代培养与快速增殖：开始时茎尖变绿，此时周边长出许多绿色的生长点，尔后逐渐长大成芽丛，待茎尖长到4cm时，可以转入甜叶悬钩子继代培养基进行第一次继代，之后每30d继代一次；继代培养不超过8代, 以防发生变异。继代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：1.2mg/L6-BA+2.0mg/LGA3+0.15mg/LNAA+10mg/LVc+4.8%蔗糖+0.6%琼脂+1.0g/L活性炭PH 5.8。（5）诱导生根：增殖到一定数量及株高达到6cm时，将植株转入甜叶悬钩子诱导生根培养基进行诱导生根；诱导生根培养基在1/2MS培养基的基础上含有以下成分： 0.5mg/LNAA+0.8mg/LIBA+4.8%蔗糖+0.6%琼脂+1.0g/L活性炭 PH5.8。（6）移栽练苗：将培养瓶从培养室中移到室外3d,再打开瓶盖3d，干燥时雾喷清水保湿；（7）假植移栽：炼苗后将甜叶悬钩子试管苗夹出用清水冲洗干净根部的培养基，摆到有网格的篮子里荫干植表的水份，再假植于营养杯中，并淋透水；（8）假植苗管理：将假植苗放在保湿，保温，防虫的大棚内，做好保水保肥等各项工作。

实施例3

一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，包括以下步骤：（1）采集野生植株枝条：在7月份, 甜叶悬钩子生长最旺盛的季节，于晴朗的午后，紫外线强，杂菌少，选择生长健壮、茎粗、叶张大而厚及皮刺少的野生植株，剪取28cm长且带多个芽长2cm的叶芽的枝条，后将枝条置于保鲜袋带回，此类芽增殖力最强，接种后抽芽快、分化能力强，是用于组织培养的最佳材料；（2）对枝条叶芽的灭菌、高温钝化脱毒：将枝条的叶片先剪去，再切取长4.5cm且带一个以上叶芽的茎段，分别置于250ml的烧杯中，再加150ml清水及少量的灭菌洗衣粉茎段，振荡1分钟，静置2h后，用镊子取出用自来水冲洗干净，再置于干净的接种碟中，接着送入恒温箱中高温钝化脱毒，温度39℃，时间为2h；因甜叶悬钩子的髓心大易失水，温度过高时间过长会导致细胞活力下降；（3）灭菌及初代培养：经高温钝化后，取出茎段，在无菌工作台中，进行灭菌处理，后在接种碟中从茎段切下叶芽，先剥去叶芽外的鳞片，切取1-2mm的茎尖，再将茎尖部分转入甜叶悬钩子初代培养基进行初代培养；培养室中的温度为27℃，光照控制为2650Lux，相对湿度为82%；初代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：0.8mg/L6-BA+1.2mg/LKT+0.2mg/LNAA+10mg/LVc +4.6%蔗糖+0.58%琼脂+0.5g/L活性炭 PH 5.7。（4）继代培养与快速增殖：开始时茎尖变绿，此时周边长出许多绿色的生长点，尔后逐渐长大成芽丛，待茎尖长到3.5cm时，可以转入甜叶悬钩子继代培养基进行第一次继代，之后每25-30d继代一次；继代培养不超过8代, 以防发生变异。继代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：1mg/L6-BA+1.8mg/LGA3+0.12mg/LNAA+10mg/LVc+4.6%蔗糖+0.58%琼脂+1.0g/L活性炭 PH5.6。（5）诱导生根：增殖到一定数量及株高达到5.5cm时，将植株转入甜叶悬钩子诱导生根培养基进行诱导生根；诱导生根培养基在1/2MS培养基的基础上含有以下成分：0.35mg/LNAA+0.6mg/LIBA+4.7%蔗糖+0.58%琼脂+1.0g/L活性炭 PH5.7。（6）移栽练苗：将培养瓶从培养室中移到室外3d,再打开瓶盖2d，干燥时雾喷清水保湿；（7）假植移栽：炼苗后将甜叶悬钩子试管苗夹出用清水冲洗干净根部的培养基，摆到有网格的篮子里荫干植表的水份，再假植于营养杯中，并淋透水；（8）假植苗管理：将假植苗放在保湿，保温，防虫的大棚内，做好保水保肥等各项工作。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims

1.一种瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）野生植株枝条的采集；

2.根据权利要求1所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述步骤(1)中，在每年7-8月进行野生枝条的采集，剪取25-30cm长且带多个长1.5-2.5cm的叶芽的枝条。

3.根据权利要求1所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述步骤(2)中，所述高温钝化脱毒，温度39℃，时间为2h。

4.根据权利要求1所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述步骤(3)的初代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：

5.根据权利要求1所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述步骤(4)的继代培养基在MS培养基的基础上含有以下成分：

6.根据权利要求1所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述步骤(5)的诱导生根培养基在1/2MS培养基的基础上含有以下成分：

7.根据权利要求1-6任一项所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述初代培养、继代培养和诱导生根培养都在培养室中进行，培养条件为：温度26-28℃，光照2500-2800Lux，相对湿度80-85%。

8.根据权利要求1所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述步骤(4)中，继代培养应不超过8代。

9.根据权利要求1所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述移栽练苗为将苗株连同培养瓶一起移至室外环境中放置2-3d,再打开瓶盖2-3d，干燥时雾喷清水保湿。

10.根据权利要求1所述瑶药甜叶悬钩子脱毒苗的快繁方法，其特征是，所述假植移栽为炼苗后将甜叶悬钩子试管苗夹出用清水冲洗干净根部的培养基，摆到有网格的篮子里荫干植表的水份，再假植于营养杯中，并淋透水，所述假植苗的管理为将假植苗放在保湿，保温，防虫的大棚内，做好保水保肥等各项工作。