CN101803571B - 一种水半夏的组培快繁法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水半夏的组培快繁法，依次包括如下步骤：1)、水半夏块茎经消毒处理后，切割成块茎I接种于分化培养基上；2)、待块茎I上长出0.1～0.3cm高的芽头时，将块茎1分切成带有1～2个芽头的块茎II，将块茎II接种于丛生芽培养基上；3)、待块茎II上的丛生芽长至3～4cm时，将块茎II转入生根培养基中培养；4)、待整个水半夏植株高度为5～7cm，便可通过常规的室外炼苗获得可栽培的水半夏植株。采用本发明的方法可以快速获得大量的水半夏植株。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞工程技术领域，主要利用植物组织培养技术，具体涉及一种水半夏规模化组培快繁的方法。
背景技术
水半夏[Typhonium flagelliforme(Lodd.)Blume]是天南星科犁头尖属植物，其块茎为一种重要的中药材。水半夏具有燥湿化瘦、消肿止痛、清热解毒等功效，一般用于治疗咳嗽痰多、疮痈疖肿、跌打损伤及外伤出血等症。水半夏原为广东、广西地区民间用药，虽然近几十年才被记录《中国药典》，但由于其药用功效和半夏相近，现已被人们所熟知和应用。20世纪60年代初期作为野生种引种栽培，许多地方将其作为半夏的代用品长期使用。水半夏与三叶半夏相比，对温度、湿度的要求较低，不易倒苗和感染腐烂病，易栽培，耐受性强，受到广大药农的认可。近年来，水半夏的药用价值不断被开发，国内外市场需求成倍增加，供不应求。自然状态下，水半夏以无性繁殖(珠芽繁殖或块茎繁殖)为主，有性繁殖(种子繁殖)少，且繁殖系数较低，约为1∶5；又由于环境污染、过度采挖、野生栖息地遭到破坏等原因导致水半夏野生资源日益枯竭。这种现状下，就为人工栽培水半夏带来了良好的经济前景。
植物组织培养技术现已广泛应用于植物的无性繁殖方面，因占地小、不受地区和季节限制、培养周期短、繁殖率高、利于工厂化生产和自动化控制等优点，受到人们的关注。目前，用组培方法繁育水半夏种苗已有较多报道，相关技术也较为成熟。至今，以水半夏的根、茎、叶及未成熟种子，甚至以叶肉原生质体为外植体，采用液体、固体培养法和悬浮培养法等，均已培育出了完整的再生植株。上述技术均通过建立愈伤组织体系形成再生植株，一般来说诱导愈伤组织相对较难，时间较长(需要3个月左右)。
相关报道和研究也已证实组培水半夏和野生水半夏的质量上并没有本质区别，符合药用需求，故可以利用组培苗为种，进行栽培。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水半夏的组培快繁法，采用该方法可以快速获得大量水半夏植株。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水半夏的组培快繁法，依次包括如下步骤：
1)、新鲜的水半夏块茎经消毒处理后，于无菌条件下切割成块，得块茎I；然后将块茎I接种于分化培养基上；
2)、待块茎I上长出0.1～0.3cm高的芽头时，将块茎I分切成块茎II，所述每个块茎II上带有1～2个芽头；然后将块茎II接种于丛生芽培养基上，促使芽头发育成丛生芽；
3)、待块茎II上的丛生芽长至3～4cm时，将块茎II转入生根培养基中培养；
4)、待整个水半夏植株高度为5～7cm，便可通过常规的室外炼苗获得可栽培的水半夏植株。
上述步骤3)中，块茎II上的丛生芽长至3～4cm时，一般均会有部分叶片展开；步骤4)的培养时间一般为20～25天。
作为本发明的水半夏的组培快繁法的改进：步骤1)块茎I在分化培养基上出芽的同时将生长变大，得到带芽头且培养变大的块茎I；将上述带芽头且培养变大的块茎I再次分切成新的块茎I，转入另一份分化培养基中培养；然后再进行步骤2)。
这是根据“芽生芽”现象，新的块茎I在切面上会更易和更快地生成新的芽头，从而能获得更多的组培物。
作为本发明的水半夏的组培快繁法的进一步改进：
分化培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L+α-萘乙酸(α-NAA)0.2～0.5mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂7.0g/L，pH 5.6～5.8；
其制作方法具体如下：以1L的MS基本培养基作为基础，分别加入1.0～2.0mg的6-苄氨基嘌呤、0.2～0.5mg的α-萘乙酸、25～35g的蔗糖和7g的琼脂，均匀混合，并利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.6～5.8。
丛生芽培养基为：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L+α-萘乙酸(α-NAA)0.1～0.3mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂7.0g/L，pH 5.6～5.8；
其制作方法具体如下：以1L的MS基本培养基作为基础，分别加入1.0～2.0mg的6-苄氨基嘌呤、0.1～0.3mg的α-萘乙酸、25～35g的蔗糖和7g的琼脂，均匀混合，并利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.6～5.8。
生根培养基为：MS+吲哚丁酸(IBA)0.2～0.4mg/L+α-萘乙酸(α-NAA)0.1～0.2mg/L+活性碳0.3g/L+蔗糖25～35g/L+琼脂7.0g/L，pH 5.8～6.0。
其制作方法具体如下：以1L的MS基本培养基作为基础，分别加入0.2～0.4mg的吲哚丁酸、0.1～0.2mg的α-萘乙酸、0.3g的活性碳、25～35g的蔗糖和7g的琼脂，均匀混合，并利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8～6.0。
作为本发明的水半夏的组培快繁法的进一步改进：每个步骤的培养条件均为：培养温度为25±4℃(优选25±2℃)，光强1500LX～2000LX，光照时间12h/d。
作为本发明的水半夏的组培快繁法的进一步改进：步骤1)的消毒处理为：将水半夏块茎经体积浓度75％的酒精浸泡0.5～1min，无菌水冲洗3～4次，再经质量浓度0.1％的氯化汞水溶液消毒处理10min，无菌水冲洗6～8次。
在本发明中：光照时间12h/d是指光照(12h/d)和暗培养(12h/d)交替进行。
在本发明的步骤1)中：新鲜的水半夏块茎完成消毒处理后，先切除块茎外皮，然后再于无菌条件下切割成块；目的是去除被氯化汞处理过的组织，从而使新鲜组织接触培养基。块茎I的大小在0.3～0.5cm2左右，在容量为250ml的组培瓶内配置25～30ml的分化培养基，每瓶内放置4～5个块茎I，9～12天更换一次分化培养基；18～20天块茎I上就可长出芽头，每个外植体(即块茎I)可长出4～6个芽头；
在本发明的步骤2)中，以1～2个芽头为单位切分出块茎II，将块茎II转移至丛生芽培养基中，在容量为250ml的组培瓶内配置25～30ml的丛生芽培养基，每瓶内放置4～5个块茎II，9～12天更换一次丛生芽培养基；一般18～20天丛生芽可长至3～4cm；
在本发明的步骤3)中，在容量为250ml的组培瓶内放置25～30ml的生根培养基，每个容器内放4～5个块茎II，不用更换培养基，一般20～25天，即可获得可栽培的水半夏植株。
本发明所使用的3种培养基中，6-苄氨基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(α-NAA)、吲哚丁酸(IBA)均为附加植物生长素，有利于水半夏的生长繁殖；无植物细胞分裂素的情况下，块茎不形成愈伤组织，不经愈伤阶段。在生根培养基中添加活性碳，将有助于根的生长和块茎的生成，从而获得可栽培的水半夏植株。
本发明的水半夏的组培快繁法，是通过诱导水半夏块茎出芽，然后将带芽块茎转移至丛生芽培养基，最后转入生根培养基中，从而获得大量的再生植株。本发明的主要优点如下：
1、本发明充分利用了水半夏丛生芽的生长能力强的特点，直接采用块茎诱导丛生芽，不经过愈伤组织阶段，即可直接获得可栽培的再生植株。因此具有工艺简洁、成本低廉的特点。
2、能够快速获得大量外观、有效成分、性状一致的水半夏植株，有效解决由于野生水半夏资源濒临枯竭，资源短缺，造成的种苗市场供应不足的现状；因此本发明具有投资少、收效快的特点。
3、利用本发明的方法获得可栽培的水半夏植株一般仅需56～65天，因此本发明通过规模化组培的方法，大大提高了水半夏扩繁的速度，能够在较短时间内获得大量具有单一性状的水半夏植株，具有较高的经济价值。
4、有利于具有优良性状水半夏品种的保存、纯化。
5、本发明利用水半夏丛生芽生长能力强的特点，通过“以芽生芽”的方式，从而得更多的丛生芽。
具体实施方式
实施例1、一种水半夏的组培快繁法，依次进行如下步骤：
1)、清水洗净新鲜的水半夏块茎，经体积浓度75％的酒精浸泡0.5～1min，无菌水冲洗3～4次，再经质量浓度0.1％的氯化汞水溶液消毒处理10min，无菌水冲洗6～8次。
将上述消毒好的水半夏块茎先切除块茎外皮，然后再于无菌条件下切割成0.3～0.5cm2的小块(目的是去除被氯化汞处理过的组织，从而使新鲜组织接触培养基)，成块茎I，接种于分化培养基。在容量为250ml的组培瓶内配置25～30ml的分化培养基，每瓶内放置4～5个块茎I，于温度为25±4℃的条件下光照培养，光照时间为12h/d，光照强度为1500LX～2000LX，9～12天换一次培养基；一般18～20天即长出芽头，每个外植体(块茎I)出4～6个芽头；
分化培养基为：MS+6-BA 1.5mg/L+α-NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH 5.6～5.8；
2)、待步骤1)的块茎I上的芽头高度为0.1～0.3cm时，将该带芽的块茎I分切成小块，成块茎II，使每个块茎II上带1～2个芽，将块茎II接种于丛生芽培养基，具体为：在容量为250ml的组培瓶内配置25～30ml的丛生芽培养基，每瓶内放置4～5个块茎II，9～12天更换一次丛生芽培养基，光照培养条件同步骤1)，；一般18～20天丛生芽可长至3～4cm；
丛生芽培养基为：MS+6-BA 1.5mg/L+α-NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH 5.6～5.8；
3)、待步骤2)所得的再生植株长至3～4cm(即块茎II上的丛生芽长至3～4cm时)并且有叶片展开时，便可以将其转入生根培养基中，具体为：在容量为250ml的组培瓶内放置25～30ml的生根培养基，每个容器内放4～5个块茎II，光照培养条件同步骤1)，不用更换培养基，一般20～25天，整个水半夏植株高度就约在5-7cm。
待整个水半夏植株高度约在5-7cm、根茎形成良好健全时，便可通过常规的室外炼苗进而获得完整的水半夏植株；
生根培养基为：MS+IBA 0.3mg/L+α-NAA 0.2mg/L+活性碳0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH 5.8～6.0。
30天扩繁系数为1∶15～25，90天扩繁系数为1∶100～120，120天扩繁系数为1∶900～1100。
实施例2、
取新鲜的水半夏块茎，具体步骤如实施例1所示，所不同的是诱导水半夏器官分化的培养温度为21℃，23～26天长出芽，每个外植体(块茎I)出4～6个芽；
30天扩繁系数为1∶10～20，90天扩繁系数1∶80～120。120d天扩繁系数1∶650～900。
实施例3、
取新鲜的水半夏的丛生芽，具体步骤如实施例1所示，所不同的是诱导水半夏器官分化的培养温度为29℃，14天后，每个块茎I上产生4～6个芽；
30d扩繁系数1∶10～18，90天扩繁系数1∶75～90，120d天扩繁系数1∶550～750。
实施例4、
将实施例1获得的完整水半夏植株去除根、茎、叶，无须消毒，直接将块茎再次切成0.3～0.5cm2的几个小块，接种入分化培养基，25±4℃条件下光照培养，光照培养条件同实施例1；13～16天后出芽，每块出4～6个芽。接着按照实施例1的步骤2)3)继续进行。省去步骤1)，从而加快出芽，缩短扩繁时间，提高扩繁速度。
实施例5、
取新鲜的水半夏块茎，具体步骤如实施例1所示，所不同的是步骤1)的块茎I在分化培养基上出芽的同时将生长变大，可将带芽头且培养变大的块茎再次分切成新的块茎I(0.3～0.5cm2)，从而转入新的分化培养基中培养。根据“芽生芽”现象，新的块茎在切面上会更易和更快地生成新的芽头。反复循环以形成更多的带芽块茎，显著缩短扩繁时间，大大提高扩繁速度。
30天扩繁系数为1∶15～25，90天扩繁系数为1∶120～150，120天扩繁系数为1∶1500～1800。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种水半夏的组培快繁法，其特征是依次包括如下步骤：
1)、新鲜的水半夏块茎经消毒处理后，于无菌条件下切割成块，得块茎I；然后将块茎I接种于分化培养基上；
所述分化培养基为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L+α-萘乙酸0.2～0.5mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂7.0g/L，pH 5.6～5.8；
2)、待块茎I上长出0.1～0.3cm高的芽头时，将块茎I分切成块茎II，所述每个块茎II上带有1～2个芽头；然后将块茎II接种于丛生芽培养基上，促使芽头发育成丛生芽；
所述丛生芽培养基为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L+α-萘乙酸0.1～0.3mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂7.0g/L，pH 5.6～5.8；
3)、待块茎II上的丛生芽长至3～4cm时，将块茎II转入生根培养基中培养；
所述生根培养基为：MS培养基+吲哚丁酸0.2～0.4mg/L+α-萘乙酸0.1～0.2mg/L+活性碳0.3g/L+蔗糖25～35g/L+琼脂7.0g/L，pH 5.8～6.0；
所述步骤1)～步骤3)的培养条件均为：培养温度为25±4℃，光强1500lx～2000lx，光照时间12h/d；
4)、待整个水半夏植株高度为5～7cm，便可通过常规的室外炼苗获得可栽培的水半夏植株。
2.根据权利要求1所述的水半夏的组培快繁法，其特征是：步骤1)中块茎I在分化培养基上出芽的同时将生长变大，得到带芽头且培养变大的块茎I；将上述带芽头且培养变大的块茎I再次分切成新的块茎I，转入另一份分化培养基中培养；然后再进行步骤2)。
3.根据权利要求1或2所述的水半夏的组培快繁法，其特征是：
所述分化培养基为：MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH 5.6～5.8；
所述丛生芽培养基为：MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH 5.6～5.8；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+活性碳0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH 5.8～6.0。
4.根据权利要求3所述的水半夏的组培快繁法，其特征是所述步骤1)的消毒处理为：将 水半夏块茎经体积浓度75％的酒精浸泡0.5～1min，无菌水冲洗3～4次，再经质量浓度0.1％的氯化汞水溶液消毒处理10min，无菌水冲洗6～8次。
5.根据权利要求4所述的水半夏的组培快繁法，其特征是：培养温度为25±2℃。
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