CN101361458B - 一种甘蔗健康种苗高效繁育方法 - Google Patents
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Abstract
一种甘蔗健康种苗高效繁育方法，该方法针对甘蔗为无性繁殖作物，繁殖系数低，甘蔗种植用种量大，且经数年种植后，甘蔗易感病，导致种性退化、大量减产和品质下降等问题而提出，通过种苗温水脱毒处理、种苗催芽、外植体剥离接种、诱导培养、病毒检测、增殖培养、生根培养、驯化练苗和室外假植九项步骤培育出甘蔗良种健康种苗；本发明采用温水脱毒和茎尖脱毒相结合，脱毒彻底、效果好；外植体直接剥离接种，无需进行消毒处理，污染率低、褐化轻，容易诱导产生丛芽；繁殖系数高、速度快、周期短；种性稳定，苗壮；病毒检测精密准确；室外假植成活率高，达90％以上；生产成本低、效率高，适合工厂化生产。
Description
技术领域：
本发明涉及作物种子工程领域，尤其是一种甘蔗健康种苗高效繁育方法。
背景技术：
甘蔗是我国重要的糖料作物，甘蔗良种对蔗糖产业的贡献率在60％以上，甘蔗良种的迅速推广应用成为推动蔗糖产业发展的直接动力，甘蔗为无性繁育作物，繁殖速率慢，而生产上常规栽培用种量大，亩用种量高达8000-10000芽，而且甘蔗经数年种植后，易感花叶病、宿根矮化病等，造成甘蔗优良品种的种性退化，导致甘蔗减产、品质下降等不良影响。因此，研究利用甘蔗健康种苗作种，成为蔗糖产业可持续发展的可行途径。
发明内容：
本发明的目的是提供一种甘蔗健康种苗高效繁育方法，它能有效解决目前甘蔗良种推广应用过程中，繁殖系数低，推广慢及甘蔗良种种性易退化的问题。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明根据甘蔗种苗特性，将温水脱毒技术和组培茎尖脱毒技术有机结合，通过种苗温水脱毒处理、种苗催芽、外植体剥离接种、诱导培养、病毒检测、增殖培养、生根培养、驯化练苗和室外假植九个步骤培育出甘蔗良种健康种苗，主要技术如下：
①种苗温水脱毒处理：将甘蔗的中部芽砍为10～12cm的单芽，置于水温52℃的恒温水浴锅中，进行30min的温水脱毒处理；
②种苗催芽：将温水脱毒处理过的甘蔗芽，先用0.5％多菌灵浸泡5min，按5cm的间隔距离，依次摆放于底部有2～3cm厚粗沙的不锈钢托盘中，盖上2cm厚的粗沙，用MS培养基的无机成分溶液浇透，覆盖薄膜保水，然后置于温度35℃、光强为2000Lx的培养箱里，每天光照培养14h，进行催芽处理，处理过程中，间隔3天喷一次0.5％多菌灵杀菌，待蔗芽生长至15～18cm时，即可沿基部将芽取下备用；
③外植体剥离接种：将步骤②中培养获得的蔗芽，剥去外层老叶，用75％的酒精棉球进行表面消毒，放入超菌工作台上，直接剥离蔗芽茎尖生长点1～2mm接种；
④诱导培养：把步骤③中剥离获得的茎尖，接种培养于培养基成分为MS+0.5mg/L6-BA+3％Sugar+0.7％Agar+0.05％AC的培养瓶中，每一瓶接种一个茎尖。接种完成后，将接有外植体的培养瓶置于温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx的培养室内进行诱导培养；
⑤病毒检测：诱导培养获得丛芽后，目测弃出变异苗，再以每瓶中的一个芽丛为单位，每丛取0.5g叶片，提取蔗叶汁，应用电镜、ELISA检测甘蔗花叶病；应用PCR技术检测宿根矮化病，PCR检测引物为单引物组合，Lxx1：ACCCTGTGTTGTTTTCAACG/Lxx2：CCGAAGTGAGCAGATTGACC 或RSD33：CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC/RSD297：TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC，检测弃出病毒苗，获得健康植株，方可进行工厂化的增殖扩繁；
⑥增殖扩繁：在无菌条件下，将经过检测获得的健康植株，先转接于培养基MS+1mg/L6-BA+3％Sugar+0.02％AC中，进行适应培养一代后，再转接至培养基MS+2mg/L6-BA+3％Sugar+0.02％AC中培养，随后的增殖继代交替使用这两个培养基配方，培养条件与诱导培养条件相同，即培养温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx，15～20天继代一次，每代增殖达3～5倍；
⑦生根培养：将增殖培养到第7代的甘蔗丛芽，转接至生根培养基1/2MS+4.0mg/LNAA+2.5mg/LMET+2％Sugar+0.05％AC上，进行生根培养，培养条件与诱导培养条件相同，即培养温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx，培养20～25天，即可生根长成完整植株，生根率达98％；
⑧驯化练苗：假植移栽前，将长成完整植株的瓶盖和培养室的窗户一起打开，进行驯化练苗2～3天，开瓶练苗时间在早晨或傍晚进行；
⑨室外假植：甘蔗健康种苗的假植在防虫网室内进行，将驯化好的甘蔗瓶苗，剪去枯黄叶和叶尖，自来水漂洗干净，浸泡于0.1％的高锰酸钾溶液40s，按照6cm×8cm的株行距种植于沙床上，浇透水，搭建拱棚，盖膜并加盖遮荫网保持温度在26～38℃、保持湿度在60～80％，假植期间每隔2天喷淋一次0.5％多菌灵，连续喷淋3次，防治霉菌，假植8～10天，健康植株成活转绿，喷施0.1％的尿素，补充养分，并随着幼苗生长，将喷施浓度提高到0.2％；假植18～22天后，甘蔗健康植株抽出大量新叶，剪叶促壮；假植25天后，植株迅速生长，丛苗单株间相互竞争吸收营养，为使幼苗更充分的生长，将丛芽苗分为单株进行二期假植。按照此假植管理要求操作，甘蔗健康种苗的成活率高，达90％以上，且培育植株健壮。
本发明具有的有益效果如下：
本发明采用温水脱毒和茎尖脱毒相结合，脱毒彻底、效果好；外植体无需进行消毒，直接剥离接种，污染率低、褐化轻，容易诱导产生丛芽；繁殖系数高、速度快、周期短；种性稳定，苗健壮；病毒检测精密准确；室外假植成活率高，达90％以上；生产成本低、效率高、适合工厂化生产。该技术较适合甘蔗科研单位、蔗糖行政主管部门和生产企业推广使用。
具体实施方式：
本发明提供的甘蔗健康种苗高效繁育方法，需要具备一条组培生产线和与之相配套的育苗温室及恒温水浴锅、培养箱等简易设施，并严格按照上述发明内容部分提供的九项技术措施操作，即可培育出甘蔗良种的健康种苗，用于甘蔗优良品种推广。
Claims (1)
1.一种甘蔗健康种苗高效繁育方法，其特征在于：通过种苗温水脱毒处理、种苗催芽、外植体剥离接种、诱导培养、病毒检测、增殖培养、生根培养、驯化练苗和室外假植九个步骤培育出甘蔗良种健康种苗，
所述的种苗温水脱毒处理步骤是将甘蔗的中部芽砍为10～12cm的单芽，置于水温52℃的恒温水浴锅中，进行30min的温水脱毒处理；
所述的种苗催芽步骤是将温水脱毒处理过的甘蔗芽，先用0.5％多菌灵浸泡5min，按5cm的间隔距离，依次摆放于底部有2～3cm厚粗沙的不锈钢托盘中，盖上2cm厚的粗沙，用MS培养基的无机成分溶液浇透，覆盖薄膜保水，然后置于温度35℃、光强为2000Lx的培养箱里，每天光照培养14h，进行催芽处理，处理过程中，间隔3天喷一次0.5％多菌灵杀菌，待蔗芽生长至15～18cm时，即可沿基部将芽取下备用；
所述的外植体剥离接种步骤是将蔗芽剥去外层老叶，用浓度75％的酒精棉球消毒后，直接剥离蔗芽茎尖生长点1～2mm接种；
所述的诱导培养是将茎尖接种培养于培养基成分为MS+0.5mg/L6-BA+3％Sugar+0.7％Agar+0.05％AC的培养瓶中，每一瓶接种一个茎尖，接种完成后，将接有外植体的培养瓶置于温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx的培养室内进行诱导培养；
所述的病毒检测是将诱导培养获得的丛芽目测弃出变异苗，再以每瓶中的一个芽丛为单位，每丛取0.5g叶片，提取蔗叶汁，应用电镜或ELISA检测甘蔗花叶病；应用PCR技术检测宿根矮化病，PCR检测引物为单引物组合，Lxx1：ACCCTGTGTTGTTTTCAACG/Lxx2：CCGAAGTGAGCAGATTGACC或RSD33：CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC/RSD297：TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC，检测弃出病毒苗，获得可进行工厂化增殖扩繁的健康植株；
所述的增殖培养是将经过检测的健康植株，先转接于培养基为MS+1mg/L6-BA+3％Sugar+0.02％AC中，进行适应培养一代后，再转接至培养基MS+2mg/L6-BA+3％Sugar+0.02％AC中培养，随后的增殖继代交替使用这两个培养基配方，培养温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx；15～20天继代一次，每代增殖达3～5倍；
所述的生根培养是将增殖培养到第7代的甘蔗丛芽，转接至生根培养基1/2MS+4.0mg/LNAA+2.5mg/LMET+2％Sugar+0.05％AC上，在培养温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx条件下进行生根培养，培养20～25天，即可生根长成完整植株；
所述的驯化练苗是将长成完整的植株的瓶盖和培养室的窗户一起打开，驯化练苗2～3天，开瓶练苗时间在早晨或傍晚进行；
所述的室外假植是将驯化练苗后的甘蔗瓶苗，漂洗干净，浸泡于0.1％的高锰酸钾溶液40s，按照6cm×8cm的株行距种植于沙床上，浇透水，搭建拱棚，盖膜并加盖遮荫网保持温度在26～38℃、保持湿度在60～80％，假植期间每隔2天喷淋一次0.5％多菌灵，假植8～10天后，喷施0.1～0.2％的尿素；假植18～22天后，剪叶促壮；假植25天后，将丛芽苗分为单株进行二期假植。
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