CN102379243B - 甘蔗健康种苗的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
一种甘蔗健康种苗的快速繁殖方法，采用少量洗净的甘蔗成熟种茎，52℃温水脱毒处理30min，38℃催芽，以该腋芽为外植体诱导分化培养获得第一代健康种苗，经PCR检测宿根矮化病，以检测结果阴性的小苗材料，经多代增殖培养，获得大量健康甘蔗种苗，经一次性生根培养、炼苗、移栽沙床假植，抽样进行宿根矮化病PCR检测，证明甘蔗健康种苗合格后，移栽大田或推广种植。本发明可提高甘蔗健康种苗的生产效率，两次PCR检测可保证甘蔗健康种苗的脱毒效果，整个生产过程短，无需经过多级苗圃扩繁，直接将组培苗用于生产或推广应用，具有高效、品质优良、快速等特点，适合甘蔗健康种苗大规模的工厂化生产需要。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其是一种甘蔗健康种苗的组培快繁方法。
背景技术
甘蔗（Saccharum.ssp）是我国最重要的糖料作物，也是世界上最重要的能源植物。甘蔗优良新品种的迅速推广与应用已成为推动我国甘蔗蔗糖产业的新动力，然而，甘蔗宿根矮化病（Ratoon Stunting Disease,RSD）在我国主产蔗区造成了严重危害，导致我国部分品种种性退化，严重的影响到了甘蔗的品质与产量，给我国蔗糖产业带来了很大的损失。目前还没有一个当家品种或新品种能够很好的抗甘蔗宿根矮化病，所以最好的控制方法就是推广种植甘蔗健康种苗。
随着我国甘蔗产业的不断发展，对甘蔗健康种苗的需求量越来越大。而我国应用于生产的去宿根矮化病的方法一般有热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织培养脱毒等，但是都分别存在不同的问题：有的生产年限长，生产过程中可能存在二次感染，有的工作量大去除RSD不彻底，有的生产难度大变异多等。因此，对目前现有的方法进行改进或将目前现有的方法综合改良是很有必要的，同时也将为更好的利用甘蔗健康种苗作种，推广应用于生产为蔗糖产业的可持续发展开辟一条可行高效的途径。
发明内容
本发明的目的是提出一种甘蔗健康种苗的组培快繁殖方法，以克服上述现有技术存在的不足。目前本发明的相关技术还未见报道。
一种甘蔗健康种苗的快速繁殖方法，其特征在于：采用少量洗净的甘蔗成熟种茎，经52℃温水脱毒处理30min，38℃恒温恒湿箱催芽，以发出的腋芽为外植体材料诱导分化培养获得第一代健康种苗；经PCR检测技术对诱导分化出的成苗进行宿根矮化病RSD检测；以检测结果阴性的成苗为材料，经多代增殖培养，获得大量健康甘蔗种苗，经一次性生根培养、炼苗、移栽沙床假植，抽样经PCR 检测技术进行宿根矮化病RSD检测，证明甘蔗健康种苗合格（感染RSD为0）后，移栽大田或推广种植。具体包括如下步骤：
1）甘蔗材料的选择与处理：取成熟的甘蔗茎，切成两个芽的茎段，在清水中刷洗外表面去除表面附着的病虫害残留物或泥土等污物。用体积浓度2%的石灰水浸种30min，于52℃恒温水浴锅中浸泡30min，种植于5.5-6cm厚的甘蔗渣基质中，于38℃恒温恒湿培养箱中培养5-6天，待腋芽出土后即可。
2）腋芽的选择与处理：取5-6cm高的腋芽，在无菌条件下灭菌处理后，作为外植体材料。
3）腋芽诱导培养：将外植体材料接种于分化培养基中，20天换一次培养基，更换2-3次培养基即可分化出第一代的甘蔗小苗；所述培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5 mg/L +蔗糖30g/L。
4）病毒的检测：利用PCR检测技术对步骤3）中分化出的外植体小苗进行RSD检测。
5）增殖培养：将步骤4）检测合格的全部成苗接入增殖培养基中，进行增殖培养获得分化丛苗，15天接一次培养基，可根据需苗量更换培养基3-5次，增殖至所需的苗量。
6）生根培养：将步骤5）中的分化丛苗切成单株接在生根培养基中进行生根培养，生根培养基中添加香蕉，培养瓶改成透明的培养袋，培养19-21天得到袋苗。
7）甘蔗袋苗的炼苗：将步骤6）中的全部袋苗移出无菌培养室，放置于沙床上炼苗一周。
8）甘蔗袋苗移栽沙床：将步骤7）中袋苗洗干净，用0.5%多菌灵浸泡10min，栽种于沙床上，盖薄膜4－6天，夏天加盖荫网，小苗种植40天以上即可移栽大田。
9）病毒的抽样检测及推广应用：与步骤4）的方法相同，抽取一定量的样本进行RSD检测，确定小苗的脱毒效果合格后，可以移栽大田或进行推广应用。
本发明具有如下突出的实质性特点和显著进步：
1）本发明以经过温水处理的脱毒种茎催芽获得小量甘蔗腋芽为外植体，获得的种苗变异率低。
本发明采用的培养基配方经多次实验证明能最大的提高甘蔗小苗增殖效率，在生根壮苗方面也有优良的效果，适合用于工厂化规模化的生产。
2）经过两次PCR检测RSD病毒确保健康种苗的脱毒质量。
3）本发明是用0.5%多菌灵浸泡甘蔗小苗10min后，栽种于沙床上，盖薄膜4－6天，加盖荫网，大大提高了组培甘蔗健康种苗的成活率。应用袋苗生根，是工厂化生产中必然的选择，既降低了成本，又方便操作。同时本发明所生产的甘蔗健康种苗经实验证明具有明显的增产、增糖、提高宿根性的效果。
经过温水处理的脱毒种茎催芽获得小量腋芽，经组培快繁获得大量甘蔗健康种苗，其优点在于脱毒效果优良，种苗健壮，变异少，操作简单，高效快速，成本低廉。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但本发明内容不限于所述范围。
实施例一
甘蔗健康种苗的快速繁殖方法，按照如下步骤实施：
1）甘蔗材料的选择与处理：以甘蔗良种云蔗06－407为材料，于1月份取成熟的甘蔗茎，切成两个芽的茎段，在清水中刷洗外表面去除表面附着的病虫害残留物或泥土等污物。用浓度2%石灰水浸种30min，于52℃恒温水浴锅中浸泡30min，种植于5.5-6cm厚的甘蔗渣基质中，于38℃恒温恒湿培养箱中培养5-6天，待腋芽出土后就可。
2）腋芽的选择与处理：取5-6cm高的腋芽，在无菌条件下灭菌处理后，作为外植体。
3）腋芽诱导培养：将外植体接种于分化培养基中，20天换一次培养基，所述的分化培养基配方为：MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5 mg/L +蔗糖30g/L。
4）病毒的检测：利用PCR检测技术对步骤3）中分化出的成苗进行RSD检测 。
5）增殖培养：将步骤4）中检测合格（RSD感染数为0）的全部成苗接入增殖培养基中，进行增殖培养，所述的增殖培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+KT 0.5 mg/L +蔗糖30g/L+卡拉胶8 g/L。15天接一次培养基，增殖至所需的量。
6）生根培养：将步骤5）中的分化丛苗切成单株接在生根培养基中进行生根培养，生根培养基中添加香蕉，培养瓶改成透明的培养袋，培养约20天，生根培养基配方为MS+NAA 1 mg/L +蔗糖30g/L+卡拉胶8 g/L+香蕉80 g/L。
7）甘蔗袋苗的炼苗：将步骤6）中的全部袋苗移出无菌培养室，放置于沙床上炼苗一周。
8）甘蔗袋苗移栽沙床：将步骤7）中袋苗洗干净，用0.5%多菌灵浸泡10min，栽种于沙床上，盖薄膜4－6天，夏天加盖荫网，小苗种植40天以上即可移栽大田。
9）病毒的抽样检测及推广应用：与步骤4）的方法相同，抽取一定量的样本进行RSD检测，确定小苗的脱毒效果合格后，可以移栽大田或进行推广应用。
实施例二
甘蔗健康种苗的快速繁殖方法，按照如下步骤实施：
1）甘蔗材料的选择与处理：以甘蔗良种云蔗05－51为材料，于1月份取成熟的甘蔗茎，切成两个芽的茎段，在清水中刷洗外表面去除表面附着的病虫害残留物或泥土等污物。用2%石灰水浸种30min，于52℃恒温水浴锅中浸泡30min，种植于约6cm厚的甘蔗渣基质中，于38℃恒温恒湿培养箱中培养5-6天，待芽出土后就可。
2）腋芽的选择与处理：取5-6cm高的腋芽，在无菌条件下灭菌处理后，作为外植体。
3）腋芽诱导培养：将外植体接种于分化培养基：MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5 mg/L +蔗糖30g/L的培养基中 20天换一次培养基。
4）病毒的检测：利用PCR检测技术对步骤3）中分化出的成苗进行RSD检测 。
5）增殖培养：将步骤4）中检测合格（RSD感染数为0）的全部成苗接入增殖培养基中，进行增殖培养，增殖培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+KT 0.5 mg/L +蔗糖30g/L+卡拉胶8 g/L。15天接一次培养基，增殖至所需的量。
6）生根培养：将步骤5）中的分化丛苗切成单株接在生根培养基中进行生根培养，生根培养基中添加香蕉，培养瓶改成透明的培养袋，培养约20天，生根培养基配方为MS+NAA 1 mg/L +蔗糖30g/L+卡拉胶8 g/L+香蕉80 g/L。
7）甘蔗袋苗的炼苗：将步骤6）中的全部袋苗移出无菌培养室，放置于沙床上炼苗一周。
8）甘蔗袋苗移栽沙床：将步骤7）中袋苗洗干净，用0.5%多菌灵浸泡10min，栽种于沙床上，盖薄膜4－6天，夏天加盖荫网，小苗种植40天以上即可移栽大田。
9）病毒的抽样检测及推广应用：与步骤4）的方法相同，抽取一定量的样本进行RSD检测，确定小苗的脱毒效果合格后，可以移栽大田或进行推广应用。
Claims (1)
1.一种甘蔗健康种苗的组培快繁方法，其特征在于步骤如下：
（1）取成熟的甘蔗茎，用体积浓度2%的石灰水浸种30min，于52℃恒温水浴锅中浸泡30min，种植于5.5-6.5cm厚的甘蔗渣基质中，于38℃恒温恒湿培养箱中培养5-6天，待腋芽出土后即可；
（2）取5-6cm高的腋芽，在无菌条件下灭菌处理后，作为外植体材料；
（3）将外植体材料接种于分化培养基中，20天换一次培养基，更换2-3次培养基即可分化出第一代的甘蔗小苗；
（4）利用PCR检测技术对步骤（3）中分化出的外植体小苗进行宿根矮化病RSD检测；
（5）将步骤（4）检测合格的全部成苗接入增殖培养基中，进行增殖培养获得分化丛苗，15天接一次培养基，根据需苗量更换培养基3-5次，增殖至所需的苗量；
（6）将步骤（5）中的分化丛苗切成单株接在生根培养基中进行生根培养，生根培养基中添加香蕉，培养瓶改成透明的培养袋，培养19-21天得到袋苗；
（7）将步骤（6）中的袋苗移出无菌培养室，放置于沙床上炼苗一周；
（8）将步骤（7）中的袋苗洗干净，用0.5%多菌灵浸泡10min，栽种于沙床上，盖薄膜4－6天，夏天加盖荫网，小苗种植至少40天，抽取一定量的样本进行宿根矮化病RSD检测，确定小苗的脱毒效果合格后，移栽大田或进行推广应用；
所述分化培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5 mg/L +蔗糖30g/L；
所述增殖培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+KT 0.5 mg/L +蔗糖30g/L+卡拉胶8 g/L；
所述生根培养基配方为MS+NAA 1 mg/L +蔗糖30g/L+卡拉胶8 g/L+香蕉80 g/L。
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