CN102090340B

CN102090340B - 一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法

Info

Publication number: CN102090340B
Application number: CN 201010599664
Authority: CN
Inventors: 谭嘉娜; 陈月桂; 李奇伟; 杨俊贤; 吴文龙; 潘方胤
Original assignee: ZHANJIANG SUGARCANE RESEARCH CENTER OF GUANGZHOU SUGARCANE SUGAR INDUSTRY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: ZHANJIANG SUGARCANE RESEARCH CENTER OF GUANGZHOU SUGARCANE SUGAR INDUSTRY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2030-12-22
Also published as: CN102090340A

Abstract

本发明涉及一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法，属植物脱毒快繁技术领域，包括如下步骤：将甘蔗的顶芽部分和截成的双芽茎段，经过消毒预处理后，采取糖蔗的顶芽和腋芽的茎尖组织为外植体，利用滤纸桥的培养方式，经茎尖启动培养、嫩芽分化培养、丛芽壮苗培养、植株生根培养、病毒检测后，最终获得大量繁殖的脱毒组培苗；本发明的优点是：以1~2mm的茎尖为外植体，处理操作容易；启动培养采用滤纸桥培养方式，启动速度快、宿根矮化病毒脱除效果彻底；该茎尖经诱导萌发、快速启动并分化大量的丛芽，月繁殖系数达5~8，在长期繁殖过程中形态正常，完全适合大规模的工厂化生产。

Description

一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法

技术领域

本发明涉及一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法，尤其涉及一种糖蔗通过组织培养方式进行茎尖脱毒快繁的方法，属于植物脱毒培养快繁技术领域。

背景技术

甘蔗宿根矮化病（Ratoon stuning disease，RSD）于1944～1945年首次在澳大利亚昆士兰州甘蔗品种Q28上发现，如今在中国主产蔗区及世界各地蔗区广泛发生，导致种性衰退，严重影响品质，很大程度上缩短了优良品种的经济使用年限。

甘蔗宿根矮化病是由（Clavibacter xyli subsp.Xyli，Lxx）引起的，RSD蔗株平均感染率50%左右，通常造成甘蔗减产12~37%，在干旱情况下减产高达60%，蔗糖分降低0.5%（绝对值），是甘蔗重要的病害之一，其病原为棒状杆菌属细菌，寄生于蔗株的维管束中，受害的甘蔗发育阻滞，宿根发株少，生长不良，叶缘枯死，严重影响甘蔗产量和品质。防止或者控制该病害的发生对甘蔗产业的稳健发展十分重要，甘蔗健康种苗在甘蔗生产上的应用显得尤为重要。

RSD主要通过收获机械和带病蔗种传播，对于RSD的传播的控制，目前国内外有一些行之有效的方法，其中广泛使用的方法是温汤处理，即下种前用50℃热水浸种2h，该方法简单有效，但是有些品种的腋芽对温度敏感，温汤处理后引起出苗率下降，且人力物力消耗较大，所以采用无病毒健康的植株成为人们研究的一个方向。

迄今为止，获得无病毒植株的方法有多种，例如热处理脱毒、愈伤组织培养脱毒、茎尖微嫁接脱毒以及组合方法。利用甘蔗顶芽和腋芽的茎尖愈伤组织途径获得脱毒苗的专利仅见报道CN101138321A；而其中普遍采用的较好方法为微茎尖培养脱毒法，其中具体步骤是：采取植物顶端分生组织，于显微镜下切取微茎尖（0.2mm以下分生组织），诱导其萌发，分化成小植株获得脱毒苗。该方面已经有CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A等专利公开了相关技术方法，均披露了采用微茎尖作为外植体，通过微小的茎尖培养途径得到脱毒苗的方法。但是上述途径存在的问题是：①愈伤组织途径：虽然短期内通过愈伤组织可获得大量的组培苗，但其存在易变异的弱点；②微茎尖途径：首先要切取大小为0.2mm以下的茎尖分生组织，此项需在显微镜下操作，具有一定难度，并且这种微小的茎尖分生组织成活率非常低，一定程度上存在着人力物力的浪费。

综上所述，鉴于甘蔗脱毒苗是目前国际上防治宿根矮化病最为有效的途径，因此，生产上迫切需要一种更好的方法来解决糖蔗种苗组培脱毒快繁的技术应用问题。

发明内容

本发明目的是针对上述微茎尖分生组织脱毒法存在的操作难度大、成活率低等缺陷，提出一种经过消毒的预处理后，以切取较大的糖蔗顶芽和腋芽的茎尖为外植体，先诱导其萌发，再分化形成完整植株的方法，以便能够在短期内，更为有效的获得大量的脱毒苗。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法，按如下步骤进行：

1.培养基的配制，包括培养基的基本成分与不同培养阶段的培养基各组分及其含量为：

基本培养基：MS培养基和蔗糖25~35g/L， PH值为5.8~6.2；

茎尖诱导培养基：MS培养基、吲哚丁酸IBA0.01~0.03mg/L和活性炭0.8~1.2g/L；

分化培养基：MS培养基、6-苄氨基嘌呤6-BA0.1~0.8mg/L和吲哚丁酸IBA0.01~0.03mg/L；

壮苗培养基：MS、蛋白胨0.1~0.3 g/L 和酵母0.1~0.3 g/L；

生根培养基：MS培养基、吲哚丁酸IBA0.1~0.3mg/L、萘乙酸NAA0.1~0.3mg/L和蔗糖40~60g/L；

2.外植体预处理：将糖蔗的顶芽和按照双芽截成的茎段→用75%酒精和新洁尔灭预处理→经50~55℃热水处理25~35分钟后→置于人工气候箱内高温催芽（35~40℃，培养1周），或置于温室细河沙培养1周后，作为所用的外植体；

3.茎尖诱导：将上述经过预处理后的顶芽和萌发的腋芽在无菌条件下摘取1~2mm的茎尖组织，接种在茎尖诱导培养基上，诱导其萌发芽点。

4.分化培养：将步骤3萌发的芽接种在分化培养基上，分化出大量的丛芽；

5.壮苗培养：将步骤4分化出的丛芽置于壮苗培养基上，培养一个周期，获得健壮的丛芽；

6.生根培养：将步骤5经过壮苗的丛芽接种在生根培养基中进行生根培养；

7.移栽：当步骤6的生根苗长至3~5cm，根数5条以上时，进行假植，移栽于室外培养至成苗。

8.病毒检测：利用PCR技术检测。

所述的培养基进一步可改进为，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分及其含量为：

（1）基本培养基：MS培养基，蔗糖30g/L， PH值为5.8~6.2；

（2）茎尖诱导培养基：MS+IBA0.02mg/L+活性炭1.0g/L（采用滤纸桥培养方式）；

（3）分化培养基：MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.02mg/L；

（4）壮苗培养基：MS+蛋白胨0.1 g/L +酵母0.1 g/L

（5）生根培养基：MS+IBA0.2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖50g/L；

所述的灭菌处理是将外植体经75%酒精浸泡0.5~1.0min，再用0.1%升汞溶液灭菌3~5min，最后用无菌水冲洗3~5次。初次假植采用细河沙培养；成活率达95%以上。

本发明的有益效果：

（1）本发明以经过消毒预处理后糖蔗顶芽和腋芽的茎尖为外植体，培养时，取材的体积较大（1~2mm），接种操作容易，成活率高达95%以上；而之前用于脱毒培养的微茎尖组织体积很小（0.2~0.3mm），其成活率只有5~10%。

（2）本发明脱毒简便、快捷，利用1~2mm长的茎尖容易诱导其萌发并分化出大量的丛芽，解决了以往通过愈伤组织途径容易导致后代出现变异和微茎尖操作难、成活率低等问题。利用ELISA病毒检测技术，证明该方法获得的组培苗带毒率为0，获得了100%的脱毒种苗。据目前的情况，采用该方法很好的解决了甘蔗品种因病毒病害导致的种质退化问题，提高糖蔗产品的产量和品质。

（3）本发明以1~2mm的顶芽和腋芽的茎尖为外植体，诱导萌发芽，经分化形成大量的丛芽，月繁殖系数达5~8，在繁殖过程中形态正常，完全适合大规模的工厂化生产。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

（以糖蔗顶芽的茎尖为外植体）

（1）外植体的选取与灭菌：于4~5月份期间，取糖蔗的顶芽，剥去外面较老的苞片，经52℃热水处理30分钟后，用75%酒精浸泡0.5~1.0min，再用0.1%升汞处理4min后，无菌水冲洗3~5次；

（2）基本培养基：用MS培养基，蔗糖30g/L， PH值为5.8~6.2；

（3）启动培养：将步骤（1）处理后的顶芽在无菌条件下，小心去除叶鞘，摘取1~2mm的茎尖，接种在MS+IBA0.02mg/L+活性炭1.0g/L的滤纸桥培养液上，诱导萌发芽；

（4）分化培养：将步骤（3）诱导形成的芽移至分化培养基上诱导出丛芽，分化培养基为：MS培养基、6-BA0.5mg/L和IBA0.02mg/L；

（5）壮苗培养：将步骤（4）分化形成的丛芽切成2~3株接种在壮苗培养基中，进行壮苗培养，壮苗培养基为：MS培养基、蛋白胨0.1 g/L 和酵母0.1 g/L；

（6）生根培养：将步骤（5）形成的丛芽接种在生根培养基中进行生根培养，生根培养基为：MS培养基、IBA0.2mg/L、NAA0.2mg/L和蔗糖50g/L；

（7）移栽：待生根苗长至3~5cm，植株根数5条以上时，进行假植。其中，初次假植采用细河沙培养；

（8）病毒检测：利用PCR扩增技术。

实施例2

（以糖蔗腋芽的茎尖为外植体）

（1）外植体的选取与灭菌：于7~10月，将糖蔗按照双芽截成的茎段→用75%酒精和新洁尔灭预处理→经52℃热水处理30分钟后→置于人工气候箱内高温催芽（38℃，培养1周），或置于温室细河沙培养1周后，采取萌发的腋芽，剥去较老的苞片，用 75%酒精浸泡0.5~1.0min，再用0.1%升汞处理3min后，无菌水冲洗3~5次；

（2）基本培养基：用MS培养基，蔗糖30g/L， PH值为5.8~6.2；

（3）启动培养：将步骤（1）处理后的腋芽在无菌条件下，小心去除叶鞘，摘取1~2mm的茎尖，接种在MS+IBA0.02mg/L+活性炭1.0g/L的滤纸桥培养液上，诱导萌发芽；

（8）病毒检测：利用PCR扩增技术。

实施例3

试验例（病毒检测）

对照材料：从田间采集的甘蔗病叶、蔗茎、蔗根为材料。

处理材料：以实施例1与实施例2获得的组培苗为材料。

检测结果如下表所示：

处理	检测的结果
		对照	阳性
脱毒组培苗	阴性

Claims

1. 一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)外植体预处理：将糖蔗截成双芽茎段，用75％酒精擦拭干净，新洁尔灭浸泡2-3分钟后，经50～55℃热水处理25～35分钟后置于基本培养基中于人工气候箱内高温催芽，或置于温室细河沙培养l周后，作为所用的外植体，所述的高温催芽的温度为35～40℃；

(2)外植体采集：将上述经过预处理后萌发的茎尖顶芽在无菌条件下摘取1～2mm的茎尖组织，利用滤纸桥的培养方式，接种在茎尖诱导培养基上，诱导其萌发芽点；

(3)分化培养：将步骤(2)萌发的芽接种在分化培养基上，分化出大量的丛芽；

(4)壮苗培养：将步骤(3)分化出的丛芽置于壮苗培养基上，培养一个周期，获得健壮的丛芽；

(5)生根培养：将步骤(4)经过壮苗的丛芽切成单株接种在生根培养基中进行生根培养；

(6)移栽：当步骤(5)的生根苗长至3～5cm，根数5条以上时，移栽到室外；

所述的基本培养基各组分及其含量为：

基本培养基：MS培养基和蔗糖25～35g/L， PH值为5.8～6.2；

所述的茎尖诱导培养基各组分及其含量为：

茎尖诱导培养基：MS培养基、吲哚丁酸IBA0.01～0.03mg/L和活性炭0.8～1.2g/L；

所述的分化培养基各组分及其含量为：

分化培养基：MS培养基、6-苄氨基嘌呤6-BA0.1～0.8mg/L和吲哚丁酸IBA0.01～0.03mg/L；

所述的壮苗培养基各组分及其含量为：

壮苗培养基：MS培养基、蛋白胨0.1～0.3g/L和酵母0.1～0.3g/L；

所述的生根培养基各组分及其含量为：

生根培养基：MS培养基、吲哚丁酸IBA0.1～0.3mg/L、萘乙酸NAA0.1～0．3mg/L和蔗糖40～60g/L。

2.根据权利要求l所述的糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法，其特征在于：步骤(2)茎尖诱导培养方式为液体滤纸桥培养。

3.根据权利要求l或2所述的糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法，其特征在于：

所述的高温催芽的培养周期为1周。