CN103081808A

CN103081808A - 一种采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法

Info

Publication number: CN103081808A
Application number: CN2013100525217A
Authority: CN
Inventors: 何为中; 刘红坚; 范业赓; 翁梦苓; 陈忠良; 李松; 莫磊兴; 游建华
Original assignee: Sugarcane Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Sugarcane Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-02-18
Filing date: 2013-02-18
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明涉及植物组培快繁技术领域，更具体地说是涉及一种采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法。其生产步骤包括无菌甘蔗丛生芽的制备、增殖扩繁和无根试管苗的苗圃生根栽培，所述步骤增殖扩繁共进行8～10个增殖培养周期的培养。本发明的技术要点是在步骤增殖扩繁的最后一个增殖培养周期采用增殖培养基MS+6-BA0.1～0.5mg/L+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L培养处理。上述方法克服了现有甘蔗瓶外生根技术中试管苗增殖系数低和试管苗素质低，以及试管苗苗圃生根栽培时生长速度慢等不足，是一种更加高效、低成本的甘蔗组培快繁生产方法，经济效益显著，与传统甘蔗组培快繁技术比优势明显。

Description

一种采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法

技术领域

本发明涉及植物组培快繁技术领域，更具体地说是涉及一种采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法。

背景技术

甘蔗病害严重危害着糖蔗行业的生产与发展，它不仅导致甘蔗产量和品质下降，而且是导致甘蔗良种退化的重要因素。甘蔗病害主要有：宿根矮化病、花叶病、凤梨病、眼斑病、黄斑病、鞭黑穗病、赤腐病等，其中宿根矮化病、花叶病是目前甘蔗生产上传统防治方法难以控制或去除的病害。巴西李增生（Lee T.S.G.）博士报道，健康甘蔗良种在种植5年后都会100％感染宿根矮化病，且干旱蔗区更加严重；邓展云等也报道，甘蔗宿根矮化病是一种世界甘蔗生产国普遍发生的病害，它一般会导致甘蔗节间变短、植株变矮、产量和糖分下降，产量下降幅度达12～37％。甘蔗花叶病的症状主要表现在叶片上，但被染病植株可使整丛发病，最后遍及全株，此病造成的损失主要是蔗种染病后，萌芽率低，分蘖减少，汁液量减少，蔗株矮化，经济效益大打折扣。甘蔗宿根矮化病、花叶病等病害虽然对甘蔗生产影响很大，但防治手段极为有限，目前国内外普遍采用的方法之一是利用茎尖组织培养方法生产脱毒健康种苗，其可提高15％以上的增产幅度。由于健康种苗生产环节多及各环节对环境条件要求高，造成种苗生产成本一直居高不下，制约了甘蔗健康种苗的大范围推广种植。因此简化甘蔗试管苗培养程序，降低生产成本，是解决制约甘蔗健康种苗大规模生产推广最有效的途径。

试管苗瓶外生根技术是近几年研究成功的一项先进的组培生根技术，该技术的主要特征是将植物组织培养过程中未进入生根培养的继代增殖苗进行培养处理后，在有菌和自养环境中进行移植生根，其主要特点是将试管苗的生根阶段中的生根和驯化结合起来，省去了试管苗瓶内生根的传统程序。该技术的应用不仅减少了一次无菌操作步骤，节约了培养室空间，又简化了健康种苗生产程序，降低了生产成本，提高了生产效率。有研究证实，试管苗瓶外生根可使试管苗的生产成本降低35～75%。随着组培工厂化育苗的发展，国内外对满天星、罗汉果、栀子、金线莲等一大批植物试管苗瓶外生根技术进行了研究，并获得了成功。目前，对甘蔗试管苗瓶外生根技术研究报道仅见广西壮族自治区甘蔗研究所的科研成果，该研究所就甘蔗试管苗瓶外生根方法申请了一项国家发明专利（专利名称：甘蔗试管苗的瓶外生根方法，专利号：ZL201010227883.1），已授权。该专利技术公开了一种适用于规模化生产的甘蔗试管苗瓶外生根方法，达到简化甘蔗试管苗生产程序、降低生产成本的目的，是一项可行的专利技术。该专利可行的关键技术要点是在无根试管苗的苗圃生根栽培阶段前的一个增殖培养周期（即增殖扩繁阶段的最后一个增殖培养周期）采用增殖培养基MS+GA₃1～3mg/L+蔗糖30g/L培养处理，但其同时也存在着一些不足，如甘蔗试管苗增殖效果远低于常规增殖培养基培养时的增殖效果，且试管苗素质低，以及试管苗苗圃生根栽培时生长速度慢而导致苗圃栽培时间过长等，经济效益不显著，与传统甘蔗组培快繁技术比优势不明显。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，可有效提高甘蔗试管苗的增值系数和试管苗素质，并加快试管苗苗圃生根栽培时的生长速度，减少苗圃栽培时间，是一种更加高效、低成本的甘蔗组培快繁生产方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其步骤包括无菌甘蔗丛生芽的制备、增殖扩繁和无根试管苗苗圃生根栽培，所述步骤增殖扩繁共进行8～10个增殖培养周期的培养，其关键在于无根试管苗的苗圃生根栽培阶段前的一个增殖培养周期（即增殖扩繁阶段的最后一个增殖培养周期）采用增殖培养基MS+6-BA0.1～0.5mg/L+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L培养处理。

以上所述中，MS为植物组织培养使用最普遍的一种培养基名称，主要成分为植物生长所需多种化学物质，足以满足植物在营养上和生理上的需求，其配方公开使用；6-BA是一种细胞分裂素，化学名称为6-苄氨基腺嘌呤；GA₃又叫赤霉素，是一种植物生长调节剂。所述的MS培养基、B-BA、GA₃均可在市场上购买到。

作为本发明进一步说明，所述无菌甘蔗丛生芽的制备包括两种途径，第一种途径是将经脱毒处理和灭菌处理的甘蔗幼嫩心叶通过诱导培养和分化培养得到的无菌甘蔗丛生芽，备用；第二种途径是将经脱毒处理和灭菌处理的甘蔗茎尖或腋芽分化培养得到的无菌甘蔗丛生芽，备用。

诱导培养是采用诱导培养基MS+2，4-D2.5～3mg/L+蔗糖30g/L于培养室内25～30℃培养20～30天，诱导形成愈伤组织。

分化培养是采用分化培养基MS+6-BA0.5～1mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+蔗糖30g/L于培养室内25～30℃培养30～60天，分化长成无菌甘蔗丛生芽。

其中，脱毒处理和灭菌处理为常规处理方法，例如：热处理脱毒方法和酒精浸泡灭菌方法，均为本领域技术人员所熟知的现有技术。

2，4-D为一种植物生长素，化学名称为2,4-二氯苯氧乙酸，可在市场上购买到。

作为本发明进一步说明，所述增殖扩繁是采用无菌甘蔗丛生芽进行增殖继代培养，一般来讲，共进行8～10个增殖培养周期的培养，每个周期时长为13～16天。增殖培养时，一般均采用常规增殖培养基MS+6-BA1～2mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L培养，在进行增殖培养的最后一个增殖培养周期时，改用增殖培养基MS+6-BA0.1～0.5mg/L+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L培养处理。待准备转入育苗盆进行苗圃生根栽培时需要对甘蔗试管苗进行炼苗，即将甘蔗试管苗整瓶从培养室转移至普通室内，在自然环境条件下开瓶盖存放3～5天，即得到无根试管苗。

其中，NAA是一种广谱型植物生长调节剂，化学名称为萘乙酸，可在市场上购买到。

作为本发明进一步说明，甘蔗试管苗炼苗过后，将其分成单株或小丛苗（＜3株）穴植于育苗盆中，并转入控温控湿育苗棚中进行苗圃生根栽培管理，控制培养条件温度在20～35℃，湿度在80～100%，光照强度在3000～6000lx；移植15～20天后，甘蔗苗已完成生根，并长出新叶，继续让甘蔗苗在自然光照、温湿度下生长20～40天，即可移植至大田里栽种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明在现有技术基础上，通过探讨不同外源激素对甘蔗无根试管苗瓶外生根的影响，不断优化关键增殖培养基的配方，并在试验中总结得出，增殖培养基中混合使用6-BA与GA₃达到的增殖效果优于单独使用GA₃的增殖培养基，其增值效果可达到与常规增殖培养基相当的水平；同时该培养基增殖培养生产的无根试管苗长得粗壮，叶大、嫩绿，素质高；且在进行苗圃生根栽培时，甘蔗苗的存活率和生长速度均高于单独使用GA₃的培养处理方法。因此，本发明技术为一种更加高效、低成本的甘蔗组培快繁生产方法，适用于规模化生产。

具体实施方式

通过以下具体实施例，可以进一步了解本发明，但以下实施例不用来限定本发明的保护范围。

实施例1

采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法具体按以下步骤进行：

1、无菌甘蔗丛生芽的制备

将经过脱毒处理和灭菌处理的甘蔗幼嫩新叶接种于诱导培养基MS+2，4-D2.5mg/L+蔗糖30g/L中于培养室内25～30℃培养25天，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织转入分化培养基MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L中于培养室内25～30℃培养30天，即可获得脱毒的无菌甘蔗丛生芽。

2、增殖扩繁

将步骤1的无菌甘蔗丛生芽接种于继代增殖培养基中培养，继续分化出丛生芽，共进行8个增殖培养周期的培养，每个周期时长为13～16天。前7个增殖培养周期采用常规增殖培养基MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L培养，第8个增殖培养周期改用增殖培养基MS+6-BA0.3mg/L+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L培养处理。待准备转入育苗盆进行苗圃生根栽培时，将甘蔗试管苗整瓶从培养室转移至普通室内，在自然环境条件下开瓶盖存放5天，即得到无根试管苗。

3、无根试管苗的苗圃生根栽培

甘蔗试管苗炼苗过后，将其分成单株穴植于育苗盆中，并转入控温控湿育苗棚中进行苗圃生根栽培管理，控制培养条件温度在20～25℃，湿度在80%，光照强度在3000～4000lx。移植17天后，继续让甘蔗苗在自然光照、温湿度下生长40天，即可移植至大田里栽种。

实施例2

1、无菌甘蔗丛生芽的制备

将经过脱毒处理和灭菌处理的甘蔗茎尖接种于分化培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L中于培养室内25～30℃培养60天，即可获得脱毒的无菌甘蔗丛生芽。

2、增殖扩繁

将步骤1的无菌甘蔗丛生芽切成单株接种于继代增殖培养基中培养，继续分化出丛生芽，共进行9个增殖培养周期的培养，每个周期时长为13～16天。前8个增殖培养周期采用常规增殖培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L培养，第9增殖个培养周期改用增殖培养基MS+6-BA0.2mg/L+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L培养处理。待准备转入育苗盆进行苗圃生根栽培时，将甘蔗试管苗整瓶从培养室转移至普通室内，在自然环境条件下开瓶盖存放3天，即得到无根试管苗。

3、无根试管苗的苗圃生根栽培

甘蔗试管苗炼苗过后，将其分成单株穴植于育苗盆中，并转入控温控湿育苗棚中进行苗圃生根栽培管理，控制培养条件温度在25～30℃，湿度在90%，光照强度在4000～5000lx。移植20天后，继续让甘蔗苗在自然光照、温湿度下生长20天，即可移植至大田里栽种。

实施例3

1、无菌甘蔗丛生芽的制备

将经过脱毒处理和灭菌处理的甘蔗腋芽接种于分化培养基MS+6-BA1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L中于培养室内25～30℃培养50天，即可获得脱毒的无菌甘蔗丛生芽。

2、增殖扩繁

将步骤1的无菌甘蔗丛生芽切成单株接种于继代增殖培养基中培养，继续分化出丛生芽，共进行10个增殖培养周期的培养，每个周期时长为13～16天。前9增殖个培养周期采用常规增殖培养基MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L培养，第10增殖个培养周期改用增殖培养基MS+6-BA0.4mg/L+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L培养处理。待准备转入育苗盆进行苗圃生根栽培时，将甘蔗试管苗整瓶从培养室转移至普通室内，在自然环境条件下开瓶盖存放4天，即得到无根试管苗。

3、无根试管苗的苗圃生根栽培

甘蔗试管苗炼苗过后，将其分成小丛苗（2株）穴植于育苗盆中，并转入控温控湿育苗棚中进行苗圃生根栽培管理，控制培养条件温度在30～35℃，湿度在100%，光照强度在5000～6000lx。移植15天后，继续让甘蔗苗在自然光照、温湿度下继续30天，即可移植至大田里栽种。

试验例

本发明人是广西科学基金“甘蔗试管苗瓶外生根技术研究”项目（桂科回0991012）和广西科学研究与技术开发计划项目“甘蔗试管苗生产简化技术的研究与开发”课题（2007BAD30B04）的主持人，并就甘蔗试管苗瓶外生根技术申请了一项国家发明专利（专利名称：甘蔗试管苗的瓶外生根方法，专利号：ZL201010227883.1），已获得国家知识产权局授权。该专利申请报告递交后，本发明人继续深化甘蔗无根试管苗的苗圃生根栽培技术研究工作，开展了植物外源激素6-BA和GA₃处理对甘蔗无根试管苗增殖效果及苗圃生根栽培时存活率和生长速度的影响。

1、试验材料

以处于增殖继代培养阶段的新台糖22号无根试管苗为试验材料，由广西壮族自治区甘蔗研究所生物室提供。

2、试验方法

（1）不同增殖培养基对甘蔗无根试管苗增殖效果的影响

试验材料甘蔗无根试管苗分别在MS+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L（对照培养基I）、常规增殖培养基（对照培养基II）和MS+6-BA0.1～0.5mg/L+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L（实验培养基）增殖培养基中继代培养15天，实验培养基设3个处理（见表1），对照培养基设一个处理，每个处理接种20瓶，每瓶初始培养的无根试管苗数量为5株，继代培养15天后统计每瓶的试管苗数量，计算出试管苗的增殖系数。

表1 试验培养基设计

（2）不同增殖培养基对甘蔗无根试管苗苗圃生根栽培时存活率和生长速度的影响

将（1）处理过的甘蔗无根试管苗经过清洗、消毒后分成各个单株，穴植于装满栽培基质（蔗叶发酵物与新鲜河沙的混合物）的育苗盆中，并转入控温控湿育苗棚中培养。本试验不作与对照组II的对比试验。

种植时间为：

MS+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L处理的试管苗为2012年9月17日；

MS+6-BA0.1～0.5mg/L+GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L处理的试管苗为2012年9月21日。

育苗棚内培养条件为：

温度25～30℃；湿度90%；光照强度4000～5000lx。

移栽20天后调查存活率，同时揭开育苗棚天面遮阳网和塑料保温膜，在自然光照、温湿度下继续生长培育30天。移栽50天后调查株高、根鲜重和干重，并用生物统计软件SPSS3.0进行数据统计分析。

其中，存活率比较试验中，每个处理调查植株数量为200株；生长速度比较试验中，每个处理调查植株数量为20株。

3、试验结果和分析

（1）不同增殖培养基对甘蔗无根试管苗增殖效果的影响

表2不同增殖培养基处理的增殖效果比较

注：相同小写字母表示在不同行之间在P﹤0.05水平上差异不显著，反之显著；相同大写字母表示在不同行之间在P﹤0.01水平上差异不显著，反之显著。

甘蔗无根试管苗继代增殖培养的增殖系数是衡量其瓶外生根技术的关键指标，增殖系数越高，其与有根试管苗育苗栽培技术优势更明显，生产成本降低幅度更多。表2试验结果表明，实验组培养基的增值系数随6-BA量的增加而提高，最高已达到常规增殖培养基的水平；对照组的增殖系数最低，与最高增殖系数的增殖培养基（实验组Ⅲ）相差1.22倍，与实验组II相差0.9倍，两者差异达到极显著水平，实验组优势明显。

表3不同增殖培养基对甘蔗无根试管苗苗圃生根栽培时存活率比较

根据表4可知，实验组I～Ⅲ的存活率均高于对照组，且实验组I的存活率达到91%，与有根试管苗的苗圃移植存活率相近，但实验组I和实验组II与对照组比，存活率相近，没有显著差异。这说明6-BA和GA₃混合使用处理对提高甘蔗无根试管苗的存活率具有一定的促进作用，但没有明显效果。

表4不同增殖培养基对甘蔗无根试管苗苗圃生根栽培时生长速度比较

根据表4可知，虽然实验组I～Ⅲ的种植时间比对照组晚4天，但实验组I和实验组II培养的无根试管苗苗圃生根栽培后的株高、单株根鲜重和单株根干重都比对照组高，其中株高差异不显著，根的鲜重差异达到显著水平，根的干重差异且达到极显著水平。实验组Ⅲ培养的无根试管苗株高比对照组矮，株高差异达到显著水平，但其培养的无根试管苗的单株根鲜重和单株根干重都比对照组高，但差异不显著。这表明以上3组实验组培养基培养的无根试管苗苗圃生根栽培时生长速度均优于对照组。

4、结论

（1）甘蔗是无性繁殖作物，种茎节部是芽和根原基着生的地方，GA₃处理能促进甘蔗无根试管苗伸长和基部节间的发育，同时能促进无根试管苗腋芽的生长和根原基的发育，而无根试管苗根原基的形成和伸长是甘蔗试管苗瓶外生根成功的关键前提条件。本发明混合使用6-BA与GA₃对试管苗进行培养处理，在成功保证甘蔗试管苗瓶外生根的前提下，更好地提高了无根试管苗增殖培养时的增殖效果，达到了与常规增殖培养基增殖效果相当的水平；同时该培养基继代增殖培养生产的无根试管苗苗圃生根栽培时存活率和生长速度均高于单独使用GA₃的培养处理方法。

（2）不同素质的甘蔗无根试管苗在苗圃生根栽培的生长能力上有很大区别。素质高的试管苗主要体现有：苗长得粗壮，叶大、嫩绿，壮苗缓苗快，生长快速。素质低的试管苗植株矮小，叶片发黄，苗圃生根栽培后需要较长的缓苗期，生长缓慢。根据上述试验结果可知，3组实验组培养基培养的无根试管苗苗圃生根栽培时的生长速度和根的生长发育速度均高于对照组；本发明人在试验中还发现，实验组培养的无根试管苗长得较粗壮，叶片大且呈绿色。这表明其素质均优于对照组。

（3）根据上述试验结果可知，增殖培养基中随6-BA量的增加，增殖系数亦提高，而苗圃生根栽培时的存活率和生长速度反而降低，权衡甘蔗试管苗瓶外生根技术的各个关键指标，为达到最好效果，6-BA处理浓度在0.3mg/L左右时为最佳。而在实际生产过程中，可根据生产需要自行调整6-BA的浓度。

Claims

1.一种采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其步骤包括无菌甘蔗丛生芽的制备、增殖扩繁和无根试管苗的苗圃生根栽培，其特征在于，所述步骤增殖扩繁共进行8～10个增殖培养周期的培养，在最后一个增殖培养周期时采用增殖培养基MS+6-BA0.1～0.5mg/L+ GA₃1.5mg/L+蔗糖30g/L培养处理。

2.根据权利要求1所述的采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其特征在于，所述无菌甘蔗丛生芽的制备包括两种途径，第一种途径是将经脱毒处理和灭菌处理的甘蔗幼嫩心叶通过诱导培养和分化培养得到的无菌甘蔗丛生芽；第二种途径是将经脱毒处理和灭菌处理的甘蔗茎尖或腋芽分化培养得到的无菌甘蔗丛生芽。

3.根据权利要求1或2所述的采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其特征在于，所述的增殖扩繁是采用无菌甘蔗丛生芽进行增殖继代培养，进行8～10个增殖培养周期的培养后将增殖培养所得的甘蔗试管苗放置在普通室温下炼苗3～5天，得到无根试管苗。

4.根据权利要求3所述的采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其特征在于，所述的无根试管苗的苗圃生根栽培是将已经过炼苗的无根试管苗分成单株苗或小丛苗穴植于育苗盆中，置于控温控湿育苗棚中培养15～20天，控制培养条件温度在20～35℃，湿度在80～100%，光照强度在3000～6000lx；然后继续在控温控湿育苗棚中于自然温度、湿度和光照条件下培养20～40天，即可移植至大田里栽种。

5.根据权利要求2所述的采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其特征在于，所述的诱导培养是采用诱导培养基MS+2，4-D2.5～3mg/L+蔗糖30g/L于培养室内25～30℃培养20～30天，诱导形成愈伤组织。

6.根据权利要求2所述的采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其特征在于，所述的分化培养是采用分化培养基MS+6-BA0.5～1mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+蔗糖30g/L于培养室内25～30℃培养30～60天，分化长成无菌甘蔗丛生芽。

7.根据权利要求3所述的采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其特征在于，所述的增殖培养周期时长为13～16天。

8.根据权利要求3所述的采用瓶外生根的甘蔗组培快繁生产方法，其特征在于，所述步骤增殖扩繁中除最后一个增殖培养周期外的其他周期采用常规增殖培养基MS+6-BA1～2mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L培养。