CN101904262A

CN101904262A - 甘蔗试管苗的瓶外生根方法

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Publication number: CN101904262A
Application number: CN 201010227883
Authority: CN
Inventors: 何为中; 刘红坚; 汪淼; 翁梦苓; 陈引芝; 李松; 游建华; 余坤兴; 韦明珠; 刘丽敏; 淡明; 卢曼曼
Original assignee: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION SUGARCANE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION SUGARCANE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2030-07-16
Also published as: CN101904262B

Abstract

本发明公开了一种甘蔗试管苗的瓶外生根方法，其生产程序如下：(1)无菌培养体系建立；(2)增殖扩繁；(3)无根试管苗单株移植苗圃进行瓶外生根和育苗；(4)移栽大田。上述方法省略了培养室内无菌培养生根程序，甘蔗试管苗生根培养操作和培养条件由繁变简，省略培养基配制、高压灭菌、超净工作台无菌转管和培养室恒温恒湿培养等复杂的工作环节，无根甘蔗试管苗瓶外移植生根，操作简单，在自然环境下操作，降低了甘蔗试管生产成本，提高了生产效率。

Description

甘蔗试管苗的瓶外生根方法

技术领域

本发明涉及一种植物试管苗的培养方法，特别是甘蔗试管苗的培养方法。

背景技术

目前生产上所应用的无性繁殖作物多年种植后都会受到各种病害(细菌或病毒)的侵染，造成产量和品质下降，如马铃薯、红薯、果树等，因此国外农业生产先进的国家都十分重视无性繁殖作物种苗的脱毒问题。

甘蔗是无性繁殖作物，病害危害相当严重。在生产上，甘蔗新品种种植多年后易遭受病原物的反复侵染危害，一些细菌性病害和病毒性病害的病原物不断在种茎中积累。危害甘蔗生产的主要病害有凤梨病、黑穗病、花叶病、黄叶病和宿根矮化病等，其中花叶病、黄叶病、宿根矮化病是目前生产上传统防治方法难以控制或去除的病害，会导致甘蔗植株变矮、茎变细小、节间变短，使甘蔗减产、蔗糖分下降，干旱时感病率可达100％(Gillaspie，A.G.etal.1989)。巴西李增生(Lee T.S.G.)博士报道，健康甘蔗良种在生产上种植5年后都会100％感染宿根矮化病，且干旱蔗区更加严重。宿根矮化病一般会导致甘蔗节间变短、植株变矮、产量和糖分下降，产量下降幅度达10～30％。甘蔗宿根化病、花叶病等病害虽然对甘蔗生产影响很大，但防治手段极为有限，目前国内外普采用的方法之一是利用茎尖组织培养方法生产脱毒健康种苗，甘蔗健康种苗增产幅度达到15％以上。由于健康种苗生产环节多和各环节对环境条件的要求高，健康甘蔗种苗生产成本居高不下，制约了甘蔗健康种苗的大范围推广种植，目前甘蔗健康种苗的售价一般为0.6～1元/株，以每亩种植1800～2000株/亩计算，每亩种苗成本为1080～2000元/亩，为使用种茎种成本的4.5～8.33倍。因此简化甘蔗试管苗培养程序，降低生产成本，是解决制约甘蔗健康种苗大规模生产推广的最有效途径。

试管苗瓶外生根技术是近几年研究成功的一项先进的组培生根技术。该技术的关键是将试管苗的生根阶段中的生根和驯化结合起来，省去了试管苗瓶内生根的传统程序。该技术的应用不仅减少了一次无菌操作步骤，节约了培养室空间，又简化了健康种苗生产程序，降低了生产成本，提高了生产效率。有研究证实，试管苗生产的生产成本可降低35～75％。随着组培工厂化育苗的发展，国内外对苹果、金线莲等一大批植物试管苗瓶外生根技术及其生根机理进行了广泛的研究，并且开始应用于生产，取得了很大成功。公开文献也报道了甘薯、月季花、罗汉果、欧李等植物的试管苗瓶外生根方法，但目前甘蔗健康种苗生产中主要利用试管苗瓶内生根方法诱导试管苗生根，然后移植苗圃，国内外有关甘蔗试管苗瓶外生根技术研究还未见有报道，也未有甘蔗试管苗瓶外生根成功报道的例子。

发明内容

本发明的目的是为了简化甘蔗试管苗生产程序，提供一种适应于甘蔗良种试管苗快速繁殖和甘蔗健康种苗生产，达到降低甘蔗试管生产成本，提高生产效率，为甘蔗试管苗瓶生根和苗圃移植管理的甘蔗试管苗的瓶外生根育苗的方法。

传统的甘蔗试管苗生产程序为：无菌培养体系建立——增殖扩繁——试管内生根——一级苗圃——二级苗圃——移栽大田；

本发明的甘蔗试管苗生产程序：无菌培养体系建立——增殖扩繁——试管苗单株或不丛穴植苗圃进行瓶外生根和育苗——移栽大田；

从上述可见，与传统的甘蔗试管苗生产程序比较，本发明省略了甘蔗试管苗生产工艺中的瓶内生根和甘蔗试管苗丛植等二个环节，直接将完成增殖扩繁培养的甘蔗试管苗单株或单穴移植苗圃。(1)省略室内无菌生根程序，结果是减少了培养室的占用空间、配制生根培养基的原料投入、转管生根培养基的劳动力投入和能源投入和室内生根培养所需要的劳动力、能源和时间等资源投入；(2)省甘蔗试管一级苗圃丛栽育苗，甘蔗试管苗单株或单穴移植减少了苗圃占地面积、生产一级苗所需要原料和劳动力投入和省略了甘蔗试管苗从一级苗圃移植到二级苗圃所需要的返青期从而缩短了移植周期，达到简化生产程序和降低生产成本的目的。

本发明的具体技术步骤如下：

甘蔗试管苗的瓶外生根方法，其生产程序如下：(1)无菌培养体系建立；(2)增殖扩繁；(3)无根试管苗单株或小丛穴植苗圃进行瓶外生根和育苗；(4)移栽大田。

以上所述的无菌培养体系建立包括两种途径，第一种途径是将经灭菌处理和脱毒处理的甘蔗幼嫩心叶经诱导培养和分化培养得到的甘蔗丛生芽培养体系；第二种途径是将经灭菌处理和脱毒处理的甘蔗腋芽或茎尖分化培养得到的甘蔗丛生芽培养体系。

上述中，诱导培养和分化培养的培养方法和培养基与目前甘蔗试管苗的培养方法和培养基都是相同的，本技术领域的技术人员都清楚，此处不用详细描述。

以上所述的增殖扩繁是在增殖培养基中的甘蔗试管苗增殖培养基为MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/l，在进行增殖培养的最后一个培养周期时，将增殖培养基中的6-BA和NAA替换为赤霉素(GA)，即使用培养MS+GA1～3mg/L+蔗糖30g/l培养14-16天，浓度为1～3mg/L，培养条件，如光照、温度和湿度条件与增殖培养条件相同。

总的来说，要求根据生产种苗数和甘蔗试管苗质量要求来确定增殖培养时间，一般来讲甘蔗试管增殖周期不超过10个增殖周期，每个周期时长为13-16天，13-16天后要更换新鲜增殖培养基，以保证甘蔗试管苗增殖速度和试管质量。

增殖扩繁以后需要炼苗，所述的炼苗条件是：赤霉素处理培养14-16天后，即将甘蔗试管苗整瓶转移至培养室外进行炼苗，炼苗在普通室内进行，其环境条件与普通室内的环境条件相同。炼苗时，开瓶盖存放，炼苗时间3～5天，炼苗时要注意瓶内有足够的水份或液体培养基，不能干枯。

炼苗以后是栽培基质和种植盘准备：栽培基质为田园土，同甘蔗实生苗的栽培基质。将经过一定时间堆放或晒过的田园土粉碎，然后将细土装填满塑料育苗盆育苗孔洞，装完土后淋透水种植盆，以备用。

将经过炼苗后的甘蔗试管苗用自来水洗干净培养基，剪去披散叶片及尾部1/3～1/2的叶片，并且尽可能将丛生甘蔗试管苗分成单株或小丛(＜5株)，再过一次淡的高锰酸钾溶液(浓度为1∶2000，浸泡5分钟)或者用0.5％的多菌灵溶液消毒3～5分钟，滴干水后，整齐放到塑料框内准备移植育苗盆。

洗苗以后需要育苗大棚搭建，育苗大棚的规格为6×20～30米的大棚，大棚高度2～2.3米，夏季育苗天面无需盖薄膜，四周盖薄膜防风，棚顶盖单层90％的遮阳网，棚内搭小拱棚盖塑料薄膜，以便保湿，育苗盆置于育苗大棚内。大棚四周要求挖排水沟，确保排水良好。

上述的甘蔗试管苗的瓶外生根，是将甘蔗试管苗单株或小丛移植于育苗盆孔穴内，种植后尽快用多菌灵溶液淋定根水，并尽快搭小拱棚覆盖薄膜保湿。大棚外面盖遮阳网，小拱棚内温度达到25℃，将丛生试管苗分成单株或小丛，接着单株或小丛穴植于育苗盆，于育苗大棚拱小拱棚，小拱棚盖塑料薄膜保温保湿，育苗小拱棚温度25℃以上，湿度90～100％，大棚盖遮阳网，移植时间25～30天。注意移植后10天内，湿度保持在90～100％，光照强度控制在450～16000Lux；移植后10-15天，揭开小拱棚两头塑料薄膜，棚内湿度保持在80％左右；移植后15天，揭开小拱棚塑料薄膜；移植后25～30天，即可撤去育苗大棚天面遮阳网，让甘蔗试管苗在自然光照、温湿度下生长。

所述的育苗棚管理有以下几个环节：

(1)湿度和光照强度管理：假植后7～10天，管理工作关键是保持湿度，在早晚可以打开一会小拱棚以换气，其余时间一般都要盖住保湿，根据实际情况，每天换气炼苗时间可逐渐延长，让小苗慢慢适应环境条件。如果天气晴朗，晴天阳光较强，早上9点左右至下午5点左右，要盖遮阳网，调节光照强度。早晚阳光较弱时，打开遮阳网，适当接受阳光，促进小苗生根、生长。阴雨天全天打开遮阳网，以保证有充足的光照。

根据育苗盆土的干湿情况决定再次浇水与否。一般在5～9月间，由于气温较高，日光强烈，每天应浇水2次以上。

(2)施肥和除草：一般甘蔗试管种植10天后，试管苗平均根数达到2～4条，平均根长2～3厘米，大约15天后即可施肥，隔天用千分之五的磷酸二氢钾+尿素的液体肥喷苗叶面，施肥前结合除草，连续喷施3～5次。

移植20天后，隔天以0.1％的复合肥水加少量尿素浇施蔗苗，几次以后浓度可适当增大到0.5％。

(3)剪叶促壮苗和分蘖：在整个苗期的管理过程中，适时剪去1/3～1/2的叶片，以促进丛苗多分蘖及壮苗，同时保持蔗苗生长整齐一致。

(4)移植大田：待苗生长到25cm左右，可定植大田；定植时应剪去1/2的叶片，减弱蒸腾作用。甘蔗试管苗瓶外生根过程到此结束。

本发明的有益效果：

1、利用本发明的上述方法，省略了培养室内无菌培养生根程序，无根甘蔗试管苗在育苗盆和合适光温水气条件下即可生根，甘蔗试管苗生根培养操作和培养条件由繁变简，省略培养基配制、高压灭菌、超净工作台无菌转管和培养室恒温恒湿培养等复杂的工作环节；无根甘蔗试管苗瓶外移植生根，操作简单，在自然环境下操作，对环境条件无复杂要求，容易满足。

2、本发明在甘蔗试管苗瓶外生根育苗过程中，甘蔗试管苗直接单株或单穴移植，省略了甘蔗试管苗从一级苗圃移植生根和培育步骤，省略了甘蔗试管苗从一级苗圃移植到二级苗圃所需要的返青期从而缩短了移植周期，达到简化生产程序和降低生产成本的目的

3、利用本发明的方法进行甘蔗试管苗瓶外生根育苗圃管理，不仅简化了培养程序而且降低了生产成本，主要表现在：(1)省略室内无菌生根培养和一级苗圃丛栽移植等二个生产环节，节约了培养室和育苗圃空间；(2)节约甘蔗试管苗无菌生根培养和一级苗圃移植管理所需的劳动力、原料材料和能源投入；(3)简化甘蔗试管苗生产程序，缩短生产周期，节约了时间成本。本发明能解决目前甘蔗健康种苗生产生根环节工作繁杂和甘蔗试管苗单株生产成本高的问题。

4、本发明的甘蔗试管苗瓶外生根苗圃移植育苗方法，适用于甘蔗愈伤组织再生植株、腋芽组培苗和甘蔗茎尖脱毒健康种苗无根苗的瓶外生根移植、育苗。

5、本发明在总结植物试管苗瓶外生根技术研究成功经验的基础上，根据甘蔗试管苗的植物学特征特性，设计甘蔗试管苗瓶外生根技术研究方案，研究影响甘蔗试管苗瓶外生根主要因素，开发应用于生产实践的甘蔗试管苗瓶外生根技术，简化了试管苗生产程序，大大降低了生产成本，提高了生产效率。

附图说明

图1是本发明甘蔗试管苗瓶外生根流程简图。

从图看到：本发明甘蔗试管苗瓶外生根过程是：首先在增殖培养基中加入赤霉素(GA)培养14-16天，主要目的是促进甘蔗试管苗长高和甘蔗试管苗基部膨胀和节的发育；然后甘蔗试管苗在温室下开瓶盖炼苗；炼完苗后，用自来水冲洗干净甘蔗试管苗，并将丛生试管苗分成单株或小丛；接着单株或小丛穴植于育苗盆，于育苗大棚拱小拱棚，小拱棚盖塑料薄膜保温保湿，大拱棚盖遮阳网，晴天光照强时，小拱棚同时盖遮阳网；移植10～15天后，揭小拱棚塑料薄膜，并开始淋稀释液肥或叶面肥；移植25～30天后，揭大棚遮阳网，育苗圃管理同常规甘蔗试管苗苗圃育苗管理，直至甘蔗试管苗移植大田。

具体实施方式

通过以下具体实施实例，可以进一步了解本发明，但以下实例不用来限定本发明的范围。

实施例1

本发明人是广西科学基金“甘蔗试管苗瓶外生根技术研究”项目(桂科回0991012)的主持人和国家支撑计划课题“高产高效甘蔗良种繁育及栽培技术研究与示范”课题(2007BAD30B04)协助主持人，本项目拟在总结试管苗瓶外生根技术研究的基础上，根据甘蔗试管苗的植物学特征特性，设计甘蔗试管苗试验研究方案，开展影响甘蔗试管苗瓶外生根因素及瓶外生根机理研究，研究培养基的激素种类及浓度水平与瓶外生根的关系。

1、试验材料

试验材料为新台糖22号无根试管苗，由广西甘蔗研究所生物室提供。

2、试验方法

技术路线：用MS+GA(赤霉素)+蔗糖30g/l液体培养基培养14-16天，然后在室温下炼苗3～4天，接着洗苗分单株和调查赤霉素对甘蔗试管苗生长的影响，穴植种植盆，每处理60穴，分三个重复。瓶外生根环境条件温度25℃以上，移植10天内，湿度保持在90～100％，光照500～10000LUX，移植10天后，调查存活率和生根情况，并揭塑料薄膜，在自然湿度条件下生长培育。

(1)赤霉素对甘蔗试管苗生长影响

试验培养基为MS基本培养基+GA(赤霉素)+蔗糖30g/l，设4个处理，对照为常规增殖基MS基本培养基+6-BA+蔗糖30g/l(见表1)。每个处理20瓶，培养14-16天后转移到室温炼苗3～4天，接着调查赤霉素对甘蔗试管苗生长的影响。

表1试验处理设计

(2)赤霉素处理对甘蔗试管苗生根的影响

经不同赤霉素浓度处理培养的甘蔗试管苗洗净后，移植种植盆，每处理60穴，每个重复20穴，重复三次。移植12天后，调查每个重复的存活株数量，并从每个处理随机抽取10穴调查平均根长和平均每株苗的根数量。

3、结果分析

(1)赤霉素对甘蔗试管苗生长影响

表2赤霉素处理对甘蔗试管苗生长的影响

试验结果表明(见表2)，赤霉素培养对甘蔗试管苗伸长和节的发育有明显的促进作用，尤其是添加赤霉素4mg/l的处理对株高和节的生长有明显的作用，个别节间长度达到1～4cm，其次是添加赤霉素3mg/l和2mg/l两个处理；与对照相比，添加赤霉素1mg/l处理的株高高于对照，差异显著达到1％水平，但基部节的数量与对照没有显著差异。

(2)赤霉素处理对甘蔗试管苗生根的影响

表3赤霉素处理对甘蔗试管苗存活率的影响

与对照相比，赤霉素处理存活率均为对照的2倍以上(见表3)，差异达到1％显著差异水平，其中三处理(1mg/l，2mg/l和3mg/l)的存活率均达到83％以上，因此赤霉素处理对甘蔗试管苗移植存活率影响十分显著，能显著促进甘蔗试管苗生根和提高存活率，其中以处理浓度1～3mg/l为最好。

表4赤霉素处理对甘蔗试管苗根生长的影响

赤霉素处理对甘蔗试管苗生根数量和根的长度都有影响(见表4)，但与对照相比，三个处理1mg/l，2mg/l和3mg/l每株根数量多于对照，但没有达到1％显著差异水平；赤霉素处理的平均根长都比对照的长1.2cm以上，但也没有达到1％显著差异水平，这说明赤霉素处理对甘蔗试管根的数量和根的伸长没有明显的影响。

4、结论与讨论

(1)经文献检索，甘蔗试管苗瓶外生根技术国内外还未有研究成功报道。本文试验结果表明，甘蔗试管苗瓶外生根是可行的，且可以获得较高存活率，如在培养阶段用赤霉素处理ROC22试管苗，其存活率达到80～90％，赤霉素处理浓度以1～3mg/l为最好，可以获得较高的存活率，且促进ROC22试管苗根的生长和提高生根率。

(2)甘蔗是无性繁殖作物，种茎节部是芽和根原基着生的地方，赤霉素处理促进了甘蔗试管苗伸长和基部节间的发育，同时促进了甘蔗试管苗腋芽的生长和根原基的发育，甘蔗试管苗根原基的形成和伸长是甘蔗试管苗瓶外生根成功的关键前提条件，本试验结果表明，ROC22无根试管苗适经当浓度赤霉素处理，试管苗植株高度、存活率、节数量、根长和根的数量都会增加。赵玉芬等^[5]也认为植物离体根的形成分为两个阶段，即形成根原基和根原基的伸长及生长，这是试管苗瓶外生根的理论依据。

(3)甘蔗试管瓶外生根技术的成功开发省略了培养室内无菌培养生根程序和室外的一级苗圃育苗等二个环节，无根甘蔗试管苗在育苗盆和合适光温水气条件下即可生根，实现生根与训化移植一步完成。甘蔗试管苗生根培养操作和培养条件由繁变简，省略培养基配制、高压灭菌、超净工作台无菌转管和培养室恒温恒湿培养等复杂的工作环节；无根甘蔗试管苗瓶外移植生根，操作简单，在自然环境下操作，对环境条件无复杂要求，容易满足。

Claims

1.甘蔗试管苗的瓶外生根方法，其特征在于生产程序如下：(1)无菌培养体系建立；(2)增殖扩繁；(3)无根试管苗单株或小丛穴植苗圃进行瓶外生根和育苗；(4)移栽大田。

2.根据权利要求1所述的甘蔗试管苗的瓶外生根方法，其特征在于：所述的无菌培养体系建立包括两种途径，第一种途径是将经灭菌处理和脱毒处理的甘蔗幼嫩心叶经诱导培养和分化培养得到的甘蔗丛生芽培养体系；第二种途径是将经灭菌处理和脱毒处理的甘蔗腋芽或茎尖分化培养得到的甘蔗丛生芽培养体系。

3.根据权利要求1所述的甘蔗试管苗的瓶外生根方法，其特征在于：所述的增殖扩繁是在增殖培养基中的甘蔗试管苗增殖培养基为MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/l，在进行增殖培养的最后一个培养周期时，将增殖培养基中的6-BA和NAA替换为赤霉素(GA)，即使用培养MS+GA1～3mg/L+蔗糖30g/l培养14-16天，然后普通室温下炼苗3～5天。

4.根据权利要求1所述的甘蔗试管苗的瓶外生根方法，其特征在于：所述的试管苗瓶外生根和单株或小丛穴植于苗圃是在普通室温下炼苗3～5天后，洗干净甘蔗试管苗，并将丛生试管苗分成单株或小丛穴植于育苗盆，于育苗大棚拱小拱棚，小拱棚盖塑料薄膜保温保湿，育苗小拱棚内温度25℃以上，湿度90～100％，大棚盖遮阳网，移植时间25～30天。

5.根据权利要求1所述的甘蔗试管苗的瓶外生根方法，其特征在于：所述的移栽大田是甘蔗苗育苗小拱棚移植25～30天后揭大棚遮阳网，按常规甘蔗试管苗苗圃育苗管理，浇水、施肥、除草、剪叶，再移植大田。