CN101138321A

CN101138321A - 一种甘蔗脱毒组培快繁的方法

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Publication number: CN101138321A
Application number: CNA2007100709573A
Authority: CN
Inventors: 徐刚; 汪一婷; 牟豪杰; 吕永平; 陈剑平
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2007-08-22
Filing date: 2007-08-22
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2027-08-22
Also published as: CN101138321B

Abstract

本发明涉及一种甘蔗脱毒组培快繁的方法，属植物繁殖技术领域。包括如下步骤：取甘蔗的顶芽或腋芽为外植体，经愈伤组织诱导培养、植株分化培养、增殖培养、生根培养、病毒检测后，大量繁殖脱毒组培苗。本发明的优点是：采用的外植体体积较大，操作容易；接种成活率高；脱毒简便、快捷、彻底；月繁殖系数达5～10倍，速度快，适合工厂化育苗，可商品化生产。

Description

一种甘蔗脱毒组培快繁的方法

技术领域

本发明涉及植物脱毒组培快繁技术领域，尤其涉及一种甘蔗脱毒组培快繁的方法。

背景技术

甘蔗花叶病害在浙江和福建等省广泛发生已有多年，新叶呈现浅黄色斑驳或轻微的褪绿条纹，老叶呈现长条褪绿条纹或花叶，发病率很高，造成糖分和产量下降(约18％左右)，种性也衰退，影响品质。

获得无病毒植株的方法有多种，例如热处理脱毒、茎尖培养脱毒和茎尖微嫁接脱毒以及组合方法。其中普遍采用的较好的方法是茎尖培养脱毒法，具体的步骤是：通过植物顶端分生组织切取茎尖(0.2mm以下分生组织)，诱导产生幼芽，长成小植株得到脱毒苗。相关的技术已有许多的专利。例如，CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用茎尖作为外植体，经茎尖培养后得到脱毒苗的方法。但是这种茎尖分生组织脱毒法存在的问题是：要切取很微小的0.2mm以下茎尖分生组织，需在显微镜下操作，具有一定难度；而且，切取茎尖组织越小，成活率就越低，而切取茎尖组织偏大，又不能完全脱除病毒，同时容易造成污染；因此，生产上迫切需要一种更好的方法来满足甘蔗脱毒组培快繁的需要。

发明内容

本发明目的是针对上述茎尖分生组织脱毒法所存在的操作难度大、成活率低等缺陷，提出一种以切取较大的甘蔗植株茎尖(2～3mm)为外植体，先诱导产生愈伤组织，再分化形成植株的方法，达到大量、快速、操作方便、脱毒彻底地繁殖甘蔗脱毒组培苗的目的。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种甘蔗脱毒组培快繁的方法，按如下步骤进行：

1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：用MS培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

(2)愈伤组织诱导培养基：MS中添加2，4-D 1～2mg/L和NAA 0.1～0.2mg/L；

(3)分化培养基：MS中添加6-BA2.0～3.0mg/L和NAA 0.1～0.3mg/L；

(4)增殖培养基：MS中添加6-BA0.5～1.0mg/L和NAA0.1mg/L；

(5)生根培养基：1/2MS中添加NAA0.1～0.5mg/L；

2)外植体的选取与灭菌：取甘蔗的顶芽或腋芽，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；

3)愈伤组织诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的顶芽或腋芽在无菌条件下，摘取其2～3mm的茎尖组织，接种在愈伤组织诱导培养基上，诱导形成愈伤组织；

4)分化培养：将步骤3)诱导形成的愈伤组织移植至分化培养基分化出丛芽；

5)增殖培养：将步骤4)分化的丛芽切成单株接种在增殖培养基上，再分化出丛芽；

6)生根培养：将步骤5)增殖形成的丛芽切成单株接种在生根培养基中进行生根培养；

7)移栽：当步骤6)的生根组培苗生长至3～5cm，根数5根以上时，移栽基质培养至成苗；

8)病毒检测：利用RT-PCR扩增技术，构建其基因组序列克隆，原核表达制备病毒特异性的抗血清，建立ELISA检测技术进行甘蔗花叶病毒检测。

所述的培养基进一步可改进为，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：用MS基本培养基，白糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8；(2)愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L；(3)分化培养基：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.15mg/L；(4)增殖培养基：MS+6-BA 0.75mg/L+NAA 0.1mg/L；(5)生根培养基：1/2MS+NAA 0.25mg/L。

所述的灭菌处理是将外植体先经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌10～15min，最后用无菌水冲洗3～5次。

所述的移栽基质是泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶1∶2配制而成。本发明的有益效果是：

1)本发明利用甘蔗的顶芽和腋芽为脱毒组培的外植体，由于茎尖培养时摘取其2～3mm长的茎尖组织，体积较大接种操作就较容易；接种成功率高达90％以上，而现有以脱毒为目的仅摘取0.2～0.3mm的茎尖组织，其培养接种成活率一般只有20％～40％；

2)本发明脱毒简便、快捷，容易从2～3mm长的茎尖中诱导形成愈伤组织并分化出再生植株，解决了以往微型茎尖脱毒不彻底的问题；愈伤组织之所以能达到较好的脱毒效果，可能是因为愈伤组织中病毒的复制过程赶不上细胞增殖速度，将该脱毒组培苗经ELISA病毒检测后，带毒率为0(见试验例)，可解决病毒引起甘蔗种质退化问题，恢复其产量和品质；

3)本发明以切取较大的甘蔗植株茎尖(2～3mm)为外植体，先诱导产生愈伤组织，再分化形成植株的方法，可快速获得大量脱毒组培苗，月繁殖系数达到5～10倍，适合工厂化育苗，可商品化生产。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1(甘蔗的顶芽为外植体)

1)外植体的选取与灭菌：于6月～11月，取甘蔗的顶芽，经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌10min，最后用无菌水冲洗3～5次，作为脱毒组培用的外植体；

2)基本培养基：用MS基本培养基，白糖20g/L，琼脂9g/L，pH5.6；

3)愈伤组织诱导培养：在无菌条件下从步骤(1)灭菌后外植体中摘取2～3mm的茎尖组织，接种在MS+2，4-D 1mg/L+NAA 0.1mg/L的愈伤组织诱导培养基上，至诱导形成愈伤组织；

4)分化培养：将步骤(3)诱导形成的愈伤组织移植至MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L的分化培养基上诱导出丛芽；

5)增殖培养：将步骤(4)分化的丛芽切成单株接种在MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.1mg/L的增殖培养基上，再分化出丛芽；

6)生根培养：将步骤(5)增殖形成的丛芽切成单株接种在1/2MS+NAA0.1mg/L的生根培养基中进行生根培养；

7)移栽：当生根组培苗生长至3～5cm，根数5根以上时，移栽入由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶1∶2配制而成的基质中；

8)病毒检测：利用RT-PCR扩增技术，构建其基因组序列克隆，原核表达制备病毒特异性的抗血清，建立ELISA检测技术进行甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的检测。

实施例2：(以甘蔗的腋芽为外植体1)

1)外植体的选取与灭菌：于11月份，取甘蔗的腋芽，经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌15min，最后用无菌水冲洗3～5次，作为脱毒组培用的外植体；

2)基本培养基：用MS基本培养基，白糖25g/L，琼脂8g/L，pH5.7；

3)愈伤组织诱导培养：在无菌条件下从步骤(1)灭菌后外植体中摘取2～3mm的茎尖组织，接种在MS+2，4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L的愈伤组织诱导培养基上，诱导形成愈伤组织；

4)分化培养：将步骤(3)诱导形成的愈伤组织移植至MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L的分化培养基上诱导出丛芽；

5)增殖培养：将步骤(4)分化的丛芽切成单株接种在MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/L的增殖培养基上，再分化出丛芽；

6)生根培养：将步骤(5)增殖形成的丛芽切成单株接种在1/2MS+NAA0.5mg/L的生根培养基中进行生根培养；

实施例3：(以甘蔗的腋芽为外植体2)

1)外植体的选取与灭菌：于11月份，取甘蔗的腋芽，经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌10min，最后用无菌水冲洗3～5次，作为脱毒组培用的外植体；

2)基本培养基：用MS基本培养基，白糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8；

3)愈伤组织诱导培养：在无菌条件下从步骤(1)灭菌后外植体中摘取2～3mm的茎尖组织，接种在MS+2，4-D 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L的愈伤组织诱导培养基上，诱导形成愈伤组织；

4)分化培养：将步骤(3)诱导形成的愈伤组织移植至MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.15mg/L的分化培养基上诱导出丛芽；

5)增殖培养：将步骤(4)分化的丛芽切成单株接种在MS+6-BA 0.75mg/L+NAA 0.1mg/L的增殖培养基上，再分化出丛芽；

6)生根培养：将步骤(5)增殖形成的丛芽切成单株接种在1/2MS+NAA 0.25mg/L的生根培养基中进行生根培养；

7)移栽：当步骤(6)生根组培苗生长至3～5cm，根数5根以上时，移栽入由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶1∶2配制而成的基质中；

试验例：(病毒检测)

对照材料：从田间采集的甘蔗病叶为材料。

处理材料：以实施例1获得的组培苗为材料。

1)抗血清制备：

a)根据已报道的甘蔗花叶病毒(sugarcan mosaic virus，SCMV)、和高粱花叶病毒(sorghummosaicvirus，SrMV)的检测已发表的序列设计相关病毒外壳蛋白表达引物；

b)扩增相关病毒外壳蛋白基因并构建原核表达质粒，在大肠杆菌中表达；

c)将目的蛋白与2×SDS上样缓冲液按1∶1(v/v)混合，煮沸变性后用12％的SDS聚丙烯凝胶电泳分离，电泳完毕后用0.25M KCl溶液染色；

d)切下的目的蛋白条带用适量1×SDS上样缓冲液匀浆后，再用5-20％梯度的SDS聚丙烯凝胶电泳分离，电泳完毕后用0.25M KCl溶液染色；

e)切下目的蛋白条带免疫小鼠，共免疫4次，前3次间隔7天，第4次免疫3天后断头取血。

2)ELISA检测技术：

a)包被：称取病样和健康对照各0.2g，分别加入包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)各1mL研磨，6000rpm离心后包被96孔板，每孔100uL，4℃，12h；

b)封闭：加封闭液，每孔150uL，37℃孵育1h；

c)加一抗：加入适当稀释的抗血清(ELISA缓冲液稀释)，37℃孵育2h；

d)加酶标二抗：加入1/5000的羊抗鼠IgG-碱性磷酸酶(Sigma，ELISA缓冲液稀释)，37℃孵育2h；

e)加底物：1mg/mL的p-NPP(Sigma，溶于10％二乙醇胺，pH 9.8)，37℃黑暗中孵育，分别在40min、1h和2h测OD₄₀₅值。

3)检测结果如下表所示：

处理	检测的结果
处理	检测的结果	对照	阳性
脱毒组培苗	阴性	对照	阳性

Claims

1.一种甘蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于按以下步骤进行：

(3)分化培养基：MS中添加6-BA2.0～3.0mg/L和NAA 0.1～0.3mg/L；

(4)增殖培养基：MS中添加6-BA0.5～1.0mg/L和NAA0.1mg/L；

(5)生根培养基：1/2MS中添加NAA0.1～0.5mg/L；

7)移栽：当步骤6)的生根组培苗生长至3～5cm，根数5根以上时，移栽基质培养至成苗。

2.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于：所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：用MS基本培养基，白糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8；

(2)愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L；

(3)分化培养基：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.15mg/L；

(4)增殖培养基：MS+6-BA 0.75mg/L+NAA 0.1mg/L；

(5)生根培养基：1/2MS+NAA 0.25mg/L。

3.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于：所述的灭菌处理是将外植体先经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌10～15min，最后用无菌水冲洗3～5次。

4.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于：所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶1∶2配制而成。