CN108588002B - 获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法。本发明提供了获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，包括：a1)将谷子的外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，获得初生愈伤组织；a2)将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织。本发明首次提供了一种谷子成熟种子来源的胚性愈伤组织，通过该胚性细胞的悬浮培养扩增；可以实现快速、高效、稳定的谷子遗传转化。本发明为开展谷子高光效(C4)和耐旱抗逆等功能基因研究奠定了技术基础，为加快谷子的遗传育种研究和现代化农业发展提供了技术支持。

Description

获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法
技术领域
本发明涉及植物组培以及植物基因工程领域，具体涉及一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和农杆菌介导的遗传转化的方法。
背景技术
谷子(Setaria italica(L.)P.Beauv.)，起源于我国，其驯化栽培历史可以追溯到11500年前，是世界范围内最古老的作物之一。谷子属禾本科(Gramineae)、黍亚科(Panicoideae)、黍族(Paniceae)、狗尾草亚族(Setatuubae)、狗尾草属(Setaria)，和玉米(Zea mays.)、高粱(Sorghum bicolor)、珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黍稷(Panicummiliaceum)、甘蔗(Saccharum officinarum)等重要农作物有着很近缘的关系。谷子具有耐旱节水、耐瘠薄、营养高效和高光效(C4植物)等特点，这些特征正是作物遗传改良的发展方向。因此谷子在功能基因组研究中受到越来越增强的重视。尽管近年来对于抗旱耐逆和C4光合作用的分子生物学基础的研究已经有了多个模式物种，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米和高粱等。但拟南芥属双子叶植物，和主要禾本科作物玉米、水稻、小麦等遗传上差距巨大，其抗旱耐逆研究结果难以在这些作物上应用。虽然玉米和高粱一直作为C4光合作用研究的模式作物，但玉米是古四倍体，基因组复杂；且玉米和高粱都具有植株高大，难以在实验室培养间操作，生长周期长等问题，严重影响了研究效率，限制了它们成为模式作物进行相关研究。因此，为了弥补拟南芥等在抗旱耐逆方面研究不足，以及现有C4模式植物的缺陷，急需寻找一个基因组较小、易于转化、自花授粉、抗旱耐逆的C4高光效的作物作为新的C4模式物种进行研究。谷子因是二倍体(2n＝2x＝18)，基因组仅有470M，大小与水稻相当(目前豫谷1号等多个基因型的基因组测序已经完成)，且为自花授粉作物(天然异交率3％～5％)，植株矮小适合实验室操作，生育期短且单株自交结实数量巨大，非常适合作为新的C4光合作用和禾本科抗旱耐逆研究的模式作物开展相关研究。基因的功能研究以高效的遗传转化为前提，但已有的植物遗传转化体系在谷子均无效或者效率很低，遗传转化困难是限制谷子成为模式植物的首要制约因素。
目前，有关谷子遗传转化成功的报道仅有几例，且转化效率偏低。而转化效率受诸多因素影响，如受体类型和状态、培养基构成、外界环境因素等，虽然已有20余年的研究历史，至今成熟的规模化谷子转基因技术体系仍未建立。谷子遗传转化最早是利用基因枪法，董云洲与刁现民分别采取了轰击谷子花粉和胚性愈伤组织均获得了转基因植株，但是转化效率很低。农杆菌介导的谷子转化方面，王永芳与刘颖慧等都能利用农杆菌成功获得转基因谷子，但是转化效率也很低，且稳定性差，不同批次的遗传转化效率差异巨大。尽管多个研究组已经获得了谷子的转基因植株，但是大多采用幼穗为外植体，幼穗的供应受季节、培养条件和数量等众多因素限制，不能随时批量开展遗传转化，且转化效率普遍偏低，达不到稳定高效遗传转化的目的。最近印度与英国的研究小组合作报道了利用种子诱导胚芽为外植体，农杆菌侵染之后直接再生成苗的方法。他们比较了三种激素KT、BAP和TDZ对于诱导胚芽的影响，认为在MS上添加0.5mg/L的BAP效果最好。这是目前国际上首次关于利用谷子胚芽为外植体直接再生，由农杆菌介导遗传转化成功的相关报道。但是其在谷子转化的稳定性与实用性还需要实践检验，且利用胚芽为外植体对于种子的要求极高，由于每粒种子是一个独立的外植体，种子的质量均一性难以保障，且每粒种子诱导胚芽的状态与种子自身的状态有关，所以批次间难以保障一致性；另外利用农杆菌直接转化再生植株虽然节省了转化的时间，但是由于产生的T0代植株并非起源于单一的细胞，所以存在大量的嵌合体，不利于后代植株得到纯合转基因株系。综上所述，建立稳定、高效的谷子遗传转化系统迫在眉睫，这种技术的建立决定了谷子能否成为研究C4光合作用和禾本科作物抗旱耐逆的模式植物。
发明内容
本发明的目的是利用成熟胚(种子)获得谷子胚性愈伤，利用这种胚性愈伤可以进行高效且稳定的农杆菌介导的遗传转化，从而解决谷子难以进行遗传转化的关键瓶颈问题，建立规模化的谷子遗传转化体系，使谷子真正发展成为功能基因研究是模式植物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种诱导和扩繁谷子胚性愈伤组织的方法，包括将谷子成熟种子接种于愈伤诱导培养基以获得初生愈伤组织，再通过悬浮细胞系的方法来诱导和扩增胚性愈伤组织。
第一方面，本发明要求保护一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法。
本发明所提供的获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，具体可包括如下步骤：
(a1)将谷子的外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，获得初生愈伤组织；
初生愈伤组织为外植体接种于诱导培养基后，细胞核内发生了变化，反应了愈伤组织诱导期间核变异的结果。是本领域的公知技术术语。
(a2)将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织。
进一步地，步骤(a1)中，所述诱导培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、天冬氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D、KT、Dicamba(麦草畏)和植物凝胶；在所述诱导培养基中，所述MS盐的终浓度可为2.2-4.5g/L(如4.3333g/L)、所述N6维生素的终浓度可0.5-5ml/L、脯氨酸的终浓度可为0.1-5g/L、天冬氨酸的终浓度可为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度可为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度可为5-100g/L、2,4-D的终浓度可为0.1-5mg/L、KT的终浓度可为0.1-2mg/L、Dicamba(麦草畏)的终浓度可为0.1-2mg/L、植物凝胶的终浓度可为2.6g/L。
在本发明的具体实施方式中，在所述诱导培养基中，所述MS盐的终浓度具体为4.3333g/L、所述N6维生素的终浓度具体为1ml/L、脯氨酸的终浓度具体为0.2g/L、天冬氨酸的终浓度具体为0.2g/L、水解酪蛋白的终浓度具体为0.3g/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、2,4-D的终浓度具体为1mg/L、KT的终浓度具体为0.2mg/L、Dicamba的终浓度具体为0.5mg/L、植物凝胶的终浓度具体为2.6g/L；pH5.6。
进一步地，步骤(a2)中，将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代时采用的悬浮培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D和KT；在所述悬浮培养基中，所述MS盐的终浓度为4.33g/L，所述N6维生素的终浓度为1ml/L、脯氨酸的终浓度可为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度可为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度可为5-100g/L、2,4-D的终浓度可为0.1-5mg/L、KT的终浓度可为0.1-2mg/L。
在本发明的具体实施方式中，在所述悬浮培养基中，所述MS盐的终浓度为4.33g/L、所述N6维生素的终浓度为1ml/L、脯氨酸的终浓度具体为1g/L、水解酪蛋白的终浓度具体为0.3g/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、2,4-D的终浓度具体为1mg/L、KT的终浓度具体为0.2mg/L。
进一步地，步骤(a1)中，进行所述诱导培养的条件可为28℃暗培养20-40天(如30天)。
进一步地，步骤(a2)中，进行所述悬浮培养和继代可按照包括如下步骤的方法进行：将所述初生愈伤组织接种于所述悬浮培养基中，于28-30℃(光照和黑暗均可)进行振荡(摇床转速为100-150rpm)悬浮培养，10-20天后进行第一次继代，之后间隔7-10天继代一次(一共继代3-4次)，继代时的培养基和培养条件不变。
进一步地，所述外植体可为成熟胚(种子)。
进一步地，步骤(a1)中，将所述外植体接种于所述诱导培养基上之前还可包括按照如下方法对所述外植体进行消毒的步骤：将所述外植体置于10％(表示体积百分比，10ml的次氯酸钠溶解于90ml水为10％)的次氯酸钠溶液中消毒10-15分钟。
第二方面，本发明要求保护一种将谷子初生愈伤组织诱导为能够用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法。
本发明所提供的将谷子初生愈伤组织诱导为能够用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，具体可包括如下步骤：将谷子初生愈伤组织按照前文步骤(a2)所述的方法进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织。
第三方面，本发明要求保护一种谷子的遗传转化方法。
本发明所提供的谷子的遗传转化方法，具体可包括如下步骤：
(b1)将利用前文所述方法获得的用于遗传转化的胚性愈伤组织接种于预培养培养基上进行预培养，得到预培养后愈伤组织；
(b2)将所述预培养后愈伤组织于30-60℃条件下进行不超过10min的热击处理，得到预处理后愈伤组织；
(b3)用含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液侵染所述预处理后愈伤组织，将侵染后的愈伤组织接种于共培养培养基上进行共培养，得到共培养后愈伤组织；
(b4)将所述共培养后愈伤组织接种到筛选培养基上进行培养，得到抗性愈伤组织；
(b5)将所述抗性愈伤组织接种到分化再生培养基上进行培养，得到再生苗。
进一步地，在步骤(b5)之后，还可包括如下步骤(b6)和/或(b7)：
(b6)将所述再生苗接种到生根培养基上进行培养，得到生根的幼苗；
(b7)对所述生根的幼苗进行鉴定。
进一步地，步骤(b1)中，所述预培养培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、天冬氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D和植物凝胶；在所述预培养培养基中，所述MS盐的终浓度可为2-4.33g/L、所述N6维生素的终浓度可为0.5-5ml/L、脯氨酸的终浓度可为0.1-5g/L、天冬氨酸的终浓度可为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度可为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度可为5-100g/L、2,4-D的终浓度可为0.1-5mg/L、植物凝胶的终浓度可为2.6g/L。
在本发明的具体实施方式中，在所述预培养培养基中，所述MS盐的终浓度具体为4.33g/L、所述N6维生素的终浓度具体为1ml/L、脯氨酸的终浓度具体为0.2g/L、天冬氨酸的终浓度具体为0.2g/L、水解酪蛋白的终浓度具体为0.3g/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、2,4-D的终浓度具体为2mg/L、植物凝胶的终浓度具体为2.6g/L；pH值5.6。
在本发明的具体实施方式中，步骤(b2)中，所述热击处理是在共培养液中进行的；所述共培养液的溶剂为水，溶质为N6盐、N6维生素、2,4-D、水解酪蛋白、蔗糖、肌醇、葡萄糖和乙酰丁香酮；在所述共培养液中，所述N6盐的终浓度具体为4g/L、所述N6维生素的终浓度具体为1ml/L、2,4-D的终浓度具体为2mg/L、水解酪蛋白的终浓度具体为1g/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、肌醇的终浓度具体为0.1g/L、葡萄糖的终浓度具体为10g/L、乙酰丁香酮的终浓度具体为200mM；pH值5.6。其中，乙酰丁香酮是在其他组分配制完成后经022μm滤膜过滤除菌后加入的。
在本发明的具体实施方式中，步骤(b3)中，所述共培养培养基的溶剂为水，溶质为N6盐、N6维生素、2,4-D、水解酪蛋白、蔗糖、肌醇、葡萄糖、植物凝胶和乙酰丁香酮；在所述共培养液中，所述N6盐的终浓度具体为4g/L、所述N6维生素的终浓度具体为1ml/L、2,4-D的终浓度具体为2mg/L、水解酪蛋白的终浓度具体为1g/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、肌醇的终浓度具体为0.1g/L、葡萄糖的终浓度具体为10g/L、植物凝胶的终浓度具体为4g/L、乙酰丁香酮的终浓度具体为200mM；pH值5.6。
进一步地，步骤(b4)中，所述筛选培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、2,4-D、蔗糖、植物凝胶和抗生素；在所述筛选培养基中，所述MS盐的终浓度可为2-4.33g/L、所述N6维生素的终浓度可为0.5-5ml/L、2,4-D的终浓度可为0.1-5mg/L、蔗糖的终浓度可为5-100g/L、植物凝胶的终浓度可为2.6g/L。
在本发明的具体实施方式中，所述农杆菌具体为农杆菌EHA105。相应的，所述抗生素具体为潮霉素。在本发明的具体实施例方式中，在所述筛选培养基中，所述MS盐的终浓度具体为4.33g/L、所述N6维生素的终浓度具体为1ml/L、2,4-D的终浓度具体为2mg/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、植物凝胶的终浓度具体为2.6g/L；pH5.6。另外。在所述筛选培养基中，潮霉素的终浓度具体为50mg/。
进一步地，步骤(b5)中，所述分化再生培养基的溶剂为水，溶质为含有维生素的MS盐、蔗糖、BAP、NAA和植物凝胶；在所述分化再生培养基中，所述含有维生素的MS盐的终浓度可为2-4.43g/L、蔗糖的终浓度可为5-100g/L、BAP的终浓度可为0.1-5mg/L、NAA的终浓度可为0.1-5mg/L植物凝胶的终浓度可为2.6g/L。
在本发明的具体实施例方式中，在所述分化再生培养基中，所述含有维生素的MS盐的终浓度具体为4.43g/L、蔗糖的终浓度具体为30g/L、BAP的终浓度具体为0.5mg/L、NAA的终浓度具体为0.2mg/L、植物凝胶的终浓度具体为2.6g/L；pH5.6。
在本发明的具体实施例方式中，在步骤(b6)中，所述生根培养基的溶剂为水、VB1、VB6、烟酸、甘氨酸、肌醇、蔗糖和植物凝胶；在所述生根培养基中，所述MS盐的终浓度具体为2.2g/L、VB1的终浓度具体为5mg/L、VB6的终浓度具体为1mg/L、烟酸的终浓度具体为1mg/L、甘氨酸的终浓度具体为2mg/L、肌醇的终浓度具体为0.1g/L、蔗糖的终浓度具体为15g/L、植物凝胶的终浓度具体为2.5g/L；pH值5.6。
进一步地，步骤(b1)中，进行所述预培养的条件可为28℃暗培养5-7天。
进一步地，步骤(b2)中，所述热击处理的条件可为43℃热击处理5min。
进一步地，步骤(b3)中，用于侵染所述预处理后愈伤组织的所述农杆菌侵染液的OD600可为0.1-0.2。
进一步地，步骤(b3)中，进行所述共培养的条件可为22℃暗培养3-6天。
进一步地，步骤(b4)中，将所述共培养后愈伤组织接种到所述筛选培养基上，28℃暗培养，每隔两周用相同的所述筛选培养基进行继代，一共进行3次继代。
进一步地，步骤(b5)中，将所述抗性愈伤组织接种到分化再生培养基上进行培养的条件可为28℃16小时光照，8小时黑暗培养。
进一步地，步骤(b6)中，将所述再生苗接种到生根培养基上进行培养的条件可为28℃16小时光照，8小时黑暗培养。
进一步地，步骤(b7)中，对所述生根的幼苗进行鉴定的方法可包括如下中任一种或多种(最好几种方法结合起来鉴定阳性幼苗)：PCR、qRT-PCR以及表型观察。
第四方面，本发明要求保护培养基或成套培养基。
本发明所要求保护的培养基为如下培养基A或培养基B：
所述培养基A为如下中任一种：前文所述的诱导培养基、前文所述的悬浮培养基。
所述培养基B为如下中任一种：前文所述的预培养培养基、前文所述的共培养培养液、前文所述的共培养培养基、前文所述的筛选培养基、前文所述的分化再生培养基。
本发明所要求保护的成套培养基为如下成套培养基A或成套培养基B或成套培养基C；
所述成套培养基A包括前文所述的诱导培养基、前文所述的悬浮培养基组成。
所述成套培养基B包括前文所述的预培养培养基、前文所述的共培养培养液、前文所述的共培养培养基、前文所述的筛选培养基、前文所述的分化再生培养基。
所述成套培养基C包括前文所述的诱导培养基、前文所述的悬浮培养基、前文所述的预培养培养基、前文所述的共培养培养液、前文所述的共培养培养基、前文所述的筛选培养基、前文所述的分化再生培养基。
第五方面，本发明要求保护如下任一所示的应用：
(A1)前文第一方面中所述的获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法在谷子遗传转化中的应用。
(A2)前文所述的培养基A或成套培养基A或成套培养基C在谷子组织培养中的应用。
(A3)前文所述的培养基A或成套培养基A或成套培养基C在获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织中的应用。
(A4)前文所述的培养基B或成套培养基B或成套培养基C在谷子遗传转化中的应用。
在本发明中，所述谷子具体可为谷子品种Ci846、豫谷1号或Ci79。
在本发明中，以上所有的所述MS盐(不含维生素)均由如下重量份数的各物质混合而成：KNO3 1900份；NH4NO3 1650份；MgSO4·7H2O 180.7份；CaCl2·2H2O 332.02份；KH2PO4170份；Na2EDTA 37.26份；FeSO4·7H2O 27.8份；MnSO4·4H2O 16.9份；ZNSO4·7H2O 8.6份；CuSO4·5H2O 0.025份；CoCl2·6H2O 0.025份；KI 0.83份；H3BO3 6.2份；NaMoO4·2H2O 0.25份。以上所有的所述含有维生素的MS盐均由如下重量份数的各物质混合而成：KNO3 1900份；NH4NO3 1650份；MgSO4·7H2O 180.7份；CaCl2·2H2O 332.02份；KH2PO4 170份；Na2EDTA37.26份；FeSO4·7H2O 27.8份；MnSO4·4H2O 16.9份；ZNSO4·7H2O 8.6份；CuSO4·5H2O0.025份；CoCl2·6H2O 0.025份；KI 0.83份；H3BO3 6.2份；NaMoO4·2H2O 0.25份；Myo-inositol 100份；Nicotinic acid 0.5份；Pyridoxine HCl 0.5份；Thiamine HCl 0.1份；Glycine 2份。以上所有的所述N6盐均由如下重量份数的各物质混合而成：KNO3 2830份；(NH4)2SO4 463份；MgSO4·7H2O 90.37份；CaCl2·2H2O 125.33份；KH2PO4 400份；Na2EDTA37.25份；FeSO4·7H2O 27.85份；MnSO4·4H2O 3.3份；ZNSO4·7H2O 1.5份；KI 0.8份；H3BO30.8份；Nicotinic acid 0.5份；Pyridoxine HCl 0.5份；Thiamine HCl 1份；Glycine 2份。以上所有的所述N6维生素溶剂为水，溶质及浓度为：Nicotinic acid 500mg/mL；Pyridoxine HCl 500mg/mL；Thiamine HCl 1000mg/mL；Glycine 2000mg/mL。
具体的，以上所有的所述MS盐均可为北京西美杰科技有限公司产品，货号为M524(不含维生素)。以上所有的所述含有维生素的MS盐均可为北京西美杰科技有限公司产品，货号为M519(含维生素)。以上所有的所述N6维生素均可为北京西美杰科技有限公司产品，货号为C149。以上所有的所述N6盐均可为北京西美杰科技有限公司产品，货号为C167。这些产品的具体配方参见表1。
本发明可用于在谷子植物中表达任何目的基因。目的基因可以使耐除草剂基因、抗病基因或抗虫基因，或者是选择或评价标记，并含有植物可操作的启动子、编码区和终止子。
本发明所示的“谷子”是指Setaria italica(L.)P.Beauv.，所述方法是以农杆菌介导的目的基因传输到谷子愈伤组织，之后再生为转化的谷子植物为基础的。
含有按照本发明的方法转化的细胞或组织的转基因植物以及通过该转基因与植物产生的种子和后代是本发明所涉及的。将转化的细胞培养成有栽培品种的方法是本领域技术人员公知的。植物组织体外培养技术和整个植株再生技术也是公知的。相应的，所示“种子”包括这些转化植物的种子以及转化植物后代产生的种子。所示“植物”不仅包括转化和再生的植物，还包括通过本发明的方法产生的转化和再生植物的后代。
可以从本发明的方法产生的植物中筛选成功的转化植物。为了开发和改良的植物和种子品系，可以持续的筛选和选择本发明再生植物的种子和子代植物以使转基因和整合的核酸序列持续存在。因此，可以将所需要的转基因核酸序列移入(即渐渗或交配)其他的遗传品系如某些原种或商业上有用的品系或品种中。渐渗目的基因进入遗传植物品系的方法可通过本领域公知的多种技术来实现，包括通过传统的育种、原生质体融合、细胞核转移以及染色体转移、育种方法和技术也是本领域公知的。根据本发明获得的转基因植物和自交系可用于生产商业上有价值的杂交植物和农作物。
本发明首次提供了一种谷子成熟种子来源的胚性愈伤组织，通过该胚性细胞的悬浮培养扩增；可以实现快速、高效、稳定的谷子遗传转化，具有以下几个优点：
1、稳定。本发明所设计的转化方法所用的细胞是在实验室条件下可进行大量繁殖的悬浮细胞系，不受任何的季节、环境等因素制约；从而使得谷子的转化不受季节，外植体的影响，满足周年稳定转化的需求。
2、周期短。本发明的转化方法所用的胚性愈伤细胞可以通过悬浮细胞系快速获得，无需在固体培养基上进行长期继代，故实验周期可以缩短至50-60天，且操作简单方便，可重复性高。
3、转化效率高。本发明所涉及的谷子的转化方法的转化效率可以稳定在10-20％左右，转基因阳性率可以高达90％以上。
4、转化成本低。由于本发明所用的胚性悬浮细胞可以大量提供，所以大大降低了以前谷子幼穗为外植体的供应，大大减少了转化所需的人力与物力成本，可实现规模化遗传转化。
本发明为开展谷子高光效(C4)和耐旱抗逆等功能基因研究奠定了稳固的技术基础。为加快谷子的遗传育种研究和现代化农业发展提供了重要的技术支持。
附图说明
图1为本发明转化谷子的方法所诱导的愈伤组织形态图。
图2为本发明转化谷子的方法的谷子愈伤组织经转化后表达的绿色荧光蛋白GFP的瞬时表达效果图。
图3为本发明转化谷子的方法的谷子愈伤组织经转化后表达的绿色荧光蛋白GFP的稳定表达效果图。
图4为本发明转化谷子的方法的转基因阳性的谷子T1代萌发效果图。
图5为本发明转化谷子的方法的遗传转化基本流程示意图。a：谷子成熟种子愈伤诱导初始阶段；b：胚性细胞悬浮系培养阶段；c：胚性愈伤组织；d：共培养阶段；e：抗性愈伤筛选；f：抗性愈伤植株再生阶段；g：转基因谷子壮苗阶段；h：转基因谷子移栽到土壤。
图6为本发明转化谷子的方法的高效遗传转化系统示意图。a：胚性愈伤共侵染；b：高效的侵染效率(UV光下观察绿色荧光为侵染上的部位)，c：高效的侵染效率(白光下观察被侵染的愈伤)；d：筛选出的抗性愈伤(UV光下观察绿色荧光部分)；e：筛选出的抗性愈伤(白光下观察)；f：抗性愈伤再生出芽；g：转基因植株的壮根(UV光下转基因植株的根为绿色荧光)；h：转基因植株的壮根(白光下转基因植株的根)；i：转基因阴性与阳性植株的叶片(UV光下观察绿色荧光部分为阳性，阴性在UV下不发光)；j：转基因阴性与阳性植株的叶片(白光下观察)。
图7为本发明转化谷子的方法的Southern blotting的结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的MS盐为北京西美杰科技有限公司产品，货号为M524(不含维生素)和M519(含维生素)；N6维生素为北京西美杰科技有限公司产品，货号为C149；N6盐为北京西美杰科技有限公司产品，货号为C167)。这些产品的具体组成如表1所示。
表1MS盐、N6盐和N6维生素的组成
Figure BDA0001648956310000091
谷子品种Ci846：记载于“A haplotype map of genomic variations andgenome-wide association studies of agronomic traits in foxtail millet(Setariaitalica)Nature Genetics,45(8):957-961”的附表1，公众可从申请人(中国农业科学院作物科学研究所)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
谷子品种豫谷1号：记载于“豫谷1号和青狗尾草RIL群体根系变异和垂直分布”(作物学报，2014,40(10):1717-1724)公众可从申请人(中国农业科学院作物科学研究所)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
谷子品种Ci79：记载于“A haplotype map of genomic variations and genome-wide association studies of agronomic traits in foxtail millet(Setariaitalica)Nature Genetics,45(8):957-961”的附表1，公众可从申请人(中国农业科学院作物科学研究所)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
载体pCAMBIA1305-GFP：为潮霉素抗性，记载于“Yulong Ren,Yihua Wang,FengLiu,et al.GLUTELIN PRECURSOR ACCUMULATION3Encodes a Regulator of Post-GolgiVesicular Traffic Essential for Vacuolar Protein Sorting in RiceEndosperm.The Plant Cell,Vol.26:410–425,January 2014”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
实施例1、谷子的遗传转化
一、重组表达载体转化农杆菌
将载体pCAMBIA1305-GFP用热激法转化到农杆菌EHA105菌株中，其转化条件为：100uL的EHA105农杆菌感受态细胞、2μL重组质粒，置于液氮中速冻10分钟，37℃温水浴10分钟；冰上放置10分钟；将转化后的农杆菌EHA105接种于LB试管中于28℃200rpm振荡培养2小时，之后涂于含有50mg/L的利福平与50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，直至长出正确的阳性克隆，挑取阳性克隆培养并提取质粒，酶切验证重组质粒是否转化入农杆菌中；为了再次确认将农杆菌质粒回转入大肠杆菌中，对目标序列进行测序以验证转化的正确性。
二、转基因谷子的获得及鉴定
1、谷子成熟胚的消毒
将谷子(Ci846、豫谷1号、Ci79这三个谷子品种均可)成熟胚(种子)置于10％(体积百分比)的次氯酸钠溶液中消毒10-15分钟，之后用无菌水反复冲洗3遍，最后一遍把水倒掉，用吸水纸把水吸干备用。
2、谷子初生愈伤组织的诱导
将上述谷子Ci846种子接种到表2中5种不同的诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，于28℃条件下暗培养30天，统计愈伤组织诱导率并观察愈伤组织形态，结果如表3所示。每种愈伤诱导培养基设三次重复，每个重复接种100粒种子。
表2中不同的诱导培养基是在基础诱导培养基MS-based(MS盐(M524)4.33g/L、N6维生素(C149)1ml/L、脯氨酸0.2g/L、天冬氨酸0.2g/L、水解酪蛋白0.3g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1mg/L、植物凝胶2.6g/L，pH值5.6；以上各物质的浓度及表2中各物质的浓度均为在诱导培养基中的终浓度)的基础上增加了不同种类和不同浓度的激素处理组合见表2。
表2不同诱导培养基
Figure BDA0001648956310000111
表3不同诱导培养基上愈伤组织诱导率及愈伤组织形态
Figure BDA0001648956310000112
Figure BDA0001648956310000121
根据表2与表3的结果，以MS-based为基础添加0.2mg/L KT与Dicamba(麦草畏)0.5mg/L的培养基上形成的初生愈伤组织状态较好(图1)，可以用于制备谷子细胞悬浮系，其他几种培养基初生愈伤组织长势较慢，某些处理愈伤偏硬，还有的水渍化明显，不适宜大量制备细胞悬浮系。因此根据实验结果，本发明所述的初生愈伤组织诱导培养基为MS-based-5(MS盐(M524)4.33g/L、N6维生素(C149)1ml/L、脯氨酸0.2g/L、天冬氨酸0.2g/L、水解酪蛋白0.3g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1mg/L、植物凝胶2.6g/L、KT 0.2mg/L、Dicamba 0.5mg/L，pH值5.6)。
3、谷子胚性愈伤组织细胞悬浮系的制备和大量扩增
悬浮细胞的起始：将在MS-based-5培养基上诱导获得的初生愈伤组织转移到的含有50ml的悬浮培养基MS-5(MS盐(M524)4.33g/L、N6维生素(C149)1ml/L、脯氨酸1g/L、水解酪蛋白0.3g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 1mg/L、KT 0.2mg/L，pH值5.6。以上各物质的浓度均为在悬浮培养基中的终浓度)以起始悬浮培养，培养条件为28-30℃，转速为100-150r/min的摇床上振荡培养。
谷子胚性悬浮细胞系的获得：上述的悬浮培养10-20天进行第一次继代，继代时去除褐化死亡的细胞组织，选择悬浮培养形成的胚性状态较好的细胞，然后在三角瓶中再加入50ml的新鲜的悬浮培养基MS-5，继续在28-30℃下摇床(转速为100-150r/min)上培养以获得大量的胚性细胞愈伤组织。之后间隔7-10天继代(一共继代3-4次)培养以维持扩增谷子悬浮胚性愈伤组织细胞系。
4、农杆菌介导的谷子胚性细胞的遗传转化
(1)将步骤3获得的胚性的悬浮培养的愈伤组织进行预培养，将细胞团转移到预培养培养基上MS-based-5-pre(MS盐(M524)4.33g/L、N6维生素(C149)1ml/L、脯氨酸0.2g/L、天冬氨酸0.2g/L、水解酪蛋白0.3g/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、植物凝胶2.6g/L，pH值5.6。以上各物质的浓度均为在预培养培养基中的终浓度)。于28℃暗培养5-7天备用。
(2)所述目标农杆菌培养的方法是：将目标农杆菌EHA105菌株于LB固体培养基(10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，15g/L琼脂，pH值7.0)平板上接种活化1次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5ml含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基(10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，pH值7.0)中，在温度28℃、振荡转速160-200rpm的条件下，过夜培养至OD600＝0.5-1.0备用。
(3)将准备好的愈伤组织置于共培养液(4g/L N6盐(C167)，1ml/L N6维生素(C149)，2mg/L 2,4-D，1g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，10g/L葡萄糖，pH值5.6。0.22μm滤膜过滤除菌，除菌后加入乙酰丁香酮至其终浓度为200mM。以上各物质的浓度均为在共培养液中的终浓度)中，43℃热击5分钟；取一定量的农杆菌培养液，10000rpm离心3分钟，弃上清，用共培养液重悬菌体，然后与准备好的愈伤组织混合侵染5分钟，滤纸吸干多余菌液，将侵染过的愈伤组织置于共培养培养基(共培养培养基是在共培养培养液基础上加4g/L植物凝胶，pH值5.6)上，22℃暗培养3-6天。图2是绿色荧光蛋白GFP在愈伤中的瞬时表达情况图。由图可见，图2中左边为侵染后GFP蛋白在愈伤组织中的表达情况(即侵染效率)左边是在UV光下GFP成片表达，右图为在白光下愈伤组织的状态。而图3为稳定表达图，即pCAMBIA1305-GFP载体已经成功整合到细胞中，稳定表达绿色荧光蛋白的结果。
(4)将共培养后的愈伤组织转移至含有正确抗性的筛选培养基(4.33g/L MS盐(M524)、1ml/L N6维生素(C149)，2mg/L 2,4-D，30g/L蔗糖，2.6g/L植物凝胶，pH值5.6。高压灭菌后，加入正确的筛选剂与抗生素——潮霉素50mg/L)。以上各物质的浓度均为在筛选培养基中的终浓度)28℃暗培养2周，每隔两周用相同的筛选培养基继代，一共3次。由图3可见，绿色荧光蛋白稳定在愈伤组织中表达，证明筛选效率很高。
(5)将三轮筛选培养后的抗性愈伤转移至分化再生培养基(4.43g/L MS盐(M519))，30g/L蔗糖，0.5mg/L BAP，0.2mg/L NAA，2.6g/L植物凝胶，pH值5.6。以上各物质的浓度均为在分化再生培养基中的终浓度)上，28℃16小时光照，8小时黑暗培养，5-10天再生出苗。
(6)将小苗转移至生根培养基(2.2g/L MS盐(M524)，5mg/L VB1，1mg/L VB6，1mg/L烟酸，2mg/L甘氨酸，0.1g/L肌醇，15g/L蔗糖，2.5g/L植物凝胶，pH值5.6。以上各物质的浓度均为在生根培养基中的终浓度)进行生根培养，28℃16小时光照，8小时黑暗培养，10-20天，待小苗长至10-20cm时在培养间进行炼苗。
(7)移栽进花盆土中，于温室培养，生长后期取叶片进行转基因阳性检测。
图4为转基因阳性的谷子T1代萌发与野生型对比图。由图可见，左图为在UV光下转基因阳性的谷子T1代幼苗表达绿色荧光蛋白，而野生型(WT)则无荧光，右图为白光下幼苗的形态。
图5为谷子遗传转化基本流程示意图。图6为谷子高效遗传转化系统示意图。
5、Southern验证谷子转基因的植株及其拷贝数
分别取步骤4获得的6个独立的转基因事件(编号分别为：767、824、707、834、745和747)的谷子叶片，及野生型叶片做对照，各约100mg为待检测样品，利用液氮研磨样品，用CTAB法大提谷子基因组DNA，取1μL总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测样品完整性。将7份基因组DNA约10μg，10×buffer 3μL，KpnⅠ(或者SacⅠ)15U，补ddH2O至30μL；37℃酶切16h。之后用TAE配制0.8％琼脂糖凝胶，酶切产物在30V电压下电泳16h。利用毛细管法将电泳后的酶切产物印迹到尼龙膜。使用HPT基因上的一段序列(SEQ ID No.1)为探针(扩增引物：hpt557-F：5’-ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3’；hpt557-R：5’-TCCACTATCGGCGAGTACTT CT-3’)，用非放射性检测法对样品中目的片段进行检测，结果如图7。从图中可见，所有6份样品用两种酶切后，同时质粒与野生型作为正负对照，待检测的6个样品中2个为单拷贝，2个为双拷贝，2个为多拷贝。
三、不同批次的愈伤转化效率统计
按照上述方法对谷子品种Ci846进行多批次遗传转化，并统计结果如表4所示。结果显示：平均转化效率16.89％，最高可达到32.75％，基本上可以稳定在10％-20％之间。
表4不同批次愈伤来源转化效率统计
Figure BDA0001648956310000141
Figure BDA0001648956310000151
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法
<130> GNCLN180915
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 556
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tccactatcg gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc 60
gatttgtgta cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg 120
cgcccaagct gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt ggtcaagacc 180
aatgcggagc atatacgccc ggagtcgtgg cgatcctgca agctccggat gcctccgctc 240
gaagtagcgc gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga agatgttggc 300
gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg 360
gccattgtcc gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt gccggacttc 420
ggggcagtcc tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg acgcactgac 480
ggtgtcgtcc atcacagttt gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg cgcatatgaa 540
atcacgccat gtagtg 556

Claims (15)

1. 一种获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：
（a1）将谷子的外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养，获得初生愈伤组织
（a2）将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代，得到胚性愈伤组织细胞悬浮系；所述胚性愈伤组织细胞悬浮系即为用于遗传转化的胚性愈伤组织；
所述外植体为成熟胚；
步骤（a1）中，所述诱导培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、天冬氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D、KT、Dicamba和植物凝胶；在所述诱导培养基中，所述MS盐的终浓度为2.2-4.5g/L、所述N6维生素的终浓度为0.5-5ml/L、脯氨酸的终浓度为0.1-5g/L、天冬氨酸的终浓度为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度为5-100g/L、2,4-D的终浓度为1mg/L、KT的终浓度为0.2mg/L、Dicamba的终浓度为0.5mg/L、植物凝胶的终浓度为2.6g/L；
步骤（a2）中，将所述初生愈伤组织进行悬浮培养和继代时采用的悬浮培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D和KT；在所述悬浮培养基中，所述MS盐的终浓度为4.33g/L、所述N6维生素的终浓度为1ml/L、脯氨酸的终浓度为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度为5-100g/L、2,4-D的终浓度为1mg/L、KT的终浓度为0.2mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（a1）中，进行所述诱导培养的条件为28℃暗培养20-40天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（a2）中，进行所述悬浮培养和继代是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述初生愈伤组织接种于所述悬浮培养基中，于28-30℃进行振荡悬浮培养，10-20天后进行第一次继代，之后间隔7-10天继代一次，继代时的培养基和培养条件不变。
4.一种谷子的遗传转化方法，包括如下步骤：
（b1）将利用权利要求1-3中任一所述方法获得的用于遗传转化的胚性愈伤组织接种于预培养培养基上进行预培养，得到预培养后愈伤组织；
（b2）将所述预培养后愈伤组织于30-60℃条件下进行不超过10min的热击处理，得到预处理后愈伤组织；
（b3）用含有目的基因表达载体的农杆菌侵染液侵染所述预处理后愈伤组织，将侵染后的愈伤组织接种于共培养培养基上进行共培养，得到共培养后愈伤组织；
（b4）将所述共培养后愈伤组织接种到筛选培养基上进行培养，得到抗性愈伤组织；
（b5）将所述抗性愈伤组织接种到分化再生培养基上进行培养，得到再生苗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b1）中，所述预培养培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、脯氨酸、天冬氨酸、水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D和植物凝胶；在所述预培养培养基中，所述MS盐的终浓度为2-4.33g/L、所述N6维生素的终浓度为0.5-5ml/L、脯氨酸的终浓度为0.1-5g/L、天冬氨酸的终浓度为0.1-5g/L、水解酪蛋白的终浓度为0.1-5g/L、蔗糖的终浓度为5-100g/L、2,4-D的终浓度为0.1-5mg/L、植物凝胶的终浓度为2.6g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（b2）中，所述热击处理是在共培养液中进行的；所述共培养液的溶剂为水，溶质为N6盐、N6维生素、2,4-D、水解酪蛋白、蔗糖、肌醇、葡萄糖和乙酰丁香酮；在所述共培养液中，所述N6盐的终浓度为4 g/L、所述N6维生素的终浓度为1ml/L、2,4-D 的终浓度为2 mg/L、水解酪蛋白的终浓度为1 g/L、蔗糖的终浓度为30 g/L、肌醇的终浓度为0.1 g/L、葡萄糖的终浓度为10 g/L、乙酰丁香酮的终浓度为200mM。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b3）中，所述共培养培养基的溶剂为水，溶质为N6盐、N6维生素、2,4-D、水解酪蛋白、蔗糖、肌醇、葡萄糖、植物凝胶和乙酰丁香酮；在所述共培养培养基中，所述N6盐的终浓度为4 g/L、所述N6维生素的终浓度为1ml/L、2,4-D 的终浓度为2 mg/L、水解酪蛋白的终浓度为1 g/L、蔗糖的终浓度为30 g/L、肌醇的终浓度为0.1 g/L、葡萄糖的终浓度为10 g/L、植物凝胶的终浓度为4g/L、乙酰丁香酮的终浓度为200 mM。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b4）中，所述筛选培养基的溶剂为水，溶质为MS盐、N6维生素、2,4-D、蔗糖、植物凝胶和抗生素；在所述筛选培养基中，所述MS盐的终浓度为2-4.33 g/L、所述N6维生素的终浓度为0.5-5ml/L、2,4-D的终浓度为0.1-5mg/L、蔗糖的终浓度为5-100 g/L、植物凝胶的终浓度为2.6 g/L。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b5）中，所述分化再生培养基的溶剂为水，溶质为含有维生素的MS盐、蔗糖、BAP、NAA和植物凝胶；在所述分化再生培养基中，所述含有维生素的MS盐的终浓度为4.43 g/L、蔗糖的终浓度为5-100 g/L、BAP 的终浓度为0.1-5 mg/L、NAA的终浓度为0.1-5 mg/L、植物凝胶的终浓度为2.6 g/L。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b1）中，进行所述预培养的条件为28℃暗培养5-7天。
11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b2）中，所述热击处理的条件为43℃热击处理5min。
12.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b3）中，用于侵染所述预处理后愈伤组织的所述农杆菌侵染液的OD600为0.1-0.2。
13.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b3）中，进行所述共培养的条件为22℃暗培养3-6天。
14.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b4）中，将所述共培养后愈伤组织接种到所述筛选培养基上，28℃暗培养，每隔两周用相同的所述筛选培养基进行继代，一共进行3次继代。
15.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b5）中，将所述抗性愈伤组织接种到分化再生培养基上进行培养的条件为28℃ 16小时光照，8小时黑暗培养。
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