CN114164229B

CN114164229B - 利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体获得再生效率高的草莓新种质的方法及应用

Info

Publication number: CN114164229B
Application number: CN202111297086.5A
Authority: CN
Inventors: 顾婷婷; 菅宝霞; 李宪杨; 吴旭婷; 刘德才; 丁静
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2023-11-03
Anticipated expiration: 2041-11-04
Also published as: CN114164229A

Abstract

本发明涉及一种利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体获得再生效率高的草莓新种质的方法及应用，包括：根据草莓FvePILS5的DNA序列，设计并合成包含目的基因靶点的sgRNA序列；用Bsa I酶将合成的包含目的基因靶点的sgRNA序列连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi‑H载体；并利用农杆菌转化森林草莓叶片外植体，测序验证再生植株突变序列，得到愈伤形成和离体芽再生频率较高的pils5‑1森林草莓突变体种质。本发明通过构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，并用农杆菌转化法，获得了再生效率较高的pils5‑1突变体，创造了新种质，为草莓再生苗的获得提供了一种高效的方法。

Description

利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体获得再生效率高的草莓新种质的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体获得再生效率高的草莓新种质的方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，是重要的蔷薇科经济作物。草莓的组织培养技术可以为生产提供大量的脱毒苗，且是现代基因工程技术(如基于基因编辑的分子育种技术)应用的基础。森林草莓(Fragaria vesca)是栽培草莓的祖先种之一，是基因功能研究的理想模式植物。对森林草莓进行组织培养方面的研究，可以为草莓的遗传转化、分子育种的研究提供理论参考和技术支持。

植物组织培养技术是利用植物细胞的全能性，对其离体器官、组织、细胞或原生质体进行离体培养，使其离体器官成长为完整植株的过程。草莓离体芽再生通常是以叶片为外植体，在叶片伤口处形成愈伤组织，然后愈伤组织细胞局部快速分裂形成不定芽。在植物再生过程中生长素和细胞分裂素的比例对芽和根的产生有着显著的影响，将外植体放置在含有高浓度生长素和低浓度细胞分裂素的愈伤组织诱导培养基(callus-inducingmedium,CIM)上首先诱导出一团具有多能性的愈伤组织，然后将其转移至含有高浓度细胞分裂素和低浓度生长素的芽诱导培养基(shootinducing medium,SIM)上诱导不定芽产生，或移至含有低浓度生长素的根诱导培养基(root-inducing medium,RIM)上诱导产生不定根，完成整个植株的再生。目前草莓离体芽再生效率不高，促进草莓愈伤形成和离体芽再生的突变体较难培育。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体获得再生效率高的草莓新种质的方法及应用。通过构建CRISPR/Cas9基因敲除载体，利用农杆菌转化森林草莓叶片，获得了草莓愈伤形成和离体芽再生效率高的pils5-1突变体，创造了新种质，为草莓再生苗的获得提供了一种高效的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体的制备方法，包括：

根据草莓FvePILS5的DNA序列，设计并合成包含目的基因靶点的sgRNA序列，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述靶点序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

设计并合成sgRNA上下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物序列如SEQ ID NO.7所示；

用Bsa I酶将合成的包含目的基因靶点的sgRNA序列连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(华南农业大学刘耀光老师惠赠)，并利用sgRNA上下游引物进行PCR反应，通过测序判断sgRNA序列是否整合到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上。

生长素作为一种植物激素，在植物生长发育的各个时期都发挥着关键的作用。PIN(PIN-FORMED)蛋白是生长素次级运输载体，可将生长素运出细胞。类PIN蛋白(PIN-Likes,PILS)是拟南芥中包含7个成员的一类IAA载体家族，是2012年鉴定出的一类新的生长素运输载体基因。PILS蛋白定位于内质网上，可将生长素限制在内质网上，减少了细胞核内生长素信号。目前PILS蛋白在草莓中的报道极少，因此研究PILS蛋白对于调节草莓叶片再生调控机制具有重要的作用。

基因编辑是对目的基因进行定向的编辑的一项技术，可以精准地定位到目的位点上，对该位点进行特定DNA片段的插入、缺失、修改和替换等以改变目的基因或调控元件的序列、表达量或功能。CRISPR/Cas9是目前最流行的基因组编辑技术，它是在基因水平上进行修饰，大大提高了基因筛选的敏感度和准确度，在基因敲除、目标基因的替换/插入、作物品种改良，提高品质，抵抗逆境等方面得到了广泛应用。本发明通过构建FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体，并用农杆菌转化法，获得了具有较高离体芽再生效率的pils5-1转基因突变体材料，为草莓再生体系的优化和品种改良等方面提供技术参考。

优选地，所述PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，延伸温度为72℃，延伸时间为40s，设置35个循环，最后72℃延伸5min。

本发明还提供上述的方法制备得到的FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体。

本发明还提供一种利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体获得再生效率高的草莓新种质的方法，包括：

将上述的FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入农杆菌GV3101中，用农杆菌侵染草莓外植体叶片；

将草莓愈伤组织诱导得到再生苗，经PCR筛选得到突变的再生植株，测序鉴定得到草莓pils5-1突变体，即为再生效率高的草莓新种质。

优选地，所述PCR筛选所采用的引物序列为：

F2:5’-CTGTTTGAGGTGGCATCTAT-3’,R2:5’-TTACAACGCCTTCCTGATA-3’。

优选地，所述PCR筛选程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，延伸温度为72℃，延伸时间为30s，设置35个循环，最后68℃延伸10min。

本发明还提供上述的方法制备得到的再生效率高的草莓新种质。

本发明还提供上述的FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体在获得再生效率高的草莓新种质中的应用。

本发明还提供转染上述的FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体的工程菌在获得再生效率高的草莓新种质中的应用。

本发明所达到的有益效果：

1.本发明通过对FvePILS5基因的定向编辑，获得了草莓愈伤形成和离体芽的再生效率较高的pils5-1突变体，验证了FvePILS5基因与草莓愈伤形成和离体芽再生相关，为草莓育苗提供了一种新思路。

2.本发明通过基因编辑的方式促进草莓愈伤的形成和离体芽再生，克服了目前草莓再生效率不高、转基因草莓难以培育的缺点。

3.本发明通过基因编辑获得再生效率较高的植株，为其他植物再生效率提高及CRISPR/cas9基因编辑技术的应用提供了参考。

附图说明

图1为野生型‘Hawaii 4’愈伤生长状况(即对照组)(左)与突变体pils5-1 T2代叶片愈伤生长状况(右)对比；

图2为野生型‘Hawaii 4’不定芽生长状况(左)与突变体pils5-1 T2代不定芽生长状况(右)对比；

图3为野生型‘Hawaii 4’与突变体pils5-1 T2代不定芽再生频率对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1：FvePILS5-CRISPR/Cas9载体的构建

(1)靶点及载体设计：

在GDR(https://www.rosaceae.org/)中查找森林草莓FvePILS5基因的DNA以及氨基酸序列(DNA:2112bp，序列如SEQ ID NO.1所示，FvePILS5基因编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示)。根据森林草莓FvePILS5 DNA序列，通过在线网站

CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)设计包含目的基因靶点的sgRNA序列(如SEQ ID NO.3所示)，要求靶点包括20个碱基，靶点GC含量不低于40％，靶点内5’-NGG-3’方向不要出现连续4个以上的T，以防RNAPol III将其作为终止信号。靶点序列为:

Target1:5‘-CCTTTGGGTGCCAGAAGATCCTT-3’(如SEQ ID NO.4所示),

Target2:5‘-CCCTCATGTTTGCAAGTGTTGCC-3’(如SEQ ID NO.5所示)。

(2)CRISPR/Cas9载体构建：

将设计好的包含目的基因靶点的sgRNA序列转交公司合成，用Bsa I酶将公司合成的sgRNA序列连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上(华南农业大学刘耀光老师惠赠)，并设计sgRNA上下游引物进行PCR反应，通过测序判断sgRNA序列是否整合到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，上游引物为F1:5’-TTACTAGATCGGGAGCACCGGT-3’(如SEQ ID NO.6所示),下游引物为R1:5’-ACGATGTAGGAGATCGATGCATG-3’(如SEQ ID NO.7所示)，菌液PCR和测序获得正确载体，然后转化农杆菌GV3101，用于后期草莓遗传转化。PCR反应体系如表1所示：

表1.利用sgRNA上下游引物进行PCR反应的反应体系

将PCR程序设定为：94℃预变性3min，94℃变性30s、60℃退火30s、延伸温度为72℃，延伸时间根据扩增片段长度来计算(1kb/min)，延伸时间为40s，设置35个循环，最后72℃延伸5min。

实施例2农杆菌介导的森林草莓遗传转化

1.外植体的准备：外植体选择森林草莓生态型‘Hawaii 4’的幼嫩叶片。

在无菌超净工作台上，将野生型二倍体森林草莓‘Hawaii 4’的种子消毒，取4-5颗种子点在灭菌的组培瓶中，放于28℃恒温箱培养，待发芽后置于光下。外植体选用叶龄30天左右，长势一致，饱满的嫩叶。

2.农杆菌侵染转化

(1)在-80℃冰箱取出含有森林草莓FvePILS5基因的CRISPR/Cas9载体的GV3101根癌农杆菌，涂布在含卡那霉素和利福平抗性的LB固体培养基平板上，放于28℃恒温箱培养2-3天，待长出单菌落后，挑取单菌落置于含卡那霉素和利福平抗性的LB液体培养基中，放于28℃摇床以200rpm培养18-24小时，待菌液颜色摇至浅黄。将摇好的菌液4500rpm室温离心5min,弃滤液，收集菌块，并用灭菌的MS悬浮液重悬菌体，测定OD600值，将OD600调至约0.478-0.5，然后将菌液放置于28℃恒温摇床，100rpm，悬浮1h。

(2)侵染叶片：在超净工作台上，剪下状态一致的叶龄30天左右的嫩叶，用刀片在草莓叶片背面划伤口，然后将叶片放入MS菌液悬浮液，放28℃摇床，100rpm侵染20分钟。侵染完毕后将菌液倒尽，用无菌滤纸吸干叶片上残留的菌液，并将其转移至共培养培养基上，在黑暗环境中共培养3天。换脱菌板并转移至弱光，将长出愈伤的外植体移动到筛选培养基上，移到光下进行培养，温度设置为22℃，每2周更换一次培养基。

实施例3转基因植株的鉴定

1.潮霉素筛选

潮霉素(Hyg)是常用的筛选抗生素之一，通常用于双子叶植物的筛选标记，将经过转化后的外植体在愈伤培养基阶段、筛选培养基阶段、生芽培养基阶段均加入20mg/L浓度的潮霉素，处于该浓度下的野生型外植体几乎不分化，并且一段时间后会褐化死亡，可用于初步筛选疑似外植体。待叶片长出芽后转到生根培养基中，当长成完整小苗时，缓苗后将T0代移入花盆。

2.PCR筛选阳性植株

提取T0代pils-1突变体和野生型森林草莓植株的DNA,同时设计靶点前后序列引物F2:5’-CTGTTTGAGGTGGCATCTAT-3’,R2:5’-TTACAACGCCTTCCTGATA-3’,对突变体和野生型植株的DNA进行PCR扩增，并转交公司测序。PCR反应体系如表2所示。

表2.筛选阳性植株的PCR反应体系

混合物成分	用量(μl)
		2xTaq Super Mix	25μl
Forward Primer(10μM)	1μl
		Reverse Primer(10μM)	1μl
模板	1μl
		灭菌ddH₂O	up to50μL

将PCR程序设定为：94℃预变性2min，94℃变性30s、60℃退火30s、延伸温度为72℃，延伸时间根据扩增片段长度来计算(1kb/min)，延伸时间为30s，设置35个循环，最后68℃延伸10min。

3.序列比对：

将突变体的测序结果与野生型测序结果的原始序列进行比对，发现在Target1序列处有单碱基G的缺失，即为pils5-1突变体。

WT:

TTCTTCCTTTGGGTGCCAGAAGATCCTTGAATA……ACCTTCCCTCATGTTTGCAAGTGTTGCCGAGAC

pils5-1:

TTCTTCCTTTGG_TGCCAGAAGATCCTTGAATA……ACCTTCCCTCATGTTTGCAAGTGTTGCCGAGAC

4.后代自交：

筛选双重阳性的T0株系继续种植，T0代植株开花后人工自交，获得T0代pils5-1突变体的种子。种子播种得到T1代，提取T1代突变体DNA，检测突变体编辑位点。与T0代突变一致，继续人工自交获取纯合的突变体种子。

实施例4pils5-1突变体植株再生能力的验证

1.外植体准备：外植体选择森林草莓野生型‘Hawaii 4’和pils5-1突变体T2代的幼嫩叶片。

在无菌超净工作台上，将野生型二倍体森林草莓‘Hawaii 4’和pils5-1突变体的T1代种子消毒，播种，每个组培瓶中放置4-5颗种子，放于黑暗的28℃恒温箱，待发芽后置于光下。外植体选用叶龄30天左右，长势一致，饱满的嫩叶，野生型“‘Hawaii 4’和pils5-1突变体各取150个外植体，分别置于6个愈伤培养基中，每个培养基约25个外植体，暗培养3天后，转移至弱光，每15-20d更换一次诱导培养基，当出现不定芽时转移至生芽培养基并移到光下。进行三次生物学重复。

实验中所用的培养基配方如下：

草莓愈伤组织诱导培养基(callus-inducing medium,CIM)：MS培养基+2mg/LTDZ+0.2mg/L IBA

草莓愈伤生芽诱导培养基(shoot-inducing medium,SIM):MS培养基+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA

实验中所用的激素配制方法如下：

TDZ(2mg/mL)：称取20mg TDZ粉末，用200μL的1M氢氧化钠溶液溶解后，待完全溶解后加入纯酒精，定容到10ml，放-20℃保存备用。

IBA(1mg/mL)：称取10mg IBA粉末，用无菌蒸馏水定容至10mL，放-20℃保存备用。

6-BA(5mg/mL)：称取50mg 6-BA粉末，用200μL的1M氢氧化钠溶液助溶，用无菌蒸馏水定容至10ml，放-20℃保存备用。

Ti(300mg/mL)：称取3g Ti，用蒸馏水定容至10mL，放-20℃保存备用。

Kan(100mg/mL)：称取Kan 500mg，用蒸馏水定容至5mL，放-20℃保存备用。

HB(5mg/mL)：母液即为液体，稀释20倍。

2.观察统计

定期拍照观察叶片愈伤组织和离体芽再生情况，为了更准确地比较突变体材料与野生型的不定芽再生情况，约30d左右开始统计外植体不定芽的数目，每隔3d统计一次，直到不定芽不再增加为止。

计算公式如下：芽再生频率(％)＝发生芽再生的外植体数/叶片总数x100％

实验数据表明：在离体森林草莓外植体组织培养30d后pils5-1突变体愈伤明显比野生型大且愈伤多(图1为叶片愈伤的情况)；pils5-1突变体出芽时间和数量早于野生型(图2为50d野生型与突变体单个叶片芽再生情况)，与此同时，我们还统计了pils5-1突变体和野生型的不定芽再生频率(图3)，对照组野生型的不定芽再生频率为62.28％，而pils5-1突变体的不定芽再生频率高达85.00％，是对照组的1.36倍，不定芽再生效率提高。证实了FvePILS5基因的表达与草莓叶片愈伤形成和离体芽再生相关。本发明通过构建CRISPR/Cas9基因敲除载体，并用农杆菌转化法，获得了具有再生效率较高的pils5-1转基因突变体材料，为草莓再生体系的优化和品种改良等方面提供技术参考。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 利用CRISPR/Cas9基因编辑载体获得再生效率高的草莓新种质的方法及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2112

<212> DNA

<213> 森林草莓(Fragaria vesca)

<400> 1

atgggtttct ggactctgtt tgaggtggca tctatgccag ttctgcaagt tttgataatc 60

agtttgttgg gagcttacat ggctactgag tattgcaatc ttcttccttt gggtgccaga 120

agatccttga ataaggtatg ttgtttcaaa tttctgcatg atcctgcttg ttttcgtgtg 180

atctcgaaag tttttgaggc ttcatttgca aatgcagatt gtgtttgtgg tgttcacacc 240

ttccctcatg tttgcaagtg ttgccgagac tgtcacattt gatgacatca tttcatggta 300

ggctacactt gtatgaaaat tttcccattt tcttgaacct ttcggattca tggacagttt 360

gatctttcat ttttcaggtg gttcatgatt gtcaatgtgg cacttacatt ttttattgga 420

tccattcttg gatggttagt ggtaaagata ctgaaaccaa agccttatca ggaaggcgtt 480

gtaattgctt catgttcatc aggtgattca tgctcaaaat tctttcctga actctcacat 540

tgatgtaatt tgctcatgaa ctaattatga tcaatcctat tgaatatata gcaaacttgg 600

gaaaccttct gcttatactt gtgcctgcaa cctgtcatga ggccggaaac cccttcggcg 660

atcatgaagt ttgtagtgca gttggactcg catatgcctc gttttccatg gcggtaagaa 720

aattgcttgc tcttcatgat gtaaatcagt gaattatgaa gttggtgact tggtgctaac 780

aaattttcac ttggttggta ctgcagcttg gtggtttctt catttggact tatacgtatc 840

agctgataag atcctcatct gtgaaattta aagcacttca agaagctgaa aaggtggcca 900

tgaagaggcc gaataaggac ttggatgctg atggggcaac tcaccttctc aaagaaggag 960

atgaagagca gggctctatt gtagtctcat ctaaatccgc agatcacccc cctgctgtaa 1020

gtatatatcc ttctactgtc atacttagga atcagattct ggcttatgtg caaaaattaa 1080

ctcaaacttt tctttggact gtctggatta ctcaaatagc agatagtgac tcatgaacca 1140

gatgtatcat ttgcccgaac aatactagca ttttttcaac agattttaca tgagttaatg 1200

gcaccaccaa ctgtagctgc agtgagtttt catagcattt catctgaatt ctattagtaa 1260

gtgcttcata aggcatcaag actgatacat aagttgcatg tttgctcaat ttgatgtcta 1320

tgatcagatc attggatttg tcttcggggc agttccatgg cttaaaagct tgataattgg 1380

tgacagcgcc cccctccgag tgatccaaga ctcagttaca caactcgggt aagtaattgc 1440

taggtttaga gcttagaagg catctcctat gcttcaatca aacaacttca agacaattaa 1500

cagctaatgc actgtgcagg aatggaacta ttccttgtat cacacttatt cttggaggca 1560

atctcatgca aggtaatgta ccaaatgaga tattcaatat tttccaacat tagactactt 1620

gagtactttc tcaagatcta actgagtgat cactactatt tgcttgtgac caaataggct 1680

taagagcatc gacaatcaaa atacctgtcc tccttgcaat catccttgtt cgatacattc 1740

tacttccagt aattggaatt tggattgtaa aaggagcaga ccaactaggg tttctcccac 1800

cagacccttt attcaagttt gtgctgatgg ttcagttcac attgccacct gctatgaaca 1860

ttggtaagca agccattgca atatttgcta acactttact gaaatagacc taacagaaca 1920

atgcagctca attcggcaac tgaacaagcc acaggagcac ttacatgtct acttgatgca 1980

aatgcaggta ccataaccca gctgtttgac gtcgccgagg cagagtgctc agtcatcttc 2040

ctgtggacat acttggtctg tgccctagca ctcactgtgt ggtctactgt ctacatgtgg 2100

atcttgtctt ga 2112

<210> 2

<211> 406

<212> PRT

<213> 森林草莓(Fragaria vesca)

<400> 2

Met Asn Leu Trp Thr Leu Phe Val Thr Ala Ser Ile Pro Val Leu Glu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Ile Thr Ala Leu Gly Ser Tyr Leu Ala Leu Asp Arg Val

20 25 30

Asn Leu Leu Gly Pro Asp Ser Arg Asn His Leu Asn Thr Ile Leu Phe

35 40 45

Tyr Val Cys Thr Pro Ala Leu Ile Gly Ala Asn Leu Ala Glu Thr Ile

50 55 60

Thr Tyr Glu Ser Leu Val Lys Leu Trp Phe Met Pro Val Asn Ile Phe

65 70 75 80

Leu Thr Phe Met Val Gly Ser Ile Phe Gly Trp Ile Leu Met Lys Leu

85 90 95

Thr Arg Thr Pro Pro His Leu Arg Gly Leu Val Leu Gly Cys Cys Ala

100 105 110

Ala Gly Asn Leu Gly Asn Leu Leu Leu Ile Ile Ile Pro Ala Val Cys

115 120 125

Glu Glu Ser Gly Ser Pro Phe Gly Asp Ala Asp Thr Cys Asp Thr Thr

130 135 140

Gly Thr Thr Tyr Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly Ala Ile Tyr Leu

145 150 155 160

Trp Thr Tyr Val Tyr Asn Ile Val Arg Ile Ser Ser Lys Thr Ser Ile

165 170 175

Gln Asp Pro Thr Gln Thr Thr Glu Ser Ser Ser Ser Thr Ser Gly His

180 185 190

Ile Ser Tyr Asn Glu Pro Leu Leu Ser Ile Glu Asp Asn Val Asp Gln

195 200 205

Ser Glu Leu Pro Ser Asn Val Ser Gln Gly Glu Val Lys Met Thr Arg

210 215 220

Leu Gly Lys Ile Lys Glu Trp Met Val Lys Met Asn Lys Lys Leu Asn

225 230 235 240

Leu Lys Thr Val Phe Ser Pro Ser Thr Ile Ala Val Ile Ile Gly Phe

245 250 255

Ala Val Gly Ile Ile Ser Pro Ile Arg Asn Leu Leu Ile Gly Asp Asp

260 265 270

Ala Pro Leu Ala Val Ile Asp Asp Ala Thr Ser Leu Leu Gly Asp Ala

275 280 285

Ala Ile Pro Leu Leu Thr Leu Ile Ile Gly Gly Asn Leu Val Lys Gly

290 295 300

Leu Arg Val Gly Gly Ile Gln Lys Ser Ile Leu Ile Gly Ile Ile Ile

305 310 315 320

Val Lys Tyr Val Ala Ala Pro Leu Thr Gly Val Leu Ile Val Lys Gly

325 330 335

Ala Val Lys Phe Gly Phe Val Ser Asn Asp Pro Leu Tyr Leu Phe Val

340 345 350

Leu Leu Leu Gln Phe Ala Val Pro Pro Ala Met Asn Met Gly Thr Ile

355 360 365

Thr Gln Leu Phe Arg Gln Gly Glu Ser Glu Cys Ser Val Ile Met Leu

370 375 380

Trp Thr Tyr Ile Phe Ala Ser Val Ala Leu Thr Phe Trp Cys Ala Phe

385 390 395 400

Phe Leu Trp Leu Val Glu

405

<210> 3

<211> 632

<212> DNA

<213> 森林草莓(Fragaria vesca)

<400> 3

ataagcttat gatttctttt ttcttacgaa ttttgcgtcc cacatcggta agcgagtgaa 60

gaaataactg ctttatatat ggctacaaag caccattggt caaggatctt ctggcaccca 120

agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag 180

tggcaccgag tcggtgcttt tttttttact ttaaattttt tcttatgcag cctgtgatgg 240

ataactgaat caaacaaatg gcgtctgggt ttaagaagat ctgttttggc tatgttggac 300

gaaacaagtg aacttttagg atcaacttca gtttatatat ggagcttata tcgagcaata 360

agataagtgg gctttttatg taatttaatg ggctatcgtc catagattca ctaataccca 420

tgcccagtac ccatgtatgc gtttcatata agctcctaat ttctcccaca tcgctcaaat 480

ctaaacaaat cttgttgtat atataacact gagggagcaa cattggtcag gcaacacttg 540

caaacatgag ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact 600

tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tt 632

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 森林草莓(Fragaria vesca)

<400> 4

cctttgggtg ccagaagatc ctt 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 森林草莓(Fragaria vesca)

<400> 5

ccctcatgtt tgcaagtgtt gcc 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttactagatc gggagcaccg gt 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgatgtagg agatcgatgc atg 23

Claims

1.利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体获得再生效率高的森林草莓新种质的方法，其特征在于，包括：

将FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入农杆菌GV3101中，用农杆菌侵染森林草莓外植体叶片；FvePILS5基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

将森林草莓愈伤组织诱导得到再生苗，经PCR筛选得到突变的再生植株，测序鉴定得到森林草莓pils5-1突变体，即为再生效率高的草莓新种质。

2.根据权利要求1所述的利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体获得再生效率高的森林草莓新种质的方法，其特征在于，所述PCR筛选所采用的引物序列为：

F2: 5’-CTGTTTGAGGTGGCATCTAT-3’,R2: 5’-TTACAACGCCTTCCTGATA-3’。

3.根据权利要求1所述的利用FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体获得再生效率高的森林草莓新种质的方法，其特征在于，所述PCR筛选程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，延伸温度为72 ℃，延伸时间为30s，设置35个循环，最后68℃延伸10min。

4. FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体在获得再生效率高的森林草莓新种质中的应用，FvePILS5基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

5.转染FvePILS5基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体的工程菌在获得再生效率高的森林草莓新种质中的应用，FvePILS5基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。