CN115992150A - GhbHLH093基因在调控植物开花期中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种GhbHLH093基因在调控植物开花期中的应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，GhbHLH093基因在早熟棉花的表达量比晚熟棉花的表达量高，GhbHLH093基因在棉花根中表达量最高，过表达GhbHLH093基因促进拟南芥开花和生殖生长发育；本发明从陆地棉中克隆出GhbHLH093基因，该基因通过构建过表达载体，在拟南芥中异源表达得到的过表达转基因株系相比于野生型开花提前，说明GhbHLH093基因在控制棉花开花期方面起到了重要的调控作用。

Description

GhbHLH093基因在调控植物开花期中的应用

技术领域

本发明属于植物开花技术领域，具体涉及一种GhbHLH093基因在调控植物开花期中的应用。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物和关系国民经济的战略重要物资。我国是全球最大的棉花生产国和消费国，在纺织服装的出口量也位居世界前列(黎玉华,2021).国家统计年鉴显示，虽然最大棉区新疆的种植面积有所上升，我国的其他棉区受到粮棉争地、种植效益降低和自然灾害的直接影响，使得整体棉花生产面积和产量有所下降.(王雪颖等,2022)早熟陆地棉生育周期短，生长发育快，利用其适宜晚春播、初夏播和夏播的特性，可以和冬季作物如冬小麦、油麦菜等实现粮棉轮作，通过优化作物种植指数，有效提高土地复种指数。此外，早熟棉的选育可以有效提高棉花的霜前结花率，在光热条件差和气温变化大的高纬度地区如辽宁、甘肃等地区提高棉花的品质，(喻树迅等,1991)棉花的早熟性既受到基因的调控，还存在环境的影响，研究表明，在苗期、蕾期、开花期、铃期、吐絮期、第一果枝节位、霜前花率等的遗传相关性大于环境相关性，可以作为棉花早熟性的指标(田菁华,1983；喻树迅等,1990)。因此，鉴定棉花开花相关基因，阐明其调控机制，并创制早熟棉优异种质资源，对于早熟棉品种的培育及产业化具有重要的意义。

开花是植物从营养生长转向生殖生长的标志，是植物可以完成受精作用，产生有性生殖器官的前提。植物的开花时间受到自然环境和遗传机制的共同作用，在种间和种内呈现出了丰富的多样性。目前植物开花的调控通路已经有了比较成型的框架。基于模式植物拟南芥的研究发现，开花时间受多种环境和内源途径调控，主要有6条调控通路，包括光依赖、自主、春化、赤霉素、温度以及年龄通路。(Fornara et al,2010；Kinoshita&Richter,2020)这些通路既彼此独立，又相互作用协调，形成一个既复杂又精密的网络，通过调控开花相关基因的表达，影响了植物的开花时间。

当植物开始花芽分化，花器官逐渐形成，表现为张开花冠花萼，露出雌蕊和雄蕊，具备可以受精结实的能力。植物开花调控机制由于植物品种形态和环境的不同而多种多样，但是整体的成花过程可以分为三个部分，分为成花诱导、成花启动和花发育三个过程。成花诱导是植物生殖生长代替营养生长成为生长中心的过程，成花启动是通过一定的内外信号刺激，植物的顶端分生组织开始花芽分化的启动，花发育是开始花芽分化之后，花芽逐渐分化成成熟花器官的过程。

陆地棉从花芽开始分化到植株停止生长，一直处于营养生长与生殖生长并进阶段。相对于一般双子叶植物，棉花的花器官发育很有特点，花器官除萼片、花瓣、花药和心皮外，在萼片外层还存在一轮苞叶(郑尚永等,2004)。由于陆地棉的花发育特点及结构上差异，推测其调控花发育的分子机制与拟南芥等模式植物有所不同。但目前对棉花花器官发育相关的分子生物学研究较少，其调控机制仍不清楚。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种GhbHLH093基因在调控植物开花期中的应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

GhbHLH093基因在调控植物开花期中的应用。

优选地，GhbHLH093基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，GhbHLH093基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，GhbHLH093基因在正向调控植物开花中的应用。

优选地，植物包括棉花和拟南芥。

优选地，GhbHLH093基因在早熟棉花的表达量比晚熟棉花的表达量高。

优选地，GhbHLH093基因在棉花根中表达量最高。

优选地，过表达GhbHLH093基因促进拟南芥开花和生殖生长发育。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明从陆地棉中克隆出GhbHLH093基因，该基因通过构建过表达载体，在拟南芥中异源表达得到的过表达转基因株系相比于野生型开花提前，说明GhbHLH093基因在控制棉花开花期方面起到了重要的调控作用。

附图说明

图1为本发明实施例2中GhbHLH093基因在早晚熟材料顶芽中的表达量图。

图2为本发明实施例2中GhbHLH093基因在不同棉花组织中的表达量图。

图3为本发明实施例3中GhbHLH093基因亚细胞定位图。

图4为本发明实施例3中GhbHLH093基因促进过表达转基因拟南芥提早开花图。

具体实施方式

本发明提供了一种GhbHLH093基因在调控植物开花期中的应用。

1.试验材料

(1)棉花材料

本实验选取的棉花材料为陆地棉早熟品种中棉所50和晚熟品种国欣棉11，其中，中棉所50和国欣棉11在开花时间和生育期存在着极显著差异(表1)，种植于中国农业科学院棉花研究所试验田(河南省安阳市白璧镇)，管理措施为正常大田管理。取样方式为三个棉花品种一叶期到五叶期的幼芽，置于液氮中，在提取样品RNA之前放置-80℃留存。

表1中棉所50和国欣棉11性状显著性检验

(2)试剂和耗材

限制性内切酶、修饰酶、PCR反应体系相关酶、同源重组酶、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小提试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司，荧光定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。

其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，卡那霉素等索莱宝生物有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α和农杆菌感受态购自擎科生物公司。

培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；

LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；

LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2MS固体培养基：1/2MS 22g/L，琼脂粉(agar powder)8g/L，蔗糖(sucrose)30g/L。

主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)、人工气候室。

实施例1：

从CottonFGD(http://www.cottonfgd.org/)上获得GhbHLH093(Gh_D01G1087)基因的CDS序列和编码的氨基酸序列，其开放阅读框为972bp，编码323个氨基酸，将该基因命名为GhbHLH093，并对其功能进行研究。

GhbHLH093开放阅读框序列(SEQ ID NO.1)为：

ATGGAGATCAATGAAGAAGGTTTGTTCGAAGAATTATTAGATGTGAGAGGAGAGAATTGGGACACAAATCCAACAGAAATGAGTGGGATTTTCTCTAATGGCACCTGGAACTTTGATGATCACAAACCTTCATCTACCTTTCTTCCATTGCCATTTCACCAAGATTATACTTACAACTTCAATCCAATCTACTGTCCCTTTGTTGATGAATTCTCTTCACAAAGCAACACATTTGATACACCCTCATTCCCACTCCAACAACAACATGATGACCAAGAATCCAGATTCCTTGTACATCAACTTCACAAGTTGGATGTTAAAGCTACTTGCAAAACCGAGCCTGTTCAATCACCTCACCCTGACAATCCAGCTAAAAAGTTGGAAAGGCAGCCTTCAAAGAATCTGATGGCTGAAAGAAGGAGACGAAAAAGGCTAAACGATCGCCTTTTGATGTTAAGATCCATTGTGCCTAAGATAAGCAAGGTAATTTACTGCAAAAATTCAGATTTCAAGCCTCTTATTACTGGTTTTATTTCCCATTTTTTGTCTCTTCAACAGATGGACCGTACATCCATACTTGGAGATACCATAGATTATACCAACGAACTCTTGGAGAGGATCAAAAGTTTGCAGCAAGAAGTTGAAGCAGGTTCAAACATGGATCATATTTTCAAGGGTGAAAAACCAAATGAAATGATAGTGAGAAATACACCCAAGTTTGAGGTTGAAAGAAGAAATGGGGATACAAGGATTGAGATTTGTTGCAGAGGGGATCCAGGATTGTTGTTATCAACCGTATCAACAATGGAAGCATCGGGGCTTGAGATTCAACAATGTGTCATTAGTTGTTTCAATGATTTTGCAATGCATGCTTCTTGCTCTGAGGATCTGGAACAGACAACATTAATGAGGTGTGAAGATATAAAGAAGGCATTATTTAGAAATGCTGGCTATGGTGGAAGATGTGTTTAG。

GhbHLH093编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)为：

MEINEEGLFEELLDVRGENWDTNPTEMSGIFSNGTWNFDDHKPSSTFLPLPFHQDYTYNFNPIYCPFVDEFSSQSNTFDTPSFPLQQQHDDQESRFLVHQLHKLDVKATCKTEPVQSPHPDNPAKKLERQPSKNLMAERRRRKRLNDRLLMLRSIVPKISKVIYCKNSDFKPLITGFISHFLSLQQMDRTSILGDTIDYTNELLERIKSLQQEVEAGSNMDHIFKGEKPNEMIVRNTPKFEVERRNGDTRIEICCRGDPGLLLSTVSTMEASGLEIQQCVISCFNDFAMHASCSEDLEQTTLMRCEDIKKALFRNAGYGGRCV。

实施例2：

研究表明，棉花花芽分化与早熟性状密切相关，是棉花由营养生长过渡到生殖生长的标志。直接影响开花时间。选取早熟品种中棉所50和晚熟品种国欣棉11，提取了一叶期到五叶期的花芽RNA，采用qRT-PCR技术对GhbHLH093表达量进行检测，发现该基因在早熟品种中棉所50一叶期到五叶期的表达量均显著高于晚熟品种国欣棉11。

为进一步探究GhbHLH093在不同组织中的表达模式，选取棉花品种中棉所50的8个不同组织对基因表达水平进行分析，结果显示GhbHLH093基因在根中表达量最高，在花器官中也有较高表达。GhbHLH093的表达量检测具体步骤如下：

<1>取样、磨样

选取中棉所50和国欣棉11的一叶期到五叶期的顶芽置于液氮中，使用研钵和研杵将其研磨至粉末，取大约1g样品于1.5mL离心管中。

<2>提取

RNA提取利用试剂盒FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit(诺维赞，中国南京)进行，具体步骤如下：

(1)实验在常温下进行，在加有植物组织的离心管中立即加入600μL的Buffer PSL(多酚多糖植物)，剧烈涡旋振荡30s，使样本与裂解液充分混合均匀，12,000rpm(134,00×g)离心5min，立即进行后续操作；

(2)取上清约500μL至FastPure gDNA-Filter Columns III(FastPure gDNA-Filter Columns III已放入收集管中)中，12,000rpm(13,400×g)离心30s，弃掉FastPuregDNA-FilterColumns III，收集滤液；

(3)向收集管中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇(约250μL，根据上清实际情况调整)，振荡混匀15s。将上述混合液转移至FastPure RNA Columns V，已放入收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心30s，弃滤液；

(4)向FastPure RNA Columns V中加入700μL的Buffer RWA，12,000rpm(13,400×g)离心30s，弃滤液；

(5)向FastPure RNA Columns V中加入500μL的Buffer RWB(使用前请检查是否已加入48mL无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30s，弃滤液；

(6)重复步骤(5)；

(7)将FastPure RNA Columns V放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2min；

(8)将FastPure RNA Columns V转移至新的RNase-free Collection Tubes1.5mL离心管中，向吸附柱膜中央悬空滴加30-100μL的RNase-free ddH₂O，12,000rpm(13,400×g)离心1min；

▲洗脱体积建议不少于30μL，体积过小会影响核酸回收效率；

▲以下步骤都可以帮助提高RNA产物浓度：RNase-free ddH₂O在65℃预热；滴加RNase-free ddH₂O后室温静置5min；将第一次洗脱液重新加入吸附柱进行洗脱；

(9)提取的RNA可直接用于下游实验或(-85)-(-65)℃保存。

<3>反转录cDNA的合成

反转录cDNA的合成利用试剂盒

II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)(诺维赞，中国南京)进行，可以分为基因组gDNA的去除和RNA的反转录两部分，反应在冰上进行，反应步骤如下：

(1)基因组gDNA的去除

表2反应体系配制

用移液器轻轻吹打混匀。42℃、2min。

(2)配制逆转录反应体系

表3

用移液器轻轻吹打混匀，将上述混合溶液20μL在PCR仪中50℃、15min，85℃、5s。产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用。

<4>荧光定量PCR

(1)利用Oligo 7软件设计GhbHLH093基因的特异性引物，用棉花His3(AF024716)基因为内参基因。

表4

(2)荧光定量PCR

利用Cwbio(China)的UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒和AppliedBiosystems 7500仪器完成。具体过程如下：

1)将上述的cDNA原液稀释5倍；

2)反应体系的配置(冰上操作)：

表5

将配置好的体系混匀，离心至无气泡，然后利用Applied Biosystems 7500进行荧光定量PCR：按照两步法设置PCR程序：预变性：95℃，2min；95℃，5s；60℃，34s(这一步收集荧光信号)，这两步设置40个循环；最后溶解曲线分析：95℃，15s；60℃，20s；95℃，15s。利用Microsoft Excel 2019软件处理数据，计算基因的表达量，Origin 2022软件绘图。

<5>GhbHLH093定量结果分析

荧光定量的结果数据按照2-ΔΔCt(Livak法)计算，得到GhbHLH093的相对表达量。由图1可以看到GhbHLH093在早熟品种一叶期到五叶期的表达量均高于晚熟品种，且呈现显著差异；图2组织表达模式显示GhbHLH093在根和花器官中均有较高表达，说明该基因与棉花早熟性有关。

实施例3：

农杆菌介导的烟草瞬时表达和拟南芥异源表达

亚细胞定位与蛋白质的功能密切相关。在研究蛋白质时，确定它们在细胞中的位置通常是第一步。为验证亚细胞定位网站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)预测结果的准确性，构建PBI-GFP-GhbHLH093重组载体并在烟草中瞬时表达GhbHLH093蛋白。发现GhbHLH093蛋白定位在细胞核中。将GhbHLH093 CDS序列全长连接PBI-121载体，构建35S启动子载体。将35S::GhbHLH093重组载体通过拟南芥花序侵染法侵染拟南芥，通过对后代种子进行阳性筛选和纯化加代，得到T3代纯系植株。对后代表型和表达量分析，发现过表达GhbHLH093促进拟南芥早花。

<1>基因引物设计

根据同源重组引物设计原则，使用Oligo 7软件设计特异性引物，扩增GhbHLH093基因编码区全长。根据该基因CDS序列，在起始密码子ATG和终止密码子处添加相应酶切位点序列，使目的基因片段与酶切后的线性化载体具有相同末端序列。35S启动子载体酶切位点选择XbaI和SacI；用于亚细胞定位的CDS序列去除终止密码子设计特异性引物，GFP载体酶切位点为XbaI和SpeI，所用cDNA模板为陆地棉TM-1。

35S::GhbHLH093特异性引物序列如下：

GhbHLH093-GFP特异性引物序列如下：

<2>基因克隆PCR体系、程序与产物检测

(1)反应在冰上进行，根据试剂盒Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺维赞，南京)设计反应体系如下：

表6

(2)PCR反应程序：

(3)PCR产物的检测

取2μL的PCR产物，加入2μL的5×Loading Buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测条带大小是否972bp左右。

(4)PCR产物的胶回收

采用Vazyme产物纯化试剂盒，步骤如下：

1)DNA电泳结束后，在紫外灯快速切下含有目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。秤取凝胶中粮(去除空管的重量)，100mg凝胶等同于100μL体积，作为一个凝胶体积；

2)加入等体积的Buffer GDP。50-55℃水浴7-10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶；

3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2ml收集管中，把≤700μL溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60s。若溶胶体积大于700μL，把吸附柱置于收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60s；

4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μL的Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000×g离心30-60s；

5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μL的Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000×g离心30-60s；

6)重复步骤5)；

7)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。12,000×g离心2min；

8)将吸附柱置于1.5mL灭菌的离心管中，加入20-30μL的灭菌水至吸附柱中央，放置2min。12,000×g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。

<3>GhbHLH093-GFP和35S::GhbHLH093植物表达载体的构建

(1)PBI121质粒的双酶切及胶回收

将PBI121质粒用XbaI和SacI双酶切，电泳回收PBI121载体的大片段产物。酶切反应体系如下：

表7

(2)PCR胶回收产物和酶切PBI121质粒的连接

把带有接头的PCR产物和双酶切的PBI121质粒用诺唯赞同源重组酶试剂

 One Step Cloning Kit进行连接，连接反应如下：

体系配置于冰上进行：

表8

体系完成后，吹打混匀各组分，37℃反应30min，立即冰水浴5min，转化或者-20℃保存。

(3)连接产物转化大肠杆菌

1)向连接反应体系中加入100μL大肠杆菌DH5a感受态，冰浴30min；

2)42℃水浴热激45-90s；

3)冰浴2min；加入900μL无抗性的LB液体培养基，37℃，190rpm，孵育1h；

4)离心收菌，4000rpm，3min，弃上层上清，留约100μL混匀后涂布含卡那抗性的LB平板；

5)37℃，恒温培养过夜。

(4)阳性克隆的检测及测序

1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有Kan的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8h；

2)菌落PCR验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到尚亚生物科技有限公司测序，每个序列测3个重复。

(5)阳性菌液的保存

菌液PCR验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-80℃保存。返还测序正确的质粒用于转农杆菌。

(6)转化农杆菌

利用冻融法转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，具体转化过程如下：

1)-80℃农杆菌融化，冰水混合状态插入冰中；

2)100μL感受态中加入0.01-1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min，液氮5min，37℃、5min，冰浴5min；

3)加入700μL无抗性的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h；

4)取100-150μL菌液于含有卡那、利福平、链霉素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2-3天；

5)挑选阳性克隆，在加有抗性的LB液体培养基上28℃培养48h，菌液PCR验证条带正确的菌液甘油保存终浓度在20％左右，-80℃保存备用。

<4>农杆菌介导的烟草瞬时表达

烟草瞬时表达步骤如下：

(1)烟草培养：播种烟草种子若干，长日照条件下培养的烟草，培养一个月用作实验；

(2)农杆菌活化：取-80℃保存的GhbHLH093-GFP农杆菌菌液20μL，接种到1mL的LB液体培养基(加入对应的抗生素：卡纳霉素、利福平和链霉素)中，28℃，180rpm，培养14-18h；

培养至菌液OD600值约在1.0-1.5之间(约18-20h)，5000rpm，离心8min，弃上清，收集菌体；

(3)重悬：用10mM MgCl₂、10mM MgCl₂(含120uM AS，PH＝5.8)悬浮液重悬菌体，调OD600至0.8左右；

(4)注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1mL注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注；

(5)培养：将注射完成的烟草植株弱光培养2天，即可观察；

(6)观察：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

注：共定位时，将marker质粒转化农杆菌，和构好的载体质粒农杆菌一起悬浮操作，在注射前按1:1比例混合，然后注射烟草叶片。

<5>亚细胞定位结果

激光共聚焦显微镜观察发现，GhbHLH093融合蛋白的GFP信号在烟草细胞中瞬时表达后与红色细胞核锚定标记蛋白NLS-mCherry重合，如图3，证实GhbHLH093蛋白的核定位。

<6>农杆菌介导的拟南芥花序侵染

(1)拟南芥培养

长日照条件(光照16h，黑暗8h)下培养的哥伦比亚野生型拟南芥，选取5周龄左右，生长健壮的株系，剪去角果，侵染的前一天浇水保证拟南芥的状态和湿度。

(2)拟南芥花序侵染

1)菌液活化：取-80℃保存的对应重组载体的农杆菌菌液20μL，接种到1mL的LB液体培养基(加入对应的抗生素：卡纳霉素、利福平和链霉素)中，28℃，180rpm，培养14-18h；

2)扩摇：取活化后的对应菌液200μL加入到50mL的LB液体培养基(加入对应的抗生素)；28℃，180rpm，培养至菌液OD600值约在1.2-1.6之间(约18-20h)，5000rpm，离心8min，弃上清，收集菌体；

3)侵染转化的介质配制：1/2MS减半、6％蔗糖、0.02％的SilwetL-77，用NaOH将pH调至5.6-5.7；

4)用转化介质悬浮上述菌体，将OD600调至0.6-0.8；

5)浸染：将拟南芥花序(主要是未开放的花苞)置于转化介质中30-50s，浸染后，将拟南芥在弱光或者避光条件下平放24h；

6)将处理后的拟南芥放置正常条件下培养，并在侵染后的一周内每天给拟南芥叶片喷水；为了提高转化效率，可在约一周后进行重复侵染；

7)待成熟后，收获拟南芥种子，即为转基因的T0代种子。

<7>转基因拟南芥植株的表型鉴定

(1)将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上，然后进行4℃春化2天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长。

(2)将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取DNA用PCR进行检测。

检测时所用引物为：

35S-F GACGCACAATCCCACTATCC(SEQ ID NO.11)

GhbHLH093-R GACGGCCAGTGAATTCTTCAGCAGAAAGTTGTTTAGTATTG

(SEQ ID NO.12)

(3)每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。T3代株系做qRT-PCR检测，荧光定量验证的过程如下：

提取RNA，反转录成cDNA，GhbHLH093荧光定量的引物

GhbHLH093-F ACGAAAAAGGCTAAACGATCGCC(SEQ

ID NO.13)

GhbHLH093-R ACCTGCTTCAACTTCTTGCTGC(SEQ ID

NO.14)

冰上配制qRT-PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。荧光定量验证结果证实GhbHLH093基因在转基因植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥，如图4。

(4)将转基因T3代植株与非转基因植株进行消毒培养于1/2MS培养基上，4℃春化两天后，10天左右拟南芥幼苗长出真叶即移到小花盆里生长，同等条件下种植栽培，表型观察发现非转基因拟南芥开花明显晚于过表达转基因拟南芥(图4)；说明过表达GhbHLH093明显促进拟南芥开花和生殖生长发育。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (8)

1.GhbHLH093基因在调控植物开花期中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述GhbHLH093基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GhbHLH093基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述GhbHLH093基因在正向调控植物开花中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物包括棉花和拟南芥。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述GhbHLH093基因在早熟棉花的表达量比晚熟棉花的表达量高。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述GhbHLH093基因在棉花根中表达量最高。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：过表达所述GhbHLH093基因促进拟南芥开花和生殖生长发育。

Images