CN114573671B

CN114573671B - 闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA、花器官特异性表达启动子PFBA及其应用

Info

Publication number: CN114573671B
Application number: CN202210243210.8A
Authority: CN
Inventors: 管荣展; 万书贝; 杨茂; 倪飞
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2042-03-11
Also published as: CN114573671A

Abstract

本发明为基因工程技术领域，具体涉及一个闭花授粉性状控制基因BnaC03.FBA与一个关键的启动子PFBA及两者在闭花授粉性状遗传调控中的应用。本发明首次提供了基因BnaC03.FBA在油菜闭花授粉性状形成中的应用。本发明中启动子PFBA、闭花授粉性状控制基因BnaC03.FBA、其编码产物BnaC03.FBA蛋白、含有基因BnaC03.FBA片段的表达载体可以用于生产具有闭花授粉性状的转基因植物，以获得新的种质资源，具有广阔的应用前景。

Description

闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA、花器官特异性表达启动子PFBA及其应用

技术领域

本发明为基因工程技术领域，具体涉及闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA、花器官特异性表达启动子PFBA及其应用。

背景技术

闭花授粉性状植物在花期，花瓣始终闭合，包裹着雌蕊与雄蕊，使授粉行为在封闭的空间内完成。闭花授粉性状有助于作物育种过程中的种质保纯和新型观赏园艺花卉形态的培育。

目前，闭花授粉性状控制基因及其分子机制的研究还比较少。AtMYB21和AtMYB24是拟南芥中的两个R2R3-MYB转录因子，双突变体myb21myb24的花无法开放，表现出闭花授粉性状的表型(Mandaokar et al.,2006)。通过RNAi技术，干扰开花授粉的矮牵牛与烟草中AtMYB21/24的同源基因，转基因株表现出闭花授粉性状(Colquhoun et al.,2011)。大麦闭花授粉性状控制基因Cleistogamy1(Cly1)编码1个APETALA2转录因子(AP2)。该基因包含一个AP2保守结构域与一个miR172的靶标位点。该基因突变体cly1表现出闭花授粉性状的表型(Nair et al.,2010)。Sherif等(2015)通过桃子开花授粉和闭花授粉性状品种花瓣基因表达检测分析，发现茉莉酸在闭花授粉性状形成中起到了调控作用。在开花授粉的烟草中过表达基因PpJAZ1(JASMONATE-ZIM-DOMAIN PROTEIN 1)，转基因烟草出现闭花授粉性状的表型也验证了茉莉酸响应基因调控闭花授粉性状(Sherif et al.,2015)。在油菜中，闭花授粉性状控制的基因Bn-CLG1A-1D编码一个在真核生物中高度保守的E3泛素连接酶。该基因单氨基酸的突变(P325L)，致使该蛋白负调控角质的合成与装载，抑制了花瓣的生长发育，导致闭花授粉性状的形成(Lu et al.,2012)。在拟南芥中，两个角质合成相关基因，分别编码细胞色素P450蛋白77A6(CYP77A6)和甘油三磷酸酰基转移酶6(GPAT6，glycerol-3-phosphate acyltransferase 6)，它们的功能缺失突变体cyp77a6与gpat6花器官无法开放(Li et al.,2009)。

尽管植物学家对闭花授粉性状遗传和种质的挖掘育种了一些积极的探索，但相关育种工作还没有取得突破，还需要继续挖掘控制闭花授粉性状的新基因，为育种工作提供基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA、花器官特异性表达启动子PFBA及其应用，本发明首次提供了BnaC03.FBA在闭花授粉性状形成中的应用，本发明的基因BnaC03.FBA过表达载体可以应用在转化双子叶植物油菜产生闭花授粉性状转基因植物中。

为解决上述技术问题，本发明提供一种闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA，所述基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.1所示；该蛋白质由371个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第9-44位氨基酸残基与110-342位氨基酸残基为保守序列。

进一步地，所述基因BnaC03.FBA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，由1116个碱基组成，编码具有SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第25-132位碱基与第328-1026位碱基编码保守序列。

进一步地，所述基因的基因组全长序列如SEQ ID NO：3所示，由1361个碱基组成。

本发明还提供了包含上述闭花授粉性状调控基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

本发明还提供了花器官特异性表达启动子PFBA，所述启动子的序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了包含上述闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA与上述花器官特异性表达启动子PFBA的过表达载体构建方法，包括如下步骤：

设计引物，PCR扩增BnaC03.FBA基因与PFBA启动子片段，将扩增的基因与启动子片段连接到pEasy BluntSimple载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素筛选获得入门克隆，提取质粒，获得含BnaC03.FBA基因的pEasy Blunt Simple载体；将含BnaC03.FBA基因的pEasyBlunt Simple载体、含PFBA启动子的pEasyBlunt Simple载体和pBI121载体通过重组构建载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素筛选得到成功重组的PFBA::BnaC03.FBA载体。

本发明还提供了上述的过表达载体在闭花授粉性状转基因植物中的应用。

进一步地，所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物为油菜。

进一步地，包括如下步骤：

利用农杆菌介导的转基因方法将所述过表达载体导入植物受体，获得转化植株；

借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株；

将转基因植株进行种植并观察其性状；

借助RT-PCR分析转基因植株和对照植株中闭花授粉性状调控基因的表达。

本发明在对闭花授粉种质进行控制基因的定位的研究工作中，通过分子标记构建连锁图谱、基因克隆比对和基因组序列的测序比对，发现BnaC03.FBA上游存在一个29.8kb的染色体片段的倒位和微型反向重复转座子的插入，造成了BnaC03.FBA启动子序列的改变。基于前期的工作基础，本发明发现控制闭花授粉性状的基因BnaC03.FBA，这个基因在新的启动子PFBA驱动下，在花瓣中的超表达以后抑制花瓣的展开，从而形成闭花授粉性状。

本发明采用现有的植物表达载体(pBI121)构建含有启动子PFBA与基因BnaC03.FBA的过表达载体。携带PFBA::BnaC03.FBA载体可通过农杆菌介导常规生物学方法转化到植物细胞或组织中，被转化的宿主植物可以是油菜、拟南芥等双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(潮霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的获得转基因植物的方法，是将上述植物蛋白的编码基因BnaC03.FBA导入植物中，使用启动子PFBA驱动，得到闭花授粉性状的转基因油菜。

本发明发现基因BnaC03.FBA是闭花授粉性状的成因基因，通过将这个基因在花器官中进行了过表达，从而获得闭花授粉性状的油菜。

本发明生产的转基因植株具有闭花授粉性状的表型，从而导致自花授粉，从而利于种子保纯，还可用于不同形态观赏花卉的培育。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1)本发明首次证明了油菜BnaC03.FBA基因在闭花授粉性状形成中的作用，该基因的生物学功能验证对于花开放的分子机制研究有重要的参考意义。

2)本发明首次提供了BnaC03.FBA在闭花授粉性状形成中的应用，本发明的基因BnaC03.FBA过表达载体可以应用在转化双子叶植物油菜产生闭花授粉性状转基因植物中的应用。本发明生产的植株具有闭花授粉性状的表型，不仅可用于种子保纯，减少遗传漂变，还可用于不同形态观赏花卉的培育。

附图说明

图1：为BnaC03.FBA蛋白质序列分析图；

图2：为实施例2中线性化处理的35S::BnaC03.FBA载体图谱；

图3：为实施例2中线性化处理的PFBA::BnaC03.FBA载体图谱；

图4：PFBA::BnaC03.FBA转基因油菜与野生型的花瓣形态；

图5：35S::BnaC03.FBA转基因油菜与野生型的花瓣形态；

图6：BnC03.FBA在35S::BnaC03.FBA与pFBA::BnaC03.FBA转基因株花瓣中表达分析。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。下述实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及实验材料均为常规生化试剂。

实施例1：闭花授粉性状控制基因BnaC03.FBA及其启动子PFBA的克隆

一、闭花授粉性状控制基因BnaC03.FBA的发现与克隆

克隆闭花授粉控制基因，基因编号为BnaC03G0156800ZS，该基因编码一个包含FBA(F-box associated domain)结构域的F-box蛋白，将基因命名为BnaC03.FBA，基因组全长序列见SEQ ID NO.3。根据已公开的甘蓝型油菜中双11参考基因组(http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/)设计用于扩增闭花授粉性状控制基因的引物，上游引物P1：5’-ATGGAGAACTCGGACTTTGC-3’和下游引物P2：5’-TTAAATGTAGATGCTTGGTT-3’；提取甘蓝型油菜(Brassica napus)新鲜叶片的总RNA，然后用Reverse Transcription试剂盒(Takara)反转合成cDNA，以所合成的cDNA为模板，PCR扩增基因，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，回收纯化，将回收产物连入载体pEasy Blunt Simple中，经热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养10h，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO.2的核苷酸序列，由1116个碱基组成，命名为基因BnaC03.FBA。基因BnaC03.FBA编码具有序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明中BnaC03.FBA基因编码的蛋白属F-box家族，序列表中SEQ ID NO.1的序列自氨基端(N端)第9-44位氨基酸残基为F-box结构与110-342位氨基酸残基为FBA1(F-boxassociated domain 1)结构域。为该蛋白的保守序列，如图1所示。

二、启动子PFBA的克隆

根据闭花授粉性状种质NJAU-CP7130的基因组序列的测序信息，克隆基因BnaC03.FBA上游2000bp的序列作为启动子，上游引物P3：5’-TAATAATCACAGGAATGTTGTAAGC-3’和下游引物P4：5’-TGTGTTTCTTTTCTATCTCAGATGT-3’；提取甘蓝型油菜闭花授粉性状种质NJAU-CP7130新鲜叶片的总DNA为模板，PCR扩增基因，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，回收纯化，将回收产物连入载体pEasy Blunt Simple中，经热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养10h，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO.4的核苷酸序列，由2000个碱基组成，命名为PFBA。

实施例2：含BnaC03.FBA基因的植物过表达载体的构建

一、35S启动子驱动基因BnaC03.FBA过表达载体的构建

使用Xba I酶切的过表达载体pBI121。通过在引物5'端引入载体插入位点同源序列，使得BnaC03.FBA基因的扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列(15bp)。基因克隆引物分别为:上游引物P5(5’-AGAACACGGGGGACTCTAGAATGGAGAACTCGGACTTTGC-3’)，下游引物P6(5’-CCACCCGGGGATCCTCTAGATTAAATGTAGATGCTTGGTTTGTG-3’)。用引物P5和P6对实施例1克隆得到的序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，按照说明进行目的条带回收并对其进行纯化。将扩增纯化产物和酶切后的过表达载体pBI121使用重组试剂盒(诺唯赞公司)进行重组。再将重组产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养，提取质粒，对重组质粒用限制性内切酶Xba I进行酶切鉴定，与预期结果相符，再用引物P1和P2做进一步的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到了1116bp的DNA片段，与预期结果一致，表明得到了插入序列及位置正确的含有BnaC03.FBA的35S驱动的植物表达载体，命名为35S::BnaC03.FBA。

二、PFBA启动子驱动基因BnaC03.FBA过表达载体的构建

使用限制性内切酶Hind III与Xba I酶切的过表达载体pBI121，获得线性载体序列。通过在引物5’端引入同源序列，使扩增的启动子PFBA与基因BnaC03.FBA之间以及与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列(15bp)。基因扩增引物分别为:上游引物P7(5’-TGAGATAGAAAAGAAACACAATGGAGAACTCGGACTTTGC-3’)，下游引物P6(5’-CCACCCGGGGATCCTCTAGATTAAATGTAGATGCTTGGTTTGTG-3’)。启动子PFBA扩增引物分别为上游引物P8(5’-ACCATGATTACGCCAAGCTTACAAATTTTCACCTTCGTTCAA-3’)，下游引物P4(5’-TGTGTTTCTTTTCTATCTCAGATGT-3’)。用引物P7和P6对实施例1克隆得到的序列表中SEQ IDNO.2的核苷酸序列进行PCR扩增，用引物P8和P4对实施例1克隆得到的序列表中SEQ IDNO.4的核苷酸序列进行PCR扩增；反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，按照说明进行目的条带回收并对其进行纯化。将扩增纯化后的基因与启动子序列和酶切后的过表达载体pBI121使用重组试剂盒(诺唯赞公司)进行重组。再将重组产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养，提取质粒，对重组质粒用限制性内切酶Hind III与Xba I进行酶切鉴定，与预期结果相符。用引物P1和P2做进一步的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到了1116bp的DNA片段，与预期结果一致，用引物P3和P4做进一步的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到了2000bp的DNA片段，与预期结果一致，表明得到了插入序列及位置正确的PFBA启动子驱动BnaC03.FBA表达的植物表达载体，命名为PFBA::BnaC03.FBA。

实施例3：BnaC03.FBA过表达转基因油菜的获得

将实施例2构建的植物载体PFBA::BnaC03.FBA和35S::BnaC03.FBA用热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，将其涂布于含卡那霉素和利福平的LB抗性平板上，在28℃下培养12h，挑取长出的农杆菌单菌落，筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆再接种于含卡那霉素和利福平的20ml YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下培养2天，然后，再按体积比2％的接种量菌将菌液接种于含卡那霉素和利福平的300ml YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下培养18小时，至OD600＝0.8-1.2。培养结束后，5000rpm离心20分钟后收集菌体，再将菌体悬浮于250ml含有5％蔗糖，0.1％Silwetl-77的溶液中，至OD600＝0.6-1.0。最后，将菌液转于250ml烧杯中，将纯和的开花材料(已授粉结束的甘蓝型油菜的花去掉)，再将植株倒置于烧杯中，使其花序完全侵入菌液中，为提高转化效率，一周后再重复一次。待收获期，收获浸染的种子，所得种子种植到含有卡那霉素的1/2MS培养基中，经卡那霉素和PCR鉴定筛选。具体过程为：将转化后的T0代油菜种子放入2mL的离心管中(带盖)，首先用70％的无水乙醇消毒3min；再使用5％的次氯酸钠溶液消毒10min；种子消毒后对种子表面用无菌水清洗5次；随后加入适量的Agar溶液(0.1％)，使消毒后的种子悬浮起来；然后将种子点播到含有卡那霉素(50ng/mL)的1/2MS固体培养基中，并以受体的开花种质为对照，在24℃光照培养室生长一周，将能长出的植株移栽到营养土中继续生长。待植株长到4片真叶时，提取DNA进行PCR鉴定，利用载体序列开发的上游引物(CAAAGCAAGTGGATTGATGTGA)与下游引物(CCCACACTTTGCCGTAATGA)进行PCR扩增(含有目的基因)，对扩增产物进行胶回收、测序。测序正确的阳性植株继续放置光照培养箱中培养，观察表型，待植株成熟后收获T1代种子。得转基因植株。转基因植株的种子收集并与开花的对照材料种植在同一条件下(培养箱的温度为24/18℃，湿度为70％，光照为30000Lux)，以甘蓝型油菜材料为对照。观察转基因植株和对照组的生长情况，经过加代，定量qRT-PCR验证，具体过程为：将T1代种子播种在培养土中，进行DNA提取和PCR鉴定，选择单拷贝的阳性植株(阳性：非阳性＝3:1)移栽到营养土中，植株成熟后收获T2代种子。在营养土中播种T2代种子，待植株生长到5叶期时，取转基因植株叶片进行DNA提取，并对叶片DNA进行PCR扩增，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压设置120V，时间25min，使用凝胶成像仪拍照并分析目的条带。采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，按照说明进行目的条带回收并对其进行纯化。回收产物连入pEasy BluntSimple克隆载体，随后使用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，菌液PCR验证后送南京擎科生物科技有限公司进行测序。最后将T2代阳性转基因植株的种子进行收获并种植，利用上述同样的方法进行PCR鉴定，筛选出表型一致，基因型一致(无杂合基因型)的纯合T3代转基因株系，用于后续的实验分析。

在PFBA::BnaC03.FBA和35S::BnaC03.FBA载体转化的T3代转基因系，分别随机选择三个株系进行定量分析和表型观察。两个株系种子收获并种植在光照培养箱中生长，在同样条件下以纯和开花种质为对照，进行表型观察。PFBA::BnaC03.FBA转基因植株的花瓣是闭合的(图4)。用35S驱动的BnaC03.FBA基因，遗传转化结果表明，转基因单株的花瓣出现了闭合的迹象(图5)，但是不是完全的闭花授粉性状。

对转基因系的表达水平进行了分析。对纯合PFBA::BnaC03.FBA和35S::BnaC03.FBA载体转化的T3代转基因系和纯和对照开花种质植株的花瓣进行RNA的提取，再反转录合成cDNA序列，反转录得到的cDNA稀释20倍，可直接用于后续的qRT-PCR反应。根据实时荧光定量qRT-PCR的引物要求设计引物，利用Primer Premier 5软件进行BnaC03.FBA定量引物设计，上游引物(5-3)：AGGGTTTGATGAGTTGTTGGAG；下游引物(5-3)：GCGTTGTGTGTGCCGAGG。以油菜看家基因Actin为内参，再以SYBR Green作为qRT-PCR的荧光染料，通过稀释BnaACTIN和BnaC03.FBA两对引物和叶片cDNA模板浓度，设置合适的退火温度(60℃)，使BnaACTIN基因(内参基因)和BnaC03.FBA基因的扩增效率达到90-110％，Ct值在15-30之间。在Bio-Rad CFX96仪器上进行qRT-PCR反应，采用两步法扩增，使用20μL的反应体系。根据转基因材料和对照的qRT-PCR的结果进行比较，从图6可以看出，BnaC03.FBA基因在PFBA::BnaC03.FBA和35S::BnaC03.FBA转基因植株中的表达量要显著高于对照。但是，BnaC03.FBA基因在PFBA::BnaC03.FBA转基因植株中的表达量要显著高于35S::BnaC03.FBA转基因植株材料中的表达量，说明PFBA驱动的BnaC03.FBA基因在花瓣中的超量表达是形成闭花授粉性状的必要条件，35S启动子驱动基因的表达量还不是足够大。

此外，以不含基因BnaC03.FBA的空载载体为对照，按上述相同的方法进行转基因，并对植株表型观察，空载对照的转基因植株与对照开花系表型类似，无表型变化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA、花器官特异性表达启动子PFBA及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Asn Ser Asp Phe Ala Met Met Pro Glu Glu Leu Lys Asp Val

1 5 10 15

Ile Arg Ser Lys Leu Pro Pro Lys Ser Leu Ala Arg Cys Ile Val Val

20 25 30

Ser Lys Glu Trp Glu Arg Ser Ile Gly Asp Arg Ser Leu Gln His Ala

35 40 45

His Tyr Gln Glu Ser Lys Lys Gln Pro Met Leu Val Leu Leu Arg Leu

50 55 60

Cys Gln Arg Arg Val Trp Asn Asp Gly Glu Pro Gln Tyr Glu Ser Phe

65 70 75 80

Asn Thr Val Asn Gln Glu Arg Pro Gln Pro Ile Ala Asp Pro His His

85 90 95

Val Thr Thr Leu Pro Asn Ser Asp Phe Ala Val Thr Ser Gly Pro Ile

100 105 110

Arg Gly Leu Leu Cys Leu His Ser Asp Arg Tyr Leu Val Leu Cys Asn

115 120 125

Pro Ala Ile Arg Lys Cys Leu Thr Val Leu Glu Phe Glu Pro Glu Pro

130 135 140

Pro Gln Thr Arg Lys Arg Phe Asn His Arg Gly Phe Leu Phe Gly Phe

145 150 155 160

Asp Glu Gln Ser Lys Ala Phe Lys Val Ile Lys Thr Glu Ala Gly Asp

165 170 175

His Asn Leu Pro Trp Arg His Glu Ile Phe Thr Val Gln Pro Gly Glu

180 185 190

Val Ile Trp Arg Gln Ile Asp Cys Pro Arg Pro Tyr Thr Pro Ile Thr

195 200 205

Asn Ser Leu Ser Ile Glu Gly Asn Val Tyr Leu Gly Ala Val His Asn

210 215 220

Lys Thr Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Thr Thr Glu Ser Ile Leu

225 230 235 240

Ile Thr Glu Leu Pro Thr Ala Phe Leu Leu Lys Leu Gly Ile Thr Lys

245 250 255

Leu Arg Ser Tyr Asn Gly Gln Pro Cys Leu Val Ser Asp Ser Ala His

260 265 270

Glu Leu Ala Thr Thr Gly Lys Phe Lys Ile Cys Val Lys Asp Lys Asp

275 280 285

Ser Gly Leu Trp Gly Glu Arg Glu Val Glu Val Lys Gly Trp Ser Glu

290 295 300

Lys Val Thr Gly Ser Tyr Ser Phe Glu Gly Thr Ile Pro Ser Gly Glu

305 310 315 320

Leu Val Phe Ala Lys Lys Lys Leu Glu Thr Gly Phe Gln Met Leu Leu

325 330 335

Tyr Tyr Asp Pro Arg Met Glu Thr Phe Asn Glu Tyr Gln Ile Gln Thr

340 345 350

Glu Glu Asp Tyr Asp Ser Ala Glu Ile Phe Leu Asn His Lys Pro Ser

355 360 365

Ile Tyr Ile

370

<210> 2

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagaact cggactttgc aatgatgccc gaagagttga aggatgtcat tcgttcaaaa 60

ttgcctccca agtctctggc aaggtgtatt gtggtttcta aggaatggga gaggtcgatt 120

ggggacagaa gcctccagca tgcgcattac caagagtcca agaaacaacc catgcttgtt 180

cttctgaggc tctgtcaacg aagagtctgg aacgacggcg aacctcaata cgagtcgttc 240

aataccgtca accaagagcg cccgcagccg atcgctgatc ctcaccatgt gacaacgctt 300

ccaaactcag atttcgccgt cacgtccgga cctataagag gcctcctctg cctgcattcc 360

gacaggtacc tcgtcctctg caatccggcg atcagaaaat gtctgacggt gctcgagttc 420

gagccggagc cgccgcagac ccgaaagaga ttcaaccacc gaggcttttt atttggattt 480

gacgaacagt ccaaggcttt taaagtcata aagacagagg ccggtgacca caatttacct 540

tggcgccatg agatattcac cgttcaaccc ggagaggtca tatggcgtca gatcgactgt 600

cctcgtccct acacgccaat caccaactcg ctctccattg aaggtaacgt gtacctgggt 660

gcggtgcata acaagacatg tcttgcagtt actgtgaatt tgactacaga gtcgatcttg 720

attacggagc tgcctacggc tttcctactt aagcttggta tcaccaaact gagaagttac 780

aatggccaac catgtttagt ttccgattct gcgcatgagt tagctactac gggaaagttt 840

aagatctgtg taaaggacaa ggattctgga ctctgggggg agagagaggt agaggttaag 900

ggttggagcg agaaggtcac tggctcgtat tcctttgaag gaaccatacc gtctggtgaa 960

ttggtcttcg caaagaagaa gctcgagact ggttttcaga tgttactcta ctacgaccct 1020

cgcatggaaa ccttcaacga gtatcagatt cagacggagg aggattatga ctctgcggag 1080

atcttcctta accacaaacc aagcatctac atttaa 1116

<210> 3

<211> 1361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagaact cggactttgc aatgatgccc gaagagttga aggatgtcat tcgttcaaaa 60

ttgcctccca agtctctggc aaggtgtatt gtggtttcta aggaatggga gaggtcgatt 120

ggggacagaa gcctccagca tgcgcattac caagagtcca agaaacaacc catgcttgtt 180

cttctgaggc tctgtcaacg aagagtctgg aacgacggcg aacctcaata cgagtcgttc 240

aataccgtca accaagagcg cccgcagccg atcgctgatc ctcaccatgt gacaacgctt 300

ccaaactcag atttcgccgt cacgtccgga cctataagag gcctcctctg cctgcattcc 360

gacaggtata tttcaactta atagaacatt ttttaaagtc cattctttta ataatagaca 420

ttagcgcgca attgctgtta aaaagaaact aattaatcca tttaatactt ttagatagga 480

gtttagttga tatgatgatt aatttattat aaacaaattc tgtaagatat cgagatgctg 540

ttatatatgt gtaaatgtga agactaatgt cttatatgtg tgtgtatata tatatatata 600

catatattag gtacctcgtc ctctgcaatc cggcgatcag aaaatgtctg acggtgctcg 660

agttcgagcc ggagccgccg cagacccgaa agagattcaa ccaccgaggc tttttatttg 720

gatttgacga acagtccaag gcttttaaag tcataaagac agaggccggt gaccacaatt 780

taccttggcg ccatgagata ttcaccgttc aacccggaga ggtcatatgg cgtcagatcg 840

actgtcctcg tccctacacg ccaatcacca actcgctctc cattgaaggt aacgtgtacc 900

tgggtgcggt gcataacaag acatgtcttg cagttactgt gaatttgact acagagtcga 960

tcttgattac ggagctgcct acggctttcc tacttaagct tggtatcacc aaactgagaa 1020

gttacaatgg ccaaccatgt ttagtttccg attctgcgca tgagttagct actacgggaa 1080

agtttaagat ctgtgtaaag gacaaggatt ctggactctg gggggagaga gaggtagagg 1140

ttaagggttg gagcgagaag gtcactggct cgtattcctt tgaaggaacc ataccgtctg 1200

gtgaattggt cttcgcaaag aagaagctcg agactggttt tcagatgtta ctctactacg 1260

accctcgcat ggaaaccttc aacgagtatc agattcagac ggaggaggat tatgactctg 1320

cggagatctt ccttaaccac aaaccaagca tctacattta a 1361

<210> 4

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aataatcaca ggaatgttgt aagcttcaat agtaaatgat tgaagcagtg agggaacttt 60

taaatgtttt tgtggagcag aagaggaatc aaggaaagtg tagaatggct ggtgggtgtg 120

atggagagaa gcaaaagaac cgaaacactg agagctcgta ccggatatgt tcctgtccca 180

tcttcctaga cattggagag attctcaaac cattttgtag ataaaagaaa cagaccagaa 240

tgttgcattt ttttgggttg ttgcatgatg agtaggtgta gcaatcttct ttaaatttgt 300

tttttttttg tcacgcactc atgtcattca tcgatttttt ttcatctgca ctactacatg 360

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cgtcattccg agctagcagg tctgctttgc tttgttacct gagactaaat tgtgggaaga 480

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ctacaaaatg aaccacgtag gagttgagat ctacaacgac caaactaatc gttaaagaga 840

gaggtttcaa aacttgaggt tcatattgta ccaacgctaa cgtaaaacct aatctcgtgt 900

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ccacgtaatt ttcctaatta atattctttt ttttttgaca gctcctaatt aatattctag 1320

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tttttgctaa atcaaaaaaa tactatgggt gtaactggaa tgctattttg tggaataaaa 1500

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taaatgttgt tccttttatt caggatcata atccttcgtg aatgagtgga aagccattcc 1680

aaaaatattt tcagttttta ttccatttaa tctatcattc cattttttct tattccaaaa 1740

ataatcattc ctttaattca taatattcct tctatgaata accagttaca ccctaacttt 1800

ctaatccaaa atcgaatcta aagcaaagaa cgttttcatt tccacactac gagccctcag 1860

acttgtggct cagttcctcg tgcttaccta aacggtagat taagcttctg ttaaatgcaa 1920

tctataaatt agaaggctga catgctgata atcttatcaa acaaacaaaa aaaaaacatc 1980

tgagatagaa aagaaacaca 2000

Claims

1.过表达载体在制备闭花授粉性状的转基因油菜中的应用，所述过表达载体包含如SEQ ID NO.4所示花器官特异性表达启动子PFBA以及编码如SEQ ID NO.1所示的蛋白质序列的闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA，PFBA启动子驱动基因BnaC03.FBA过表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株；

将转基因植株进行种植并观察其性状；

借助qRT-PCR分析转基因植株和对照植株中闭花授粉性状调控基因的表达。