CN110684757A

CN110684757A - 控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用

Info

Publication number: CN110684757A
Application number: CN201911061985.8A
Authority: CN
Inventors: 齐静; 齐建; 刘坤; 陈松岭; 王健; 张菊
Original assignee: Zhoukou Quality And Technical Supervision Inspection And Testing Center; Zhoukou Normal University
Current assignee: Zhoukou Quality And Technical Supervision Inspection And Testing Center; Zhoukou Normal University
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2020-01-14

Abstract

本发明提供一种控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用，该基因来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚(Col‑0),其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其基因开放阅读框的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，其cDNA编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。过表达RabGAP3基因直接造成细胞内囊泡堆挤缺陷，从而影响拟南芥根系生长的向地性和成年植株出现早花早熟的现象。进而证实这些表型的可遗传性。本发明为在拟南芥中挖掘新的调控囊泡发育基因参与早熟品种培育提供了新基因资源。

Description

控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用

本发明属于植物生物技术领域，它涉及一种控制植物囊泡发育必需基因及其应用，具体涉及一种控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用。

背景技术

真核细胞的生命活动是各个细胞器通过精细分工相互协作进行的物质交换和信息交流。细胞器作为生物活动的基本单位在细胞内具有特定组分和空间位置。囊泡运输不但可以保障细胞器组分的稳定性和胞内信号传输的持续性，并且运输缺陷被发现与细胞器发育缺陷和癌症有直接关系。因此囊泡运输机理的研究也获得了2013年的诺贝尔生理与医学奖。随着生命科学的研究深入到细胞器调控层面，我国在2017年度通过自然科学基金委员发布了“细胞器互作网络及其功能研究”重大研究计划，诣以各细胞器为研究主题通过揭示细胞器发育和互作机制深入解析细胞内物质转运和囊泡运输等重要生命功能。

亚细胞器的发育和调控及相互间的交流在动物中的研究开发价值已经显示了很强的市场前景。因为囊泡运输动态参与胞内多项重要的生命活动，如激素分泌及信息传递、天然免疫、肿瘤细胞抑制等，其运输障碍会导致细胞器发育缺陷和细胞功能紊乱，并与许多重大疾病(如胰岛素运转相关的糖尿病等、免疫感染、肿瘤缺陷等)密切相关。因此研究细胞的囊泡运输，不仅会对细胞生物学的基础理论研究产生积极的推进作用，也将揭示一些影响人类健康的重大疾病机理，为将来靶点药物释放和运输治疗提供新的策略，对人类健康产生重要影响。

目前随着显微镜观察追踪标记蛋白在囊泡转运过程中的研究，发现多种蛋白协同完成了囊泡的形成、转运及融合等任务。通过蛋白质组学等技术手段，科学家逐渐鉴定分离出基因组中编码的囊泡运输成员。截至目前的研究，在模式植物拟南芥的研究中以Rab蛋白酶及其对应的GAP水解酶复合体参与真核细胞的囊泡发育和囊泡运输等过程研究的相对集中。

Rab蛋白作为细胞内的“小分子开关”以小G蛋白形式参与真核细胞的信号转导、细胞分裂、囊泡运输和骨架组装等过程¹。由于Rab蛋白空间结构可变性，其蛋白复合体通过与GTP或GDP结合与否分别处于“开”或“关”的状态，从而启动细胞相应的生理过程²。现在研究相对清楚的一种模型是Rab蛋白在囊泡细胞内激活信号存在的情况:鸟苷酸交换因子（GEF）激活与膜结合的Rab蛋白，从而使Rab结合GDP的无活性形式转变为结合GTP的活性形式；虽然Rab蛋白本身有微弱的本底GTP水解酶活性，但它需要利用GAP水解酶（GTPase-activating protein）活性加速GTP水解，促使Rab快速失活，细胞信号传递得以迅速终止。以此Rab蛋白复合体完成了不断在GDP（非活化）和GTP（活化）结合状态之间循环的过程³。由于不同结合态的Rab蛋白定位于不同囊泡内膜，这些Rab蛋白标记的运输小泡也可以视为参与不同的细胞器发育的复合体。通过对这些特定囊泡膜复合体之间的相互融合和分裂（fusionand fission）的过程，GAP蛋白以此能作为囊泡膜体相互交换途径中控制不同步骤的负调控因子起到限制或抑制信号传导的作用。因此可以参与调控并防止某些细胞器的发育过程中无限分裂或巨大增生的功能。

目前在模式生物拟南芥的研究中， Rab5蛋白调控囊泡发育参与早期囊泡内小体的融合、运输和信号传递等多个过程。Rab5蛋白的上游激活因子GEF和失活因子GAP蛋白的研究却并不如动物细胞中研究的清楚。VPS9A（vacuolar protein sorting 9A）作为一个植物Rab-GEF能够激活所有Rab5成员，包括传统类型的ARA7、RHA1以及植物特有的ARA6。VPS9A蛋白酶活性与根细胞内生长素(auxin)的运输蛋白PIN的定位密切相关，参与了生长素相关的根细胞伸长的功能。同样，Rab5随后被发现参与了生长素运输蛋白PIN的定位循环，因此两类蛋白复合体共同调控了生长素运输相关的极性生长如根伸长，花粉管伸长和根的向地性生长等多种发育过程，其中ARA6被发现在植物开花和响应盐胁迫及渗透胁迫过程中起着十分重要的作用。

GTP水解酶-GAP蛋白在介导Rab-GTP复合体失活机制的生化功能研究中，由于其类似动物蛋白功能而被认为进化上相对保守。但作为研究GAP蛋白的植物生理功能方面却有很大空白。拟南芥RabGAP22参与油菜素内酯、茉莉酸等激素介导的植物内生免疫反应；水稻OsGAP1通过调节OsRab11活性介导水稻幼苗对高盐的适应。到目前为止，植物大多数成员的RabGAP基因功能及蛋白活性还没有分析，因而它们相对应的Rab底物也没有分离。因植物体内RabGAPs是相对较大的家族，成员众多功能冗余进而研究进展较少。

选育早熟高产新品种一直是作物遗传育种研究的主攻方向之一。植物早熟基因一直受到研究者的广泛关注。如果能使植物花期提前，对于育种工作来说，将会节省大量时间。大量研究表明，植物早熟花早的发育受内部信号、环境因素等的共同作用决定的，被认为是由数量遗传控制的，至今尚未建立一个普遍适用的理论体系。囊泡运输不但可以保障细胞器的稳定性和胞内信号传输的持续性，在时空层面精细调控基因表达同样发挥重要功能。我们通过对拟南芥过表达RabGAP3转基因植株分析发现该基因功能直接造成细胞内囊泡堆挤缺陷，从而影响根系生长的向地性，成年植株出现早花早熟的现象。我们对其核苷酸序列和蛋白序列进行分析发现该基因是属于GAP家族的一个功能未见报道的新基因。因此可以利用拟南芥过表达RabGAP3基因的植株研究囊泡发育如何调控细胞内的信号运输参与早花早熟的生物学功能。同时挖掘新的调控拟南芥囊泡发育基因对其他双子叶作物的分子育种及早熟品种培育具有重要的应用价值和理论意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用，该基因是拟南芥囊泡发育的关键调控基因，它的过量表达具有调控根向性生长缺陷，也会引起异常囊泡堆积并以此导致早花早熟的性状。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种控制拟南芥囊泡发育的基因RabGAP3，来源于拟南芥，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其基因开放阅读框的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，其cDNA编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

一种重组构建体，其特征在于包括权利要求1的基因的核苷酸序列，所述构建体用的载体为用于克隆的pEasy-T1载体或者用于表达的Myc-pBA载体。

所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体的制备方法，其特征在于：扩增核苷酸序列SEQ ID NO1，上游引物XbaIF5′-ACTCTAGAATGTTTTCTGCTGGAGAGG-3′，下游引物AatIIR 5′-ACGACGTCTGTTCTCTAAGGGGCATGACAGGA-3’；PCR 扩增产物纯化后T4连接反应后至 pEasy-T1 载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，得到克隆构建体pEasy-T1-RabGAP3。

所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体的制备方法，其特征在于：将克隆载体pEasy-T1-RabGAP3质粒中含RabGAP3基因片段的DNA经XbaI和AatII双酶切连接至植物表达载体Myc-pBA上，转化至E.coli DH5α 感受态细胞中，得到植物表达构建体pBA -RabGAP3。

所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的构建体的转基因农杆菌为LBA4404。

所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体在植物组织表达中的应用。

所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体在植物组织表达中的应用，其特征在于：所述植物组织为根、茎、叶、花、纤维、分蘖芽或种子。

所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体在植物组织表达中的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体在植物组织表达中的应用，其特征在于：所述单子叶植物为水稻、小麦、大麦、高粱或玉米，所述双子叶植物为拟南芥、番茄、烟草、大豆或土豆。

上述一种控制拟南芥囊泡发育基因RabGAP3编码的蛋白质，或其他物种中的功能类似蛋白，其氨基酸序列与Seq ID No.3所示的氨基酸序列具有至30%的同源性，该蛋白在培育早熟品种植物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

首先本发明利用分子克隆技术鉴定了RabGAP3基因的功能性开放阅读框的剪接形式。并对RabGAP3基因进行了组织特异性表达分析，qRT-PCR 结果表明RabGAP3基因在拟南芥花器官和根尖有较高量表达；然后将RabGAP3基因构建到以35S启动子启动的植物表达载体Myc-pBA中，获得重组载体pBA-RabGAP3，将重组载体转入农杆菌用于进一步的转化。利用花粉管为通道，使用农杆菌介导方法将构建好的载体转入到拟南芥中，获得RabGAP3转基因纯合体株系；然后对RabGAP3转基因株系进行表型分析。过表达RabGAP3基因后，植株根系长度变短并失去向地性，成年植株出现早花早熟的表型。经透射电镜技术分析细胞器结构发现，过表达RabGAP3基因的植株细胞内出现囊泡堆挤缺陷，表明RabGAP3基因是调控拟南芥囊泡发育的关键基因。RabGAP3转基因植株经多代种植显示早熟性状是可以稳定遗传的。由于RabGAP3基因家族在动植物进化中高度保守，根据此基因过表达造成的囊泡发育缺陷进而引起早熟早衰的表型可以作为一个新的可利用基因资源，同时也可以为育种学家提供新早熟种质资源，也为用于水稻、小麦等禾谷类作物早熟品种的培育。

附图说明

图1含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因片段的核酸电泳图；

图1所示为RT-PCR扩增后获得含RabGAP3基因片段经过核酸电泳的结果，即为图中箭头所示的2.2kbp大小的片段，实际基因片段大小为2235bp。

图2含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因克隆载体pEasy-T1-RabGAP3质粒DNA和构建成功的植物表达载体pBA-RabGAP3质粒DNA的核酸电泳图；

图2A所示为基因重组后获得含RabGAP3基因片段的克隆载体和经XbaI和AatII双酶切后回收纯化含RabGAP3基因片段。图2B所示为植物表达载体pBA-RabGAP3的质粒DNA经XbaI和AatII双酶切后验证含有RabGAP3基因片段的核酸电泳检测的结果。箭头所示为对应载体构建成功后经双酶切验证含有RabGAP3基因片段对应的片段大小。

图3含控制囊泡发育的RabGAP3基因在拟南芥不同组织中的相对表达量核酸电泳图；

图3所示为经qRT-PCR分析显示含RabGAP3基因片段在拟南芥的根和花器官中表达量相对较高。18S rRNA为内参。

图4含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因的农杆菌质粒DNA核酸电泳图；

图4所示为重组成功的含RabGAP3基因片段植物表达载体转化农杆菌后提取的质粒DNA，经后核酸电泳检测的结果，箭头所示为载体对应的片段大小。

图5为RabGAP3过表达转基因植株和对照组哥伦比亚植株基因组DNA经PCR扩增产物片段核酸电泳图；

图5所示为PCR鉴定含2235bp的RabGAP3基因阅读框片段的阳性转基因植株的电泳图，即为图中箭头所示的2.2kbp大小的片段。CK：未转基因的对照组染色体基因组DNA中不经转录和剪接无法扩增出对应的含2235bp的RabGAP3基因阅读框片段。

图6是RabGAP3过表达转基因拟南芥植株和对照组植株主根生长状况图；

图A和图B分别为对照组植株CK的主根和RabGAP3过表达转基因拟南芥植株OE的主根生长状况图；图C为统计垂直培养生长7天的对照组植株CK的主根和RabGAP3转基因拟南芥植株OE的平均主根根长柱状图。

图7是RabGAP3过表达转基因拟南芥植株和对照组植株开花时表型和统计开花时的平均莲座叶片数图；

图7A:所示RabGAP3过表达转基因拟南芥植株OE和对照组植株CK在开花时表型。图B：所示为在长日照下统计RabGAP3转基因植株（OE）比对照组拟南芥（CK）在开花时的平均莲座叶数。结果显示OE植株平均在6片叶时已经开花，而CK植株则在12片时才开花。

图8是RabGAP3过表达转基因拟南芥植株和对照组植株根尖细胞透射电镜结果图；

图8所示RabGAP3过表达转基因拟南芥植株OE相比对照组植株CK的根尖细胞中出现异常囊泡堆积。黑色箭头显示异常囊泡。

图9是qRT-PCR技术检测早花早熟表型RabGAP3转基因植株株系和对照组哥伦比亚植株中的RabGAP3基因相对表达的核酸电泳图；

图9所示为经qRT-PCR分析显示含RabGAP3基因片段在转基因RabGAP3拟南芥植株中表达量相对对照组植株较高。18S rRNA为内参。

具体实施方式

下面通过实例对本发明作进一步阐述，其目的在于更好理解本发明内容而非限制本发明的保护范围。

本发明拟进一步对RabGAP3基因在调控细胞器的囊泡发育的生物学功效进行分析，并利用拟南芥植株为模式植物分析囊泡发育缺陷如何造成早熟的分子机理，以期达到解析植物体内早熟信号在细胞器内的传导通路的目的，最终通过基因工程手段为其他作物如水稻、小麦等禾谷类作物选育早熟高产提供新的分子育种资源。

拟南芥转基因株系获得及表型分析检测

1材料与方法

1.1 植物材料及种植方式

供试的拟南芥品种为拟南芥哥伦比亚(Arabidopsis thaliana ( Columbia-0))，保存在周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室。将200粒已经干燥的拟南芥种子放入1.5mL离心管中。经10%次氯酸纳混勻消毒15min, 用无菌的ddH2O水反复洗涤种子,然后播种在1/2MS固体培养基上,封口膜密封，４°Ｃ放置两天，然后垂直放入光照培养箱中培养，培养7-10天后,统计主根根长,取一部分用于表型观察和生长曲线绘制。剩余部分幼苗被移至小盆土壤中生长。土壤配制按进口土，营养土和蛭石1:1:1. 营养土，蛭石，塑料培养盆等植物培养材料购买于北京际翔园艺公司。光照16h，黑暗8h，22-24°C温室条件培养。培养至开花统计莲座叶和提取幼嫩叶片RNA,中并做好对应的标签进行表型观察和后续的试验分析。

1.2 所用试剂及载体

本实验所采用的大肠杆菌为DH5α，和BL21，农杆菌为LBA4404，这些菌株为周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室保存，Gateway重组酶BP和LR Clonase^TMⅡenzyme mix、大肠杆菌表达载体pDEST-17、Myc-pBA植物表达载体和重组克隆载体pDONR207购自于Invitrogen公司；其中克隆载体PMD18-T 载体、pEasy-T1载体、T4 DNA连接酶、pfuTaq DNA聚合酶M-MLV反转录酶,RNaseA, dNTPs, SYBR Premix Ex Taq购自于TaKaRa生物公司；采用 AXYGEN 公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 进行胶回收；RIPA （RIPA LysisBuffer）蛋白提取液购自Thermo Scientific公司；考马斯亮蓝G-250, 潮霉素（Hyg）、卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）购买于美国Amresco公司,ＭS培养基购买于美国phytoTechnology公司；甲醇，乙醇等购自北京鼎国生物技术有限公司，试验所有引物均由北京奥克鼎盛生物公司合成。测序由华大基因完成。

1.3 RNA的提取、cDNA合成和RT-PCR扩增含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因片段

RNA提取使用Magen公司的植物RNA提取试剂盒，参考方法为较易提取植物组织RNA小量提取法。提取拟南芥哥伦比亚 (Columbia-0)植株幼嫩叶片1mg，按试剂盒的步骤提取mRNA,然后取2μg的RNA 做模板，按照 cDNA 合成试剂盒（TaKaRa）操作说明合成第一链cDNA。根据RabGAP3基因cDNA全长序列设计特异引物，特异引物序列：上游引物XbaIF5′-ACTCTAGAATGTTTTCTGCTGGAGAGG-3′，下游引物AatIIR 5′-ACGACGTCTGTTCTCTAAGGGGCATGACAGGA-3’。RT-PCR 反应体系（20 μL）：10×PCR 反应缓冲液 2 μL，dNTP（2 .5 mmol/L）1 μL，引物（10 pm/μL）各1 μL，pfu高保真酶（5 U/μL）0 .25μL，模板 cDNA 2 μL，ddH2O 12 .8μL。PCR 反应条件：94℃预变性 5min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，32个循环；72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR 扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳后得到一个2235bp长度的PCR产物片段，GelRED染色，用BIO-RAD公司的凝胶成像系统拍照保存，具体见图1。

为了验证RabGAP3基因开放阅读框的剪接模式，我们取 20 µL PCR 反应产物，采用 AXYGEN 公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 进行胶回收。回收产物连接到pEasy-T1载体上，连接体系为：pEasy-T1 Vector 0.5 µL，Solution I 4.5 µL，回收 PCR产物 5 µL。16 ℃连接12小时，链接溶液转化至E.coli DH5α 感受态细胞中，质粒PCR鉴定阳性菌落后，交由华大基因公司测序，最终得到克隆构建体pEasy-T1-RabGAP3。含有控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因克隆载体pEasy-T1-RabGAP3质粒DNA核酸电泳图见图2。

1.4含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因序列通过BLAST比对分析基因剪接模式

首先将我们测序得到的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因的核苷酸序列与GENBANK进行BLAST比对分析，我们得到了含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因的开放阅读框(SEQ ID N0.2)。采用NCBI ORF-finder预测其编码蛋白质为745个氨基酸，序列如SEQID NO.3所示。由于此基因是个未知功能的新基因，我们根据它含有RabGAP家族的功能域，把它命名为RabGAP3。RabGAP3序列对应基因的全长序列为2807bp，序列如下SEQ ID NO.1；其中包含开放阅读框序列长度为2235bp(SEQ ID N0.2)，预测其编码蛋白质为745个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示。

所述含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因开放阅读框SEQ ID NO.2，其核苷酸序列如下：

ATGTTTTCTG CTGGAGAGGG AAAGAAATGG ACTCGTCGGA AAGCTGGTCT TGTAAGTCTA 60

CAAAAAGTGG CATCTTTGGT TCGGGATCTG AGAGAGCCTT GTCTTTCACA ATCTCGCATA 120

CAAGTTGTTT TGACTATTGG CAAAATGCTT AAGCCTGAGA AGTGGCAGGC TTTATTCGAT 180

GGCGATGGAA AGGTTTCCAG TTTCCACAAG GCGCTCAAAT TAATTATTTT GGGGGGAATC 240

GATCCATCCA TAAGAGCTGA AGTTTGGGAA TTTCTCCTTG GCTGTTATGC ATTAAGCAGC 300

ACCTCTGAGT ATCGTACGCA ACTCAGGGTA GCTCGAAGAG AACGATACAA TGAGCTGCTC 360

AAGCAATGCC AGATGATGCA TTCGACTGTG GGAACTGGTT CACTTGCCTA TGTTGTCGGA 420

TCTAAAGTTA TGGATATGCG AAAATCATAC AAAAATGAGG TAGTAAAGGA GGATATAGAT 480

GAAAGCCGGG AAGCTTGTTT AGATGGGCAT GAGAACACTG ACAATCACGG TGATTGGAGT 540

AATAATGATA CTGAAAAATC TCCTGTGCGC AGAAGTGGAA GCTCCAGTGA GTCAGTTGAC 600

CTAGTCAGTC CTGATAGCAC AATATATGAA ACTTCTTCTT TTGTACCCCC GTCCAGTCCA 660

TATGGCTTTC CTTCCCCTGG TCCATTTGCA GATGATATCT TTGACTTTCC CTCTCTACCG 720

GTCACAGATT TGTTTGGGAG GAGTAGTTTA GGCAAGAAAG GACTTTCTAC TCCAGATGAA 780

GAAACTTCAA CGCAAAGTGA TTTAAGATCG GAGGATGAGA GAATGCACAG TTTTCGAATT 840

GACAAGAATG CAGATTTAGT TATAGAACCG CATGGGTCTT CTTATAATGA TGTAACTGCT 900

TCTATTAACT CAGAAATTGA AGTTGTACAT CTTCAATCTG TTGAAAAGTT GTCTCATTCT 960

GTCTGCACGT CAGAGATTGT TGATGGTTTG AGAATATCAG ATGTCCCTGA AACGCCGTCG 1020

GCAAGGGAGA CTCATACTCG TGGTGGGACT GTAAAGGAAG ATCGAGTCTC TGAATGGCTT 1080

TGGACATTGC ACCGGATAGT TGTTGACGTG GTAAGGACAG ATAGCCACCT TGAGTTCTAT 1140

GAGGATCCAG GAAATCTAGG TAGAATGTCA GATATCCTTG CGGTCTATGC TTGGGTTGAT 1200

CCTGCAACTG GTTATTGCCA AGGAATGAGC GATTTAGTGT CTCCATTTGT ATTTCTTTTT 1260

GAAGATAATG CTGACGCCTT TTGGTGCTTT GAAATGCTCA TAAGAAGAAC GCGTGCTAAT 1320

TTCCAGATGG AGGGACCAAC TGGAGTAATG GATCAATTGC AATCACTATG GCGTATATTG 1380

CAACTCACAG ATAAAGAAAT GTTTTCACAC CTATCACGTA TTGGTGCTGA AAGCCTTCAC 1440

TTTGCGTTCC GGATGCTGTT AGTGTTGTTT CGACGAGAGT TGTCTTTTAA CAAGGCTCTG 1500

AGGATGTGGG AGATGATGTG GGCTGCTGAT TTTGATGAGT CTTTTGCTGA AACTTTAGAG 1560

AAGGATTGCT TGAAGCCGTT GGTTGTTCAG CTTCCAAAAC GATCTGGAGT TGATATGGGG 1620

GACCATAAAA TAGATGATGG AAATGGCACA ACTACAAATA GTGAATCAAC TTCAAAGAGC 1680

GACCGGACTT CAAAGAGCAG TCTGTTGTCC AAGAGCGGTC TACTGCCAGA AAGTGGTCCA 1740

TTGCCAAAAA CTGGTCCGCT GTCTGATGAT TTTGGGATGA AGCCAGCAGG TTCATACAGT 1800

TTATGTGGCT TGACAAGAAA TTTATGGTCT AGGAATGAAA GAACCCATGC CTCTTGTGTA 1860

GTTTCATCCT GTGGGAAAGG AGATGACCCT CTTCCAGTCT TTTGTGTGGC GGCTATTCTA 1920

ATCATGAATC GGCATAAAAT CATGAAAGAA ACTCGCTCGA TCGATGACAT GATAAAGATT 1980

TGTAATGACA AGCTGCTTGC AATTAGAGTG AGAAGATGCA TACGCACAGC CATAAAACTT 2040

CGTAAGAAAT ACTTGTACAA GAATCAGGTA ATCAAGATTG AGAGCCACAT TCAGTCTCAG 2100

AATCATAAAC ACCATGAGAT ACAGAATCAA ACCGCGATGG AGAACCAAAT CCCAGAAGAG 2160

ATTACAAGTC ATGATGAGAA CTGTAGCCAA AGACCAAGTT TATGCAATGG TCCTGTCATG 2220

CCCCTTAGAG AATGA 2235

1.5.克隆重组构建体pBA-RabGAP3

利用测序正确的克隆载体pEasy-T1-RabGAP3的质粒DNA，通过分析植物表达载体上酶切位点，我们在引物中分别设计的XbaⅠ和AatII酶切位点，利用克隆载体通过双酶切反应，回收含有RabGAP3基因的酶切片段，通过T4链接酶插入Myc-Pba(BioVector NTCC中心)载体上的35s启动子区域后的对应含XbaⅠ和AatII酶切位点中，转化至E.coli DH5α 感受态细胞中，质粒PCR鉴定为阳性菌落后，交由华大基因公司测序，最终得到由35s启动子融合RabGAP3基因阅读框片段（SEQ ID N0.2中2235bp）的pBA-RabGAP3植物表达构建体。含有控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因克隆载体pEasy-T1-RabGAP3质粒DNA和植物表达载体pBA-RabGAP3质粒DNA的核酸电泳图见图2。

1.6.RabGAP3基因组织特异性表达分析

由于RabGAP3基因是个未知具体功能报道的新基因，我们首先利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了RabGAP3基因在拟南芥哥伦比亚 (Columbia-0)的组织特异表达量。分别取7天生长的主根根尖细胞，12天生长的幼苗，20天生长的幼嫩莲座叶片，30天生长的主茎和授粉2天的花器官进行RNA提取和检测。用于qRT-PCR分析的特异引物根据基因在家族序列的特异性序列片段设计，选用拟南芥的18SrRNA作为定量PCR内参引物，引物如表1所示。qRT-PCR结果表明：RabGAP3基因在拟南芥根尖细胞花器官中表达量相对其他器官中较高，结果如图 3所示。

表1 定量qRT-PCR的引物序列

Table 1 The sequences of primers used in semi-quantitative RT-PCR

1.7.pBA-RabGAP3质粒DNA转化农杆菌LBA4404

为了研究我们克隆得到的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因的开放阅读框 (SEQID N0.2)的生物学功能，我们利用农杆菌侵染技术将构建成功的pBA-RabGAP3质粒DNA通过浸花技术转化到拟南芥哥伦比亚 (Columbia-0)植株中，通过获取转基因植株进行RabGAP3基因的功能分析。

取100 μL农杆菌LBA4404感受态细胞置于冰浴中5min使其融化备用。取2μL pBA-RabGAP3质粒DNA加入到农杆菌感受态细胞中，慢慢混匀后冰浴25分钟。冰浴后将其置于液氮中冷冻3min，然后取出放入37°C温育5min。加1mL不含抗性YEP液体培养基至离心管中，于28°C在摇床进行培育180rpm/min摇菌2h。然后用离心机在5000rpm,离心5min,弃上清，将沉淀菌液涂布于含二个抗生素(100 μ g/mLRif、50 μ g/mLKan)的LB固体培养基平板内，在28°C恒温箱内培养2天。挑取单菌落进行液体培养，经菌液PCR鉴定的为阳性即为含目的基因pBA-RabGAP3的农杆菌菌株，或者提取农杆菌质粒DNA进行筛选转化子。菌株用70%甘油保存备用。现该菌株保存在周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室的-80°C冰箱中。含有控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因的农杆菌质粒DNA核酸电泳图见图4。

1.8.农杆菌介导的遗传转化和T2代纯和株系筛选

挑取含有pBA-RabGAP3质粒的农杆菌单菌落，接种到5mlLB液体培养基中，于28°C摇床培养16小时。第二天取200微升过夜活化菌液接种到200mlLB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养至OD600为0.8，然后离心重悬，悬浮浓度达到OD=1即可。将生长40天的拟南芥哥伦比亚 (Columbia-0)抽薹开花的茎部在重悬液(含5%蔗糖，0.03% Silwet L-77)中侵染5min，将浸染过菌液的拟南芥植株横放于托盘中，并用黑色不透光的塑料袋套住，以保持湿度，黑暗培养16ｈ后即可去除塑料袋，并将拟南芥正立放置，第二天光下继续培养7天后再次进行侵染，然后至果夹全部成熟，收获种子为T0代。将T0代种子播在含有植物载体筛选标记潮霉素的培养皿中（25μg/mL），筛选抗性阳性幼苗，待抗性幼苗长出主根和4片绿色真叶后，再移植土壤中培养至果夹全部成熟。收获种子为转基因T1代植株。

取T1代种子进行消毒，并播种于含植物载体筛选标记潮霉素的培养基的方皿中，于冰箱低温处理两天，然后将培养方皿垂直放于光照培养箱中培养主根垂直向地伸长，没有转化RabGAP3基因的幼苗主根显示向地生长，而转化RabGAP3基因的幼苗主根显示弯弯曲曲的生长方向，即失去向地性生长的表型，然后统计7天的拟南芥主根伸长情况。根据孟德尔遗传规律，单基因遗传分离比例3：1，即统计在含潮霉素筛选培养基上正常生长和不能正常生长的幼苗比例，生长分离比例接近３：１的转基因株系即认为是单拷贝插入的RabGAP3转基因株系，可将这样的株系幼苗移栽至营养土中继续培养，一直至收获Ｔ２代种子，该种子也要进行单株收获。以备后代分析植株表型和基因型鉴定用。

1.9.RabGAP3转基因植株的叶片基因组DNA提取和特异引物PCR检测

转基因株系T1种子播在正常1/2MS培养皿中,植株经生长与发育，分别提取对照组拟南芥哥伦比亚 (Columbia-0)植株和转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA。以基因组为模板，用特异基因引物:上游引物R1:5′-ATGTTTTCTGCTGGAGAGG-3′，下游引物R2： 5′-TGTTCTCTAAGGGGCATGACAGGA-3’扩增RabGAP3对应基因片段。由于对照组拟南芥哥伦比亚植株的染色体基因组DNA中不经转录和剪接，不能扩增出对应的含2235bp的RabGAP3基因阅读框(SEQ ID N0.2)的核苷酸片段，即图5核酸电泳图中箭头所指的2.2kbp大小片段。转基因单株中由于其染色体基因组中插入了含2235bp大小的 RabGAP3基因阅读框(SEQ ID N0.2)的重组构建，因此能扩增出含有RabGAP3基因阅读框(SEQ ID N0.2)片段的目的条带，也既是获得了阳性含35s启动子融合的RabGAP3转基因单株。

RabGAP3转基因T2代纯合株系单株基因组DNA提取

采用 CTAB 法提取拟南芥幼嫩叶片的 DNA。测试样品分别为RabGAP3转基因（OE）和对照组哥伦比亚（CK）。取幼嫩叶片0.2 g，加入液氮在研钵中研磨至粉末状，然后转入 2.0 mL离心管中，加入 600 µL 预热的 CTAB 提取液(0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol /L EDTA(pH8.0)，2 % CTAB，2 % PVP40，1mol/L 的氯化钠，0.2%的 β-巯基乙醇)。与65 ℃水浴加热30min，然后加入预冷的氯仿提取，再经冰异丙醇沉淀和70 %的乙醇溶液清洗杂质，吹干即叶片gDNA。然后作为模板和RabGAP3的特异引物R1/R2进行PCR扩增检测。PCR扩增反应体系为 20 µL，包括 10×LA Taq Buffer II (Mg²⁺ plus) 2 µL，dNTPs(10 mM) 0.5 µL，ddH2O14.5 µL，上游特异性引物R1 0.5 µL，下游特异性引物R20.5 µL，模板 2 µL，Taq 酶 0.5 µL；反应条件为 95℃预变性 5 min，95℃变性 15 s，55 ℃退火 20s，72℃延伸1min50 s，循环30次，72℃延伸10 min，4 ℃保存。取 20 µL PCR 反应产物，1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，GelRED染色，用BIO-RAD公司的凝胶成像系统拍照保存。采用 AXYGEN 公司的AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 进行胶回收。回收产物连接到 PMD18-T 载体上，连接体系为：pMD 18-T Vector 0.5 µL，Solution I 4.5 µL，回收 PCR 产物 5 µL。16 ℃连接12小时，并用 1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。阳性克隆送至华大基因测序。克隆测序后比对后验证为RabGAP3基因核苷酸序列，即表明转基因植株的基因组染色体中插入了RabGAP3基因的核苷酸片段。结果表明我们得到了RabGAP3过表达转基因植株。RabGAP3过表达转基因植株和对照组哥伦比亚植株基因组DNA经PCR扩增产物片段核酸电泳图见图5。

1.10.RabGAP3过表达转基因植株和对照组拟南芥主根生长表型分析

将收获的RabGAP3转基因株系和对照组拟南芥(哥伦比亚型)的T2代种子均为50粒，消毒后单粒的播种于1/2MS培养平皿上，４℃低温处理两天后，将平皿垂直放入光照培养箱光照16h，黑暗8h，22-24℃温室条件培养7天。分别统计各基因型的种子主根伸长生长情况。RabGAP3过表达转基因植株和对照组拟南芥哥伦比亚植株主根生长状况图见图6。结果可见,图6A中CK为对照组拟南芥哥伦比亚的主根长度平均长度为1.78056（±0.1235）cm，而OE为RabGAP3过表达转基因根系的主根长度为1.22326（±0.2683）cm。结果说明RabGAP3过表达转基因植株主根伸长受到抑制明显短于对照组平均值。图6同时也显示RabGAP3过表达转基因植株的根系对于垂直培养失去向地型，表现为弯曲生长，而对照组拟南芥哥伦比亚植株主根表现为正常向地性，垂直地面向下伸长。说明我们克隆得到的含拟南芥RabGAP3基因开放阅读框 (SEQ ID N0.2)的表达构建通过过表达RabGAP3基因，对拟南芥根系生长表现了十分重要的生物学功能。

1.11.RabGAP3过表达转基因植株和对照组拟南芥早花生理指标检测

将收获的RabGAP3过表达转基因株系和对照组拟南芥(哥伦比亚型)的T2代种子均60粒，消毒后单粒的播种于1/2MS培养平皿上，４℃低温处理两天后，将平皿垂直放入光照培养箱培养10天。然后移苗进土壤中，光照16h，黑暗8h，22℃温室条件在培养间生长。

我们以拟南芥抽苔后大约24天，主茎高达到1 CM作为开花的特征，这时统计两个指标：记录植株开花时莲座叶的数目；另外统计发芽到开花的生长时间，对于统计从培养基移栽到培养土的拟南芥的开花时间，起始时间应从拟南芥种子在培养基发芽时开始计算。每次统计的植株20棵。重复3次。RabGAP3过表达转基因植株和对照组拟南芥哥伦比亚植株开花时表型和开花时统计的平均莲座叶片数图见图7。

统计显示：RabGAP3过表达转基因株系(OE)平均比对照组拟南芥哥伦比亚的开花时间平均提前13天。RabGAP3过表达转基因株系表现出显著的营养生长时间缩短，提前开花，大约第32天角果开始出现成熟发黄。而对照组拟南芥哥伦比亚平均需要第49天才出现第一角果成熟发黄。另外莲座叶数停止增加即表明营养生长过渡到生殖生长阶段，因此统计莲座叶片数已经成为检验早晚花的生理指标之一。统计结果显示CK为对照组拟南芥哥伦比亚开花时莲座叶的数目平均为12片叶，而OE为RabGAP3过表达转基因株系开花时莲座叶的数目平均为6片叶。结果说明我们克隆得到的含拟南芥RabGAP3基因开放阅读框 (SEQ IDN0.2)的表达构建对拟南芥早花早熟生长有十分重要的生物学调控功能。

1.12.RabGAP3过表达转基因植株和对照组拟南芥细胞器内囊泡结构检测

将收获的RabGAP3过表达转基因株系和对照组拟南芥(哥伦比亚型)的T3代种子均60粒，消毒后单粒的播种于1/2MS培养平皿上，４°Ｃ低温处理两天后，将平皿垂直放入光照培养箱培养6天。第7天取根尖细胞2mm切下放入2.5%戊二醛溶液中与４°Ｃ低温固定一周时间，然后分别进行透射电镜分析细胞器结构发育情况。RabGAP3过表达转基因植株和对照组拟南芥哥伦比亚植株根尖细胞图见图8。结果显示CK为对照组拟南芥哥伦比亚细胞器结构表现规则紧凑，大部分细胞具有正常的细胞学结构，如有一个大的液泡或者一些小的分散的液泡，一个圆形的细胞核，许多排列完整、发育良好的细胞器，如叶绿体、线粒体、内质网和高尔基体，均勻散布在细胞中。而OE为RabGAP3过表达转基因株系中细胞学部分结构异常变大，在细胞核附近显示出现不规则多膜圆形和椭圆形囊泡，囊泡内膜显示多层片层结构堆积，使囊泡体型扩大，并且推挤面积占整个细胞结构的一半。结果说明我们克隆得到的含拟南芥RabGAP3基因开放阅读框 (SEQ ID N0.2)的表达构建从而在拟南芥体内过量表达RabGAP3后对拟南芥囊泡结构有十分重要的生物学调控功能。

拟南芥根尖细胞透射电子显微镜观察亚细胞结构

测试样品分别为垂直生长培养7天的已经显示根向性缺陷表型的株系RabGAP3过表达转基因（OE）和对照组哥伦比亚（CK）的根尖。先将拟南芥的根尖用清水冲洗一下，把表面的杂质冲洗干净。取材靠近根尖2mm处。将切下的材料迅速放入新鲜配制的 2.5%戊二醛固定液中，冰浴中抽真空，确保固定液完全进入到材料组织中。更换一次固定液，放于 4℃冰箱固定一周时间。用 PBS 缓冲液漂洗植物材料 5 次，每次 15 分钟，再用 1%的锇酸固定 5小时， PBS 缓冲液漂洗 5 次，每次 15 分钟。材料再先后经 45%、55%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇溶液梯度脱水，每次脱水 1-3 小时。用环氧丙烷置换材料中的乙醇，共置换两次，每次置换 2 小时。再将材料置于环氧丙烷和树脂 1:1 的混合液中，浸泡24小时，更换纯树脂 2 次，每次 12 小时。再向纯树脂中加入 1.5-2%的促凝剂 DMP-30（2,4,6-三氨基苯酚），室温下放在小摇床上振荡16小时。将材料放在包埋板中，置于 36℃温箱中 12小时，再转入 45℃温箱中 12 小时，然后再转入 60℃温箱中保温 36 小时以上，使树脂凝固。树脂凝固后即可进行半薄切片定位，超薄切片后材料在铜网上进行醋酸双氧铀染色，染好色的材料即可进行透射电镜观察。

1.13.RabGAP3过表达转基因植株表型可遗传性检测和RabGAP3基因表达相对量检测

在确定了我们克隆得到的含拟南芥RabGAP3基因开放阅读框 (SEQ ID N0.2)的表达构建对拟南芥的根发育和花发育以及对囊泡结构的维持显示了十分重要的生物学功能，说明该基因的开放阅读框 (SEQ ID N0.2)的表达是有功能性的。为此我们接着分析了这些转基因植株中是否出现了该RabGAP3基因过量表达。我们跟踪了RabGAP3过表达转基因植株表现的根向性和早熟缺陷株系，收获种子，得到了T4代RabGAP3转基因植株。

取7天生长的表现为根向性缺陷的RabGAP3转基因植株，播在土壤中，在光照16h黑暗8h的22℃温室条件在培养间至开花，取RabGAP3转基因植株和对照组哥伦比亚的花器官各约0.5g提取组织RNA和反转录cDNA, 然后进行半定量PCR检测RabGAP3基因的表达。以1 μg的RNA 做模板，按照 cDNA 合成试剂盒（TaKaRa）操作说明合成第一链 cDNA。以RabGAP3基因cDNA设计特异定量PCR引物，见表1。通过qRT-PCR检测早花早熟表型RabGAP3转基因植株株系和对照组哥伦比亚植株中的RabGAP3基因相对表达的核酸电泳图如见图9。图9结果显示，相对内参18sRNA的表达量，在可稳定遗传根向性和囊泡发育异常缺陷和早花早熟表型的RabGAP3转基因株系中该RabGAP3基因表达量相比对照组哥伦比亚株系的花中有明显提高，即RabGAP3过表达转基因植株表型具有可遗传性。说明本专利经克隆得到的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因开放阅读框 (SEQ ID N0.2)的较高表达会对拟南芥的根向性生长和早花早熟表十分重要的生物学功能。也为进一步使该基因应用于水稻、小麦早熟品种改良奠定了良好的基础和新的基因资源。

以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 周口师范学院

<120> 控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用

<130> 11

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2807

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana RabGAP3基因核苷酸序列

<400> 1

caaagtcaaa caatattgtt gtcgatttca tttcagcttg ttcgtaacaa atacaagttt 60

cttgataaag tgtaacaaat tgactaattg aaatgtcaac ctaaattaaa aagagaaact 120

tttgcgaaac acagaaaaag agaaagagag aaaaggcagg cagggataaa tcaacggact 180

ttccctggga agaaaaaatg ttcaccggag aagaatgtcc tccatgatct tcttctacag 240

gtttctgtac tgcttttggg ctgctttgag aacggatgat tccgtttgtg aaggaacaag 300

tgggaattgg ggagggaggg ttggtgtttg tgtgttttga ttactgatgt tttctgctgg 360

agagggaaag aaatggactc gtcggaaagc tggtcttgta agtctacaaa aagtggcatc 420

tttggttcgg gatctgagag agccttgtct ttcacaatct cgcatacaag ttgttttgac 480

tattggcaaa atgcttaagc ctgagaagtg gcaggcttta ttcgatggcg atggaaaggt 540

ttccagtttc cacaaggcgc tcaaattaat tattttgggg ggaatcgatc catccataag 600

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tacgcaactc agggtagctc gaagagaacg atacaatgag ctgctcaagc aatgccagat 720

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tatgcgaaaa tcatacaaaa atgaggtagt aaaggaggat atagatgaaa gccgggaagc 840

ttgtttagat gggcatgaga acactgacaa tcacggtgat tggagtaata atgatactga 900

aaaatctcct gtgcgcagaa gtggaagctc cagtgagtca gttgacctag tcagtcctga 960

tagcacaata tatgaaactt cttcttttgt acccccgtcc agtccatatg gctttccttc 1020

ccctggtcca tttgcagatg atatctttga ctttccctct ctaccggtca cagatttgtt 1080

tgggaggagt agtttaggca agaaaggact ttctactcca gatgaagaaa cttcaacgca 1140

aagtgattta agatcggagg atgagagaat gcacagtttt cgaattgaca agaatgcaga 1200

tttagttata gaaccgcatg ggtcttctta taatgatgta actgcttcta ttaactcaga 1260

aattgaagtt gtacatcttc aatctgttga aaagttgtct cattctgtct gcacgtcaga 1320

gattgttgat ggtttgagaa tatcagatgt ccctgaaacg ccgtcggcaa gggagactca 1380

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ttgccaagga atgagcgatt tagtgtctcc atttgtattt ctttttgaag ataatgctga 1620

cgccttttgg tgctttgaaa tgctcataag aagaacgcgt gctaatttcc agatggaggg 1680

accaactgga gtaatggatc aattgcaatc actatggcgt atattgcaac tcacagataa 1740

agaaatgttt tcacacctat cacgtattgg tgctgaaagc cttcactttg cgttccggat 1800

gctgttagtg ttgtttcgac gagagttgtc ttttaacaag gctctgagga tgtgggagat 1860

gatgtgggct gctgattttg atgagtcttt tgctgaaact ttagagaagg attgcttgaa 1920

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tgatggaaat ggcacaacta caaatagtga atcaacttca aagagcgacc ggacttcaaa 2040

gagcagtctg ttgtccaaga gcggtctact gccagaaagt ggtccattgc caaaaactgg 2100

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caaaaagtgg catctttggt tcgggatctg agagagcctt gtctttcaca atctcgcata 120

caagttgttt tgactattgg caaaatgctt aagcctgaga agtggcaggc tttattcgat 180

ggcgatggaa aggtttccag tttccacaag gcgctcaaat taattatttt ggggggaatc 240

gatccatcca taagagctga agtttgggaa tttctccttg gctgttatgc attaagcagc 300

acctctgagt atcgtacgca actcagggta gctcgaagag aacgatacaa tgagctgctc 360

aagcaatgcc agatgatgca ttcgactgtg ggaactggtt cacttgccta tgttgtcgga 420

tctaaagtta tggatatgcg aaaatcatac aaaaatgagg tagtaaagga ggatatagat 480

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gtcacagatt tgtttgggag gagtagttta ggcaagaaag gactttctac tccagatgaa 780

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gaggatccag gaaatctagg tagaatgtca gatatccttg cggtctatgc ttgggttgat 1200

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atcatgaatc ggcataaaat catgaaagaa actcgctcga tcgatgacat gataaagatt 1980

tgtaatgaca agctgcttgc aattagagtg agaagatgca tacgcacagc cataaaactt 2040

cgtaagaaat acttgtacaa gaatcaggta atcaagattg agagccacat tcagtctcag 2100

aatcataaac accatgagat acagaatcaa accgcgatgg agaaccaaat cccagaagag 2160

attacaagtc atgatgagaa ctgtagccaa agaccaagtt tatgcaatgg tcctgtcatg 2220

ccccttagag aatga 2235

<210> 3

<211> 744

<212> PRT

<213> RabGAP3基因基因开放阅读框的DNA编码的氨基酸序列

<400> 3

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1 5 10 15

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20 25 30

Pro Cys Leu Ser Gln Ser Arg Ile Gln Val Val Leu Thr Ile Gly Lys

35 40 45

Met Leu Lys Pro Glu Lys Trp Gln Ala Leu Phe Asp Gly Asp Gly Lys

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Arg Glu Arg Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Gln Cys Gln Met Met His Ser

115 120 125

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130 135 140

Asp Met Arg Lys Ser Tyr Lys Asn Glu Val Val Lys Glu Asp Ile Asp

145 150 155 160

Glu Ser Arg Glu Ala Cys Leu Asp Gly His Glu Asn Thr Asp Asn His

165 170 175

Gly Asp Trp Ser Asn Asn Asp Thr Glu Lys Ser Pro Val Arg Arg Ser

180 185 190

Gly Ser Ser Ser Glu Ser Val Asp Leu Val Ser Pro Asp Ser Thr Ile

195 200 205

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210 215 220

Ser Pro Gly Pro Phe Ala Asp Asp Ile Phe Asp Phe Pro Ser Leu Pro

225 230 235 240

Val Thr Asp Leu Phe Gly Arg Ser Ser Leu Gly Lys Lys Gly Leu Ser

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Thr Pro Asp Glu Glu Thr Ser Thr Gln Ser Asp Leu Arg Ser Glu Asp

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275 280 285

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290 295 300

Glu Ile Glu Val Val His Leu Gln Ser Val Glu Lys Leu Ser His Ser

305 310 315 320

Val Cys Thr Ser Glu Ile Val Asp Gly Leu Arg Ile Ser Asp Val Pro

325 330 335

Glu Thr Pro Ser Ala Arg Glu Thr His Thr Arg Gly Gly Thr Val Lys

340 345 350

Glu Asp Arg Val Ser Glu Trp Leu Trp Thr Leu His Arg Ile Val Val

355 360 365

Asp Val Val Arg Thr Asp Ser His Leu Glu Phe Tyr Glu Asp Pro Gly

370 375 380

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Glu Ser Gly Pro Leu Pro Lys Thr Gly Pro Leu Ser Asp Asp Phe Gly

580 585 590

Met Lys Pro Ala Gly Ser Tyr Ser Leu Cys Gly Leu Thr Arg Asn Leu

595 600 605

Trp Ser Arg Asn Glu Arg Thr His Ala Ser Cys Val Val Ser Ser Cys

610 615 620

Gly Lys Gly Asp Asp Pro Leu Pro Val Phe Cys Val Ala Ala Ile Leu

625 630 635 640

Ile Met Asn Arg His Lys Ile Met Lys Glu Thr Arg Ser Ile Asp Asp

645 650 655

Met Ile Lys Ile Cys Asn Asp Lys Leu Leu Ala Ile Arg Val Arg Arg

660 665 670

Cys Ile Arg Thr Ala Ile Lys Leu Arg Lys Lys Tyr Leu Tyr Lys Asn

675 680 685

Gln Val Ile Lys Ile Glu Ser His Ile Gln Ser Gln Asn His Lys His

690 695 700

His Glu Ile Gln Asn Gln Thr Ala Met Glu Asn Gln Ile Pro Glu Glu

705 710 715 720

Ile Thr Ser His Asp Glu Asn Cys Ser Gln Arg Pro Ser Leu Cys Asn

725 730 735

Gly Pro Val Met Pro Leu Arg Glu

740

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

actctagaat gttttctgct ggagagg 27

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acgacgtctg ttctctaagg ggcatgacag ga 32

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgtgggaaag gagatgacc 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcattctcta aggggcatga c 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atgttttctg ctggagagg 19

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tgttctctaa ggggcatgac agga 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

aaacggctac cacatccaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cctccaatgg atcctcgtta 20

Claims

1.一种控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其基因开放阅读框的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，其cDNA编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

2.一种重组构建体，其特征在于包括权利要求1的基因的核苷酸序列，所述构建体用的载体为用于克隆的pEasy-T1载体或者用于表达的Myc-pBA载体。

3.根据权利要求2所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体的制备方法，其特征在于：扩增核苷酸序列SEQ ID NO1，上游引物XbaIF5′-ACTCTAGAATGTTTTCTGCTGGAGAGG-3′，下游引物AatIIR 5′-ACGACGTCTGTTCTCTAAGGGGCATGACAGGA-3’；PCR 扩增产物纯化后T4连接反应后至 pEasy-T1 载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，得到克隆构建体pEasy-T1-RabGAP3。

4.根据权利要求2所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体的制备方法，其特征在于：将克隆载体pEasy-T1-RabGAP3质粒中含RabGAP3基因片段的DNA经XbaI和AatII双酶切连接至植物表达载体Myc-pBA上，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，得到植物表达构建体pBA-RabGAP3。

5.如权利要求1所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的构建体的转基因农杆菌为LBA4404。

6.如权利要求1所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体在植物组织表达中的应用。

7.如权利要求5所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体在植物组织表达中的应用，其特征在于：所述植物组织为根、茎、叶、花、纤维、分蘖芽或种子。

8.如权利要求5所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体在植物组织表达中的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.如权利要求7所述的含控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因表达的重组构建体在植物组织表达中的应用，其特征在于：所述单子叶植物为水稻、小麦、大麦、高粱或玉米，所述双子叶植物为拟南芥、番茄、烟草、大豆或土豆。

10.一种功能类似蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有不小于30%的同源性，该蛋白在培育早熟品种植物中的应用。