CN111304220B

CN111304220B - 一种春兰CgWRKY3基因及其应用

Info

Publication number: CN111304220B
Application number: CN202010298628.XA
Authority: CN
Inventors: 胡凤荣; 王连平; 徐子涵; 刘倩
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2040-04-16
Also published as: CN111304220A

Abstract

本发明公开了一种春兰CgWRKY3编码基因及其应用，CgWRKY3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对春兰栽培品种‘宋梅’CgWRKY3基因的克隆与鉴定，基因表达分析，并验证其功能，发现CgWRKY3转基因拟南芥在幼苗期，与野生型拟南芥WT相比，植株叶片大小无明显变化，但在开花期，转基因植株提前开花，且株高大于野生型，表明CgWRKY3促进转基因植株开花，可见该基因可能在兰花花性状改良方面有广泛的用途。

Description

一种春兰CgWRKY3基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种春兰CgWRKY3基因及其应用。

背景技术

兰科（Orchidaceae）是开花植物中最大科之一，全世界含有25000多种，约占所有开花植物的10%。春兰（Cymbidium goeringii）属于兰科兰属中的小花型地生兰种类，其花型奇特、花色淡雅，花香清幽，叶姿优美，观赏价值和经济价值极高。春兰对生长环境要求较高，在生长过程中极易受到高温、低温、干旱等恶劣环境影响，严重时，会导致园艺观赏品质下降，甚至植株死亡。因此，研究植物应对非生物胁迫的分子机制以及鉴定具有抗逆功能的基因对春兰育种和生产具有重要意义。在植物细胞信号转导途径中，WRKY转录因子被认为是植物生长和多种胁迫响应的关键枢纽，为植物的遗传改良提供重要依据。

WRKY转录因子是植物中最大的调节蛋白家族之一，参与多种生理过程，其中，最突出的是对生物和非生物胁迫的应激反应。有报道表明WRKY基因可以增强植株对逆境胁迫的耐受性。向日葵HaWRKY76转基因植株对水涝胁迫表现出更强的抗逆性，产量也明显增多。AtWRKY25的过表达增强拟南芥的耐盐性。AtWRKY57在水稻中的过表达不仅提高了水稻的抗旱性，而且增强了其对盐和PEG的耐受性。因此，利用基因工程技术，从春兰中克隆获得CgWRKY3基因，该基因在低温胁迫下存在明显的表达差异，因此将CgWRKY3基因转入植物中，极具应用前景。

不同的植物，即使是相同的基因族，基因序列也是不同的，即使是80%以上的基因序列相同，但是因为部分基因插入的位点不同，将其转入植物中，所起到的作用也是不同的。当外源基因进入染色体上，产生了此基因编码的外源蛋白，外源蛋白或酶通过一系列的反应导致了其他酶或蛋白质活性的增强或者降低，另外当外源基因嵌入在染色体的某个区段时，必将对整个染色体产生影响，从而影响其他基因的活性或调控机制。

即使插入的是同一个基因，但是由于插入位点不同或者染色体组不同，必然对所在染色体产生影响，进一步导致对所在染色体上的基因产生影响，而基因微小的改变，都有可能影响其调控机制，导致出现基因失活、活性降低、活性增强等改变，也造成基因作用的不同，而基因的作用需要通过验证才能获得，并不是通过推断就能得到。

发明内容

发明目的：针对现有育种技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种春兰CgWRKY3基因。本发明的另一目的是提供春兰CgWRKY3基因在兰花育种中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种春兰CgWRKY3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的春兰CgWRKY3基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的春兰CgWRKY3基因在植物生产和育种中的应用。

含有所述的的春兰CgWRKY3基因的载体。

含有所述的春兰CgWRKY3基因的宿主细胞。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过对春兰CgWRKY3基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，验证其功能，发现过表达CgWRKY3基因的拟南芥植株在幼苗期，与野生型拟南芥WT相比，植株叶片大小无明显变化，但在开花期，转基因植株提前开花，且株高大于野生型，可见该基因在兰花和其它植物生产、育种中将有广泛的用途。

附图说明

图1是春兰CgWRKY3基因克隆和构建的过表达载体图；

图2 a图是CgWRKY3在春兰各组织中的表达情况，其中，R表示根，P表示假鳞茎，L表示叶，F表示花；b图是低温胁迫下春兰CgWRKY3基因的表达情况；

图3 a图是酶切结果图，其中，M：DL2000 Marker； CgWRKY3与pBI121连接后用SmaI和SnaBI双酶切；b图是阳性重组子的筛选图，其中，M：DL2000 Marker，目的条带大小为1491bp；

图4是转基因拟南芥植株PCR结果图，其中，M：DL2000 Marker；CK⁺：以载体质粒DNA为阳性对照；CK^-：野生型DNA为阴性对照；水：空白对照；

图5是转CgWRKY3基因植株与野生型拟南芥植株株型比较，图中WT，野生型拟南芥；2-4，转CgWRKY3基因的不同株系；

图6是转CgWRKY3基因植株与野生型拟南芥植株株型比较，图中WT，野生型拟南芥；2-4，转CgWRKY3基因的不同株系；

图7是转CgWRKY3基因植株与野生型拟南芥在低温胁迫下，冷胁迫相关基因表达情况比对图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

本实施例所采用的材料是春兰‘宋梅’叶片，采后速冻于液氮中，超低温冰箱（-80℃）保存。

1）春兰叶片总RNA的提取

按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：

将超低温冻存的春兰叶片迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品加入到含有450 μl Buffer PE的1.5 mL灭菌 tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000rpm，4℃离心5min钟；将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌tube 中。加入上清液 1/10体积的Buffer NB，Vortex 振荡混匀，12,000 rpm，4℃离心5 min；将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌 tube 中，加入450μL的 Buffer RL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNA SpinColumn中；12,000 rpm，离心1min，弃滤液，将RNA Spin Column 放回到2 ml CollectionTube 中；将500μL的 Buffer RWA 加入至RNA Spin Column 中，12,000 rpm 离心30s，弃滤液；600μL的Buffer RWB 加入至RNA Spin Column中，12,000 rpm 离心30s，弃滤液；向RNASpin Column膜中央加入50μL DNase I 反应液，室温静置15min；向RNA Spin Column膜中央加入350μL的Buffer RWB，12,000 rpm离心30s，弃滤液；将 RNA Spin Column 重新安置于2mL Collection Tube 上，12,000 rpm 离心2min；将 RNA Spin Column 安置于1.5 mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央处加入50μL的 RNaseFree dH₂O室温静置5min，12,000 rpm 离心2min洗脱RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

吸取2μL RNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀为2.03，OD₂₆₀/OD₂₃₀为2.01，完整性较好，可用于反转录。

2）第一链cDNA的合成

以所得到的的总RNA为模板，使用TaKaRa反转录试剂盒进行反转录，使用Oligo(dT)作为锚定引物，反转录合成第一链cDNA。具体操作如下：

在离心管中配制按照下列模板RNA/引物的顺序配制混合物，总量为10μL：模板1μg，Oligo(dT) Primer(50μM) 1μL，dNTP Mixture(10mM each) 1μL ,剩余体积用RNase-free ddH₂O补齐。65℃保温5min后，冰上迅速冷却；将该离心管离心，使离心管中的混合物均沉于管底。在新的离心管中配制反转录反应液（20μL）：上述变性后反应液10μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μl) 0.5μL，PrimeScript RTase(200 U/μl) 1μL，RNase Free dH₂O补齐20μL。缓慢摇匀，在PCR仪上，30℃保温10min，42℃保温30min，95℃保温5min使酶失活，冰上放置，得到cDNA溶液。

3）目的基因引物的设计及克隆

根据现有的春兰转录组测序数据，利用其它物种的WRKY相关基因序列进行Blast同源比对。利用Oligo6.0，Prime5.0设计相应引物，引物序列为：

CgWRKY3-F：5'-ATGGCGGAAAACATCAGAG-3'，

CgWRKY3-R：5'-CTATAAGATCTCATGTTCTTCTTTCAG-3'。

以cDNA第一链为模板，利用PrimerStar Max高保真酶进行春兰CgWRKY3基因的克隆。PCR扩增体系（50μL）为：25μlL PrimerStar Max，2μL Forward Primer，2μL ReversePrimer，2μL Template DNA，19μL ddH₂O。PCR程序为：反应条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，32个循环，72℃总延伸5min，16℃保温。

PCR反应完成后，取全部PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切割目的片段，凝胶回收纯化PCR目的扩增产物。采用天根公司的DNA凝胶回收试剂盒，进行目的片段纯化回收，具体操作为：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；将单一目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量；向胶块中加入等体积溶液PN（如果凝胶为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和上下翻转离心管，直至胶块完全溶解；将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱CA2放入收集管中；向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液W，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱置于室温放置5min，彻底晾干；将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL ddH₂O，室温静置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。取2μL回收纯化后的产物，使用1%琼脂糖进行凝胶电泳检测。

4）目的片段与载体连接

克隆载体为全式金公司的pEASY-Blunt载体，进行连接反应，连接体系（5μL）：4μLPCR纯化产物，1μL pEASY-Blunt Vector，轻轻吸打混匀后，室温放置5min，将离心管置于冰上。

5）连接产物的转化

从超低温冰箱中取出感受态细胞Trans5α菌株，置于冰上融化。吸取5μL的过夜连接产物加入到100μL感受态细胞中；将离心管置于冰上冰浴30 min；42℃水浴锅中水浴，热激90 s，期间不要摇动；后立即置于冰上冰浴2 min；在超净台中加入800μL无抗生素的液体培养基，37℃、180 rpm摇1h复苏；4000 rpm 离心3 min，吸去800μL上清；将沉淀的菌体重悬，涂于LB平板（Amp的浓度为100 mg/L），37℃培养过夜。

6）重组质粒的筛选及验证

挑取在含有抗生素（Amp）的LB固体培养基上过夜生长的单菌落，接种到含有同样抗生素的750μL的LB液体培养基中。200 rpm，37℃过夜培养。

PCR扩增体系为：10uL Green TaqMix，1μl M13-F/R，1μL菌液，7μL ddH₂O补充到20μL。

PCR程序为：94℃10min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30 cycles；72℃5 min；16℃forever。

吸取5µL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。验证后，将条带大小正确的菌液样品委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序引物为通用引物M13F/R。测序结果在NCBI上进行比对分析。

根据对测序结果的分析，最终确定克隆得到1个春兰WRKY编码基因，命名为CgWRKY3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CgWRKY3基因编码长度为1491bp，含有ATG起始密码子和TAG终止密码子，其中ORF全长为1491bp，编码496个氨基酸的蛋白质，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

研究结果表明WRKY3基因在春兰中各个组织器官中均有表达（图2a），但是该基因在春兰花中的表达量最高，说明该基因在花中功能活跃。通过对春兰低温胁迫处理的叶片进行表达分析（图2b），证明CgWRKY3基因在春兰叶片的低温胁迫响应中起着重要的调控作用。

本实施例所用的植物材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col（Columbia）野生型种子。

本实施例所用的大肠杆菌菌株为Trans5α；农杆菌菌株为GV3101，分别用于转化拟南芥；试验中所用植物表达载体为pBI121。所用菌株分别购自全式金生物公司和普利斯生物公司。

1）CgWRKY3基因过表达载体的构建

将实施例1获得的CgWRKY3基因ORF全长序列与植物表达载体pBI121进行连接，构建的载体如图1。

2）质粒的提取：

按照天根质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒，具体步骤如下：

取过夜培养的10mL菌液，12000 rpm离心1min，去掉上清液；取500μL P1溶液（含RNase A）加至留有菌体沉淀的离心管中，使用涡旋仪彻底悬浮菌体沉淀；取500μL P2溶液加至离心管中，温和上下翻转时菌体裂解充分，取700μL P3溶液加至离心管中，立即温和上下翻转，充分混匀，当出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心10min；取500μL平衡液BL加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，将收集的上清液分批加入过滤柱CS中，12000rpm离心2min，小心将收集管中收集的溶液分批加入吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管；取500μL去蛋白液PD加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱CP4重新放回收集管；取600μl 漂洗液PW（含无水乙醇）加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液；将吸附柱CP4移至新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间加入60μL ddH₂O；室温静置2min，12000rpm离心1min，离心管中收集的溶液即为质粒。最后测定质粒浓度，为下一步实验做准备。

3）特异酶切位点的添加

以cDNA为模板，通过PCR方法在目的基因的两侧添加特异性酶切位点。春兰CgWRKY3基因两侧添加SmaI和SnaBI酶切位点。PCR反应体系、程序及所使用引物如下：

PCR扩增体系（50μL）：25μL PrimerStar Max，2μL Forward Primer，2μL ReversePrimer，2μL Template DNA，19μL ddH₂O。PCR程序为：反应条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，32个循环，72℃总延伸5min，16℃保温。

所使用的引物序列：

CgWRKY3-SmaI-F：5'- CCCGGGATGGCGGAAAACATCAGAG-3'，

CgWRKY3-SnaBI-R：5'- TACGTATAAGATCTCATGTTCTTCTTTCAGTTG-3'

将得到的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，使用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化，将回收后的产物与pBI121载体连接，构建表达载体。

4）双酶切反应

将提取的pBI121质粒用SmaI和SnaBI在37℃条件下酶切15min，电泳回收线性载体，-20℃保存备用。双酶切反应体系为50μL：pBI121质粒 20μL，5×buffer 5μL，SmaI 1μL，SnaBI 1μL，ddH₂O 23μL。酶切结果如图3a所示，其中，M：DL2000 Marker；1：CgWRKY3，与pBI121连接后用用SmaI和SnaBI双酶切。

5）连接反应

琼脂糖凝胶电泳检测酶切后所回收到的目的基因和载体pBI121，根据所检测出的纯度和浓度，按连接体系加入各试剂。其中，目的片段分子数：载体分子数=3:1-5:1，连接反应体系为：线性化pBI121载体7μL，插入片段3μL，5×CE II buffer 4μl，Exnase II 2μl，ddH2O Up to 20μL。在37℃下反应30min，放置于冰上降温冷却。

6）连接产物转入大肠杆菌

将目的片段与载体pBI121连接后的产物转入大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，方法同实施例1。

7）重组子的鉴定

挑取平板上的单菌落接种到含有抗生素（卡那霉素）的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养过夜。使用目的基因全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆。筛选后的阳性克隆送南京金斯瑞公司测序。同时使用天根质粒提取试剂盒提取质粒并进行酶切验证，判断酶切后片段大小是否一致。结果如图3b所示，为目的引物PCR结果，条带大小为1491 bp。

8）农杆菌感受态细胞的制备与转化

本实施例利用农杆菌GV3101来制备农杆菌感受态，进行拟南芥的侵染实验；农杆菌感受态制备过程为：挑取已经活化好的农杆菌单菌落，接种于5mL液体LB培养基中，28℃、250 rpm摇菌培养20-24 h；吸取2mL菌液，接种到含有50mL液体LB培养基的三角瓶中，28℃、250 rpm摇菌至OD₆₀₀值为0.8左右；将扩大繁殖后的菌液置于冰上冰浴30 min，4℃、5000rpm离心5 min，弃上清；加入10mL经预冷的0.1 mo1/L CaCl₂溶液，充分悬浮沉淀的菌体；4℃，5000 rpm离心5 min，弃去上清；加入1mL预冷的20 mmo1/L CaCl₂溶液充分悬浮菌体，即得到所要制备的GV3101感受态细胞，用离心管将其分装成100µL/管，迅速加入20%的无菌甘油，-80℃放置保存。

重组子的农杆菌转化：冰浴，使农杆菌感受态细胞融化，将1-5 µl经回收纯化后的质粒加入到200 μl的农杆菌感受态中，轻轻混匀，冰浴30 min；使用液氮速冻l min，37℃水浴锅中热击1-5 min，迅速置于冰上1-2 min；加入800 μl不含任何抗生素的LB培养基，28℃，100 rpm复苏2-4 h； 4000 rpm离心3 min，吸掉部分培养基；使用移液枪充分混匀剩余的菌液，后涂抹于添加 50 mg/L卡那霉素和50 mg/L链霉素（EHA105）或100 mg/L的庆大霉素（GV3101）的固体 LB 培基上；28℃倒置培养30-48 h。

农杆菌重组子的鉴定：从平板培养基上挑取长出的单菌落，接种于含有相应抗生素的液体培养基中；28℃，220 rpm培养过夜；使用35S-F分别搭配如下引物进行菌液PCR，引物序列为：

35S-F：5'-GATAGTGGAAAAGGAAGGTG-3'，

35S-CgWRKY3-R：5'- TACGTATAAGATCTCATGTTCTTCTTTCAGTTG-3'。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定是否含有目的片段；鉴定出的阳性克隆，扩大培养后，采用碱裂解法提取质粒，进行双酶切验证；鉴定后的阳性克隆加入适量无菌甘油，于-80℃保存备用。

9）农杆菌介导的拟南芥的转化

采用花序侵染法将目的基因转入拟南芥中，具体操作方法为：拟南芥(col野生型)保持健康生长状态至开花；活化携带有目的基因的农杆菌EHA105菌株。挑取单菌落，接种于5mL含有卡那霉素和链霉素的LB培养基上，28℃、250 rpm摇菌至菌液刚刚变浑浊，约8-10h；吸取1mL菌液，接种到三角瓶中(50mL )摇菌24 h，至OD值约为0.8左右；将菌液5000 rpm在室温下离心5 min，去除上清后收集菌体，用5%蔗糖溶液悬浮；浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.05%(500 μl/L)，晃出泡沫；将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15-30s，期间轻轻晃动；将浸过的拟南芥平躺在托盘中，用保鲜膜覆盖，锡箔纸密封避光，4℃，放置24 h；揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

5%蔗糖溶液重悬液各成分如下：MS培养基，添加蔗糖50g/L，MES 0.5g/L，Silwet-77 500µl/L。（注意：配制后pH调制5.8，菌液离心重悬后再加入SilwetL-77；重悬液和菌液的换算关系为：重悬液用量：菌液OD*菌液体积=0.8*重悬液）。

10）转基因植株的筛选

收集的T1代转基因拟南芥的种子，用酒精和升汞进行灭菌，步骤为：取适量获得的转基因种子放置于1.5mL离心管中，用75%酒精浸泡30 s；10%次氯酸钠灭菌2 min 30 s；无菌水冲洗3-4次，第一次冲洗后更换经高压灭菌的新离心管；用0.1%琼脂糖溶液悬浮。

将灭菌后的转基因拟南芥种子播种于含有抗生素（卡那霉素50 mg/L和头孢霉素100 mg/L）的1/2MS固体培养基上。22℃，光照培养。大约一周后将培养基上可以正常生长的拟南芥移植与土中，继续生长。

11）转基因植株的检测

取适量拟南芥和转基因植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA，具体操作步骤为：将适量叶片置于灭菌处理后的2mL离心管中，加入700 µl的CTAB溶液，用球磨仪彻底研磨，65℃静置10 min；加入等体积的氯仿：异戊醇，数次颠倒使其混合均匀，14000 rpm离心10min；将上清移至新的无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀数次，室温静置2 min，14000 rpm离心10 min，倒掉上清；加入70%的无水乙醇，使用移液枪吹打洗涤两次，14000rpm离心1min，弃去上清；吹干表面液体，加入20 µL ddH₂O溶解。取上述提取的转基因和野生型拟南芥的DNA，用CgWRKY3基因的特异性引物进行PCR检测。

春兰CgWRKY3基因转化拟南芥后，共获得5个过表达CgWRKY3基因拟南芥株系。以重组质粒为阳性对照，以野生型为阴性对照，以水为空白对照，PCR结果如图4所示，阳性对照为CgWRKY3基因载体PCR结果，阴性对照以水为代替模板，WT是以野生型拟南芥DNA为模板。

12）表型观察

不同代转基因植株的获得：收获的转基因T1代种子经灭菌，筛选培养后，再移植于营养土中，22℃，16 h光照/8h黑暗培养；经检测后保留初步确认的转基因植株，待成熟后收获T1代种子，进行编号，得到T2代；同T1代一样，将T2代种子经灭菌后涂布于含抗生素的筛选培养基上，置于22℃，连续光照；10d左右，对不同编号的T2代种子进行存活率统计，选取存活比例为75%的植株移植与营养土中按照22℃，16 h光照/8h黑暗培养，并取叶片进行阳性检测；阳性T2代植株继续进行编号，收集种子，得到T3代种子；将种子灭菌后，用筛选培养基筛选，置于光下连续光照培养；10 d左右，观察不同编号的T3代植株，全部存活并且没有出现分离的为T3代纯合植株。

对得到的转基因株系分批次进行观察。

（1）选取其中表型明显的3个转基因植株进行观察，如图5和6，结果发现与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥植株生长发育缓慢，CgWRKY3转基因植株在幼苗期，与野生型拟南芥WT相比，植株叶片大小无明显变化，但在开花期，转基因植株提前开花，且株高大于野生型。

（2）对转基因拟南芥进行4℃低温胁迫处理，检测与低温相关基因AtCOR47、AtCOR15A和AtRD29A的表达量，见图7，结果发现在野生型拟南芥和转基因拟南芥中，3个基因在低温胁迫下均显著上调，然而表达水平明显低于 WT，表明 CgWRKY3 基因的过表达对基因的表达起到抑制作用。ABF4基因在过表达 CgWRKY3 植株中响应低温胁迫较为缓慢，表达量在低温处理 12h 内无明显差异，且总体表达上调幅度明显低于 WT。ABI5 基因在过表达 CgWRKY3 植株中表达量也显著低于 WT，可见 CgWRKY3 基因的过表达抑制了 ABA 应答基因的表达。

本实施例将过表达的春兰CgWRKY3基因的35S:CgWRKY3转入模式植物拟南芥中，进行表型观察和分析。从结果可以看出，过表达35S: CgWRKY3的拟南芥T2代植株出现生长发育迟缓，植株叶片大小无明显变化，但在开花期，转基因植株提前开花，且株高大于野生型；CgWRKY3超表达可能通过调控冷信号相关基因AtCOR47、AtCOR15A及AtRD29A基因的表达增强植株的抗寒性。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种春兰CgWRKY3基因及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1491

<212> DNA

<213> 春兰Cymbidium goeringii

<400> 1

atggcggaaa acatcagaga agcagcagta ggccatacag aggcgaagcg gccctctgtt 60

tctctccctt cgggtcctac cgtcgaaagc ctgttccgcc ttgagccggc ggaagcaagc 120

cctagcccga tgaacttagt ttcaagcttc ttctcggagg accctgagtc ggagtgtcgc 180

tccttctcgc agcttcttgc cggcgcgatg acgtcgccga cggcaaggac ggcgccggaa 240

gctgcggcgg gggatgggag aggaagagga ggaggtttga atttagggca gagccgaccg 300

ttgaatatgt tgttggggca gtcgccgttc atcacggcgc cgactgaatt gagttctggt 360

ggcctccttg atttcccaac tacgttttcc tctaatacgg cacaatttgg tttgtcgcat 420

cagcaggcta cccattctca gttccgaatg catatgcagg cagaaaatcc atcttctctt 480

ttgtctgctt cgttgtcgca gtcgttcccc acagctaaga tgtcaaaagt cctacatgtg 540

ccagccatga ctttggattc aaacgctcat ggctctgagg ctgacatggc ttctcattct 600

gatcaaatac ctcatcctgt gcccattgtt gtcgataaac ccgtcgatga tggctacaat 660

tggcggaagt atgggcagaa acaggtgaaa ggaagtgaat atccgaggag ctattacaaa 720

tgcacccacc caaactgtcc tgtaaagaaa aaggtcgagc gttctttaga tggtcaagtg 780

actgagataa tctataaggg aaaacacaat caccagaagc cactgtcaaa caaacgagga 840

aaagatgcca gcatgtcaaa tggttccact gagttaaatg gtcacaatgg atttcctacg 900

aattcggaat cgctttcaca aggtaatgct atcactggtt tatctaaaag agaccgagaa 960

tctgggaatg agcagttgtc aggttctagt gatggtgagg atgttggtga tcatgatgga 1020

acagatgaaa aaggatattg tgctgatcct gaacagaaga aaaggataat agagtcagct 1080

tctcatagga caataacaga accaaggatc attgtgcaga caacaagcga agtggacctc 1140

cttgacgatg gttatagatg gcgcaaatat gggcaaaaag tggttaaagg aaaccctcat 1200

ccaaggagtt attacaagtg caccaatgcc ggatgcgctg ttcgcaaaca tgtcgagagg 1260

gcgtcgaaag atcccaaagc agtcataaca acttatgaag gtaagcacaa tcatgatgta 1320

cctgctgctc gcaacagcgg ccataacaca gcctctattg cttccagtag ctccaaacct 1380

cagaacatca tttctgccaa tcagaacatt catggtcgat cagacctatt acacgaagtg 1440

catcgaccga ttgctgttct tcaactgaaa gaagaacatg agatcttata g 1491

<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> 春兰Cymbidium goeringii

<400> 2

Met Ala Glu Asn Ile Arg Glu Ala Ala Val Gly His Thr Glu Ala Lys

1 5 10 15

Arg Pro Ser Val Ser Leu Pro Ser Gly Pro Thr Val Glu Ser Leu Phe

20 25 30

Arg Leu Glu Pro Ala Glu Ala Ser Pro Ser Pro Met Asn Leu Val Ser

35 40 45

Ser Phe Phe Ser Glu Asp Pro Glu Ser Glu Cys Arg Ser Phe Ser Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Gly Ala Met Thr Ser Pro Thr Ala Arg Thr Ala Pro Glu

65 70 75 80

Ala Ala Ala Gly Asp Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Leu Asn Leu Gly

85 90 95

Gln Ser Arg Pro Leu Asn Met Leu Leu Gly Gln Ser Pro Phe Ile Thr

100 105 110

Ala Pro Thr Glu Leu Ser Ser Gly Gly Leu Leu Asp Phe Pro Thr Thr

115 120 125

Phe Ser Ser Asn Thr Ala Gln Phe Gly Leu Ser His Gln Gln Ala Thr

130 135 140

His Ser Gln Phe Arg Met His Met Gln Ala Glu Asn Pro Ser Ser Leu

145 150 155 160

Leu Ser Ala Ser Leu Ser Gln Ser Phe Pro Thr Ala Lys Met Ser Lys

165 170 175

Val Leu His Val Pro Ala Met Thr Leu Asp Ser Asn Ala His Gly Ser

180 185 190

Glu Ala Asp Met Ala Ser His Ser Asp Gln Ile Pro His Pro Val Pro

195 200 205

Ile Val Val Asp Lys Pro Val Asp Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr

210 215 220

Gly Gln Lys Gln Val Lys Gly Ser Glu Tyr Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys

225 230 235 240

Cys Thr His Pro Asn Cys Pro Val Lys Lys Lys Val Glu Arg Ser Leu

245 250 255

Asp Gly Gln Val Thr Glu Ile Ile Tyr Lys Gly Lys His Asn His Gln

260 265 270

Lys Pro Leu Ser Asn Lys Arg Gly Lys Asp Ala Ser Met Ser Asn Gly

275 280 285

Ser Thr Glu Leu Asn Gly His Asn Gly Phe Pro Thr Asn Ser Glu Ser

290 295 300

Leu Ser Gln Gly Asn Ala Ile Thr Gly Leu Ser Lys Arg Asp Arg Glu

305 310 315 320

Ser Gly Asn Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ser Asp Gly Glu Asp Val Gly

325 330 335

Asp His Asp Gly Thr Asp Glu Lys Gly Tyr Cys Ala Asp Pro Glu Gln

340 345 350

Lys Lys Arg Ile Ile Glu Ser Ala Ser His Arg Thr Ile Thr Glu Pro

355 360 365

Arg Ile Ile Val Gln Thr Thr Ser Glu Val Asp Leu Leu Asp Asp Gly

370 375 380

Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn Pro His

385 390 395 400

Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Ala Gly Cys Ala Val Arg Lys

405 410 415

His Val Glu Arg Ala Ser Lys Asp Pro Lys Ala Val Ile Thr Thr Tyr

420 425 430

Glu Gly Lys His Asn His Asp Val Pro Ala Ala Arg Asn Ser Gly His

435 440 445

Asn Thr Ala Ser Ile Ala Ser Ser Ser Ser Lys Pro Gln Asn Ile Ile

450 455 460

Ser Ala Asn Gln Asn Ile His Gly Arg Ser Asp Leu Leu His Glu Val

465 470 475 480

His Arg Pro Ile Ala Val Leu Gln Leu Lys Glu Glu His Glu Ile Leu

485 490 495

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

atggcggaaa acatcagag 19

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

ctataagatc tcatgttctt ctttcag 27

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

cccgggatgg cggaaaacat cagag 25

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 6

tacgtataag atctcatgtt cttctttcag ttg 33

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 7

gatagtggaa aaggaaggtg 20

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 8

tacgtataag atctcatgtt cttctttcag ttg 33

Claims

1.一种春兰CgWRKY3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的春兰CgWRKY3基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的春兰CgWRKY3基因在植物生产和育种中的应用。

4.含有权利要求1所述的春兰CgWRKY3基因的载体。