CN104450740A - 一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用 - Google Patents
一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104450740A CN104450740A CN201410783876.8A CN201410783876A CN104450740A CN 104450740 A CN104450740 A CN 104450740A CN 201410783876 A CN201410783876 A CN 201410783876A CN 104450740 A CN104450740 A CN 104450740A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alfalfa
- race
- transcription factor
- mswrky33
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白,其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法,本发明还公开了一种上述紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用。本发明在基因工程改良牧草的研究中,特别是耐盐性改良的转基因新种质创制中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域,具体涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子,本发明还涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白,本发明还涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法,本发明还涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用。
背景技术
WRKY转录因子是植物中一类比较大的转录因子家族,这类转录因子蛋白包括一个或两个保守的WRKYGQK序列(由此而命名为WRKY),C端通常有锌指结构。WRKY蛋白可以和启动子序列中的W-box结合来调节靶标基因的表达。很多证据表明:WRKY转录因子广泛的参与植物的生长发育以及各种生理过程,也参与植物抵抗逆境的过程。WRKY转录因子逆境防御功能研究取得极大进展,但大多集中在生物胁迫,如抗真菌/病原菌和虫害等生物逆境的胁迫,关于非生物胁迫研究较少。现有的研究表明,许多WRKY转录因子表达受非生物胁迫,如高盐、干旱、伤害等诱导。结构相近的WRKY基因受诱导方式基本相同,如AtWRKY25、AtWRKY33都受NaCl、干旱、冷等诱导。超表达WRKY转录因子可以提高植物抗逆性。超表达OsWRKY45增强了转基因拟南芥抗旱性和抗盐性。过表达AtWRKY25或AtWRKY33均提高了转基因拟南芥耐盐性,超表达大豆(Glycine max)GmWRKY54增强转基因拟南芥抗旱性、抗盐性;超表达GmWRKY21增强抗冷性。玉米的ZmWRKY33受高盐、干旱、冷以及外源ABA诱导,转基因拟南芥具有更强耐盐性。
紫花苜蓿是重要豆科牧草,不仅是家畜日粮中不可缺少组分,而且是生态恢复、土壤改良的优选植物。近年来,苜蓿干草消费逐年增加,同时紫花苜蓿种植面积也迅猛扩大,但干旱、高盐、冷害等非生物胁迫极大影响其产量和品质的提高。紫花苜蓿属于异花授粉的四倍体豆科牧草,其遗传转化困难,生长周期长,基因功能的研究比较滞后,到目前为止,对紫花苜蓿WRKY转录因子功能深入研究几乎是空白。因此,对这一重要豆科植物WRKY转录因子的研究,不仅在理论上有助于我们对其抗性机理的了解,为通过分子改良来增强其抗逆能力提供理论基础,同时对其它豆科植物的抗逆研究也有着积极的推动作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子,具体涉及一个紫花苜蓿抗逆相关的MsWRKY33转录因子基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。为进一步研究紫花苜蓿WRKY基因的功能,以及WRKY转录因子基因改良牧草抗逆性,特别是分子改良抗盐性的应用奠定基础。
本发明的另一目的是提供一种紫花苜蓿盐诱导MsWRKY33转录因子的编码蛋白。
本发明的另一目的是提供一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种上述的紫花苜蓿盐诱导MsWRKY33转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。
本发明所采用的第一技术方案是,一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所采用的第二技术方案是,一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白,其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所采用的第三技术方案是,一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法,具体按照以下步骤实施:
步骤1、采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA;
步骤2、对步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE克隆基因cDNA全长,并对PCR产物进行胶回收;
步骤3、构建PCR产物的重组质粒,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到菌液;
步骤4、对得到的菌液进行PCR检测,挑选阳性菌液,送Invitrogen公司进行测序,将序列进行拼接,得到紫花苜蓿MsWRKY33转录因子序列,紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述技术方案中,
进一步地,采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA具体按照以下步骤实施:
步骤1.1、将0.3g左右紫花苜蓿材料加入大约3000μl Trizol试剂,加入液氮快速磨碎,放在无菌环境中直至变为匀浆;
步骤1.2、用移液枪吸取大约1mL匀浆到1.5mL Eppendorf离心管中,剧烈振荡混匀,于室温放置5min,4℃,13000rpm离心10min;
步骤1.3、取上清,加入200μL氯仿,剧烈振荡,室温放置2-3min,4℃,13,000rpm离心15min;
步骤1.4、溶液从下到上依次分为三层:有机相、蛋白质、无色水相;取上层移入新Eppendorf离心管,加等体积氯仿,重复第3步;
步骤1.5、取其上清加入等体积异丙醇,混合混匀,室温放置10min左右,4℃,13,000rpm离心10min,得到白色RNA沉淀;
步骤1.6、弃上清,加1000μL用DEPC水配制的75%乙醇,将沉淀冲起,于4℃,13000rpm离心10min,倒掉乙醇,留下沉淀;
步骤1.7、重复第6步,在无菌环境下晾干,加20~50μl无菌DEPC水溶解;进行RNA电泳,检测RNA提取质量,IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。
进一步地,步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE-ready cDNA合成具体按照以下步骤实施:
步骤2.1、RACE-ready cDNA的合成;
步骤2.1.1、准备缓冲液:2.0μl 5×第一链缓冲液,1.0μl、20mM的DTT,1.0μl、10mM的dNTP Mix;
步骤2.1.2、制备用于5’RACE的cDNA反应液:2.75μl RNA,1.0μl5'-CDS Primer A,制备用于3’RACE的cDNA:3.75μl RNA,1.0μl 3'-CDSPrimerA;
步骤2.1.3、将步骤2.1.2中制备好的液体混匀,离心,72℃孵育3分钟,再于42℃冷却2分钟,离心收集反应液液体;
步骤2.1.4、向5’RACE的cDNA反应液中加入1μl的SMARTer IIA oligo,离心收集液体;
步骤2.1.5、制备5’RACE和3’RACE-Ready cDNA反应液:4.0μl的步骤2.1.1得到的缓冲液,0.25μl RNA酶抑制剂40U/μl,100U、1.0μlSMARTScribe逆转录酶;
步骤2.1.6、向步骤2.1.3中得到的3’RACE和步骤2.1.4中得到的5’RACE反应液中分别加入5.25μl步骤2.1.5中得到的反应液,混合,离心收集液体;
步骤2.1.7、将制备好的反应液于42℃中孵育90分钟;70℃加热10分钟,完成Ready-cDNA的合成;
步骤2.2、cDNA末端的快速合成;
步骤2.2.1、制备足够的PCR混合液:每50μl PCR反应体系中加入以下试剂:34.5μl PCR用水,5.0μl 10×Advantage 2PCR缓冲液,1.0μl、10mM的dNTP Mix,1.0μl 50×Advantage 2聚合酶Mix,混合液体,离心收集液体;
步骤2.2.2、制备用于5’RACE的PCR反应液:2.5μl 5’RACE-ready cDNA,5.0μl UPM(10×),1.0μl GSP1,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;41.5μl的步骤2.2.1中制备的PCR混合液;
制备用于3’RACE的PCR反应:2.5μl 3’RACE–ready cDNA,5.0μlUPM(10×),1.0μl GSP2,其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;41.5μl的步骤2.2.1中制备的PCR混合液;
步骤2.2.3、RACE扩增:反应体系为:94℃30秒,72℃3分钟,共5个循环:94℃30秒,70℃3分钟,72℃3分钟,共5个循环;94℃30秒,68℃30秒,72℃3分钟,共20个循环;得到PCR产物;
取PCR产物于1.0重量%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,回收目的条带。
步骤3中的构建PCR产物的重组质粒,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到菌液,具体按照以下步骤实施:
步骤3.1、用T4DNA连接酶连接回收产物于PMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,DH5α感受态细胞在冰上融化,吸取50μl,加入5μl的DNA连接产物,混合均匀后冰浴30min;
步骤3.2、42℃热击60sec,立即冰浴3-5min;
步骤3.3、加入700μl LB液体培养基,于150r/min条件下37℃恒温振荡器上培养60min;
步骤3.4、5000rmp离心3min收集菌体;
步骤3.5、LB平板上涂布2%的l5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和50mg/ml的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷,均匀涂布平板表面,常温晾干;
步骤3.6、取100μl菌液均匀涂布于含100mg/L抗生素Amp的LB平板上,培养箱中37℃倒置培养过夜;次日将平板放入4℃放置使之充分显色
步骤3.7、挑选白色单菌落于1ml LB液体培养基中,其中,Amp终浓度100mg/L,225r/min 37℃培养过夜。
本发明所采用的第四技术方案是,上述紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用。
本发明的有益效果是:本发明基于对苜蓿中抗逆性的生物学机制的研究,一方面提供了苜蓿MsWRKY33转录因子基因及该基因编码蛋白,另一方面还提供了含有所述苜蓿MsWRKY33转录因子基因的表达载体和细胞,以及培育耐盐性提高的拟南芥的方法,还提供了它们的应用。
本发明对了解WRKY基因在牧草耐盐和其他逆境因子中的作用,对牧草抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。本发明提供的苜蓿MsWRKY33基因在拟南芥中的增强表达可以显著提高拟南芥的耐盐性。本发明的重要应用前景在于:该基因的发现为提高主要牧草植物(特别是豆科植物,如紫花苜蓿)中耐盐性提供了基因资源,在基因工程改良牧草的研究中,特别是耐盐性改良的转基因新种质创制中发挥重要作用。
附图说明
图1是对紫花苜蓿植株进行农杆菌介导的MsWRKY33基因同源转化所用的插入有MsWRKY33基因的PBI121载体的结构;
图2是转MsWRKY33基因的拟南芥株系(L1,L2,L5,L6,L9,L13)与空载体对照株系(CK)盐处理5天后的比较分析结果;
图3是转MsWRKY33基因的拟南芥株系(L1,L2,L5,L6,L9,L13)与空载体对照株系(CK)盐处理处理10天后的比较分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备
本发明提供的紫花苜蓿MsWRKY33转录因子基因是通过以下方法筛选得到的:
通过发明人之前所进行的紫花苜蓿耐盐转录组测序结果(Z.Wang,G.Yu,B,Shi,et al.,Development and Characterization of Simple Sequence Repeat(SSR)Markers Based on RNA-Sequencing of Medicago sativa and In silicoMapping onto the M.truncatula Genome.PLOS one,2014,9(3):e92029),以及BLAST对比分析,获得了一段与已公布的近源物种WRKY基因高度同源的Unigene序列。利用SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech,USA)分别对该Unigene序列进行5’RACE和3’RACE克隆,最后获得了该基因全长序列(SEQ ID NO.1)。其中,基因克隆的方法为分子生物学领域的常规实验操作,具体方法如下:
1、紫花苜蓿总RNA的提取:
紫花苜蓿总RNA的提取采用Trizol试剂法,具体步骤如下:
(1)将0.3g左右紫花苜蓿材料加入大约3000μl Trizol试剂,加入液氮快速磨碎,放在无菌环境中直至变为匀浆。
(2)用移液枪吸取大约1mL匀浆到1.5mL Eppendorf离心管中,剧烈振荡混匀,于室温放置5min,4℃,13,000rpm离心10min。
(3)取上清,加入200μL氯仿,剧烈振荡,室温放置2-3min,4℃,13,000rpm离心15min。
(4)溶液从下到上依次分为三层:有机相、蛋白质、无色水相;取上层移入新Eppendorf离心管,加等体积氯仿,重复第3步。
(5)取其上清加入等体积异丙醇,混合混匀,室温放置10min左右,4℃,13,000rpm离心10min,得到白色RNA沉淀。
(6)弃上清,加1000μL 75%乙醇(用DEPCDEPC(diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)水配制),将沉淀冲起,于4℃,13000rpm离心10min,倒掉乙醇,留下沉淀。
(7)重复第6步,在无菌环境下晾干。加20~50μl无菌DEPC水溶解。
进行RNA电泳,检测RNA提取质量,IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。
2、RACE克隆基因cDNA全长
RACE-ready cDNA的合成
(1)准备缓冲液:2.0μl 5×第一链缓冲液(First-Strand Buffer),1.0μl DTT(20mM),1.0μl dNTP Mix(10mM);
(2)制备用于5’RACE的cDNA反应液:2.75μl RNA,1.0μl 5'-CDSPrimer A,制备用于3’RACE的cDNA反应液:3.75μl RNA,1.0μl 3'-CDSPrimer A;
(3)将步骤(2)中制备好的液体混匀,短暂离心,72℃孵育3分钟,再于42℃冷却2分钟,短暂离心收集反应液液体;
(4)向5’RACE的cDNA反应液中加入1μl的SMARTer IIA oligo,短暂离心收集液体;
(5)制备5’RACE和3’RACE-Ready cDNA反应液(Master Mix):4.0μl步骤(1)中得到的缓冲液,0.25μl RNA酶抑制剂(40U/μl),1.0μlSMARTScribe逆转录酶(100U),将以上试剂混匀;
(6)向步骤(3)中得到的3’RACE和步骤(4)中得到的5’RACE反应液中分别加入5.25μl步骤(5)中得到的反应液,轻柔混合,短暂离心收集液体;
(7)将制备好的反应液于42℃中孵育90分钟;
(8)70℃加热10分钟,完成Ready-cDNA的合成。
RACE引物的设计
(1)基因特异引物(Gene-Specific Primers,GSPs)满足以下条件:23-28bp;GC含量50-70%;Tm值最好>70℃;与3’-端通用引物(UniversalPrimer Mix,试剂盒提供)不发生互补。
(2)需设计两个GSP引物,反向引物(GSP1)用于5’RACE,正向引物(GSP2)用于3’RACE。
根据以上原则,设计GSP1(5'-AGAGCAGTGATTAGACTCGGTGGCA-3',其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)和GSP2(5'-AGACCCTGGCAGAACAAGAAGCA-3',其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)两条引物。
cDNA末端的快速合成
(1)制备足够的PCR混合液(Master Mix):每50μl PCR反应体系中加入以下试剂:
34.5μl PCR用水,5.0μl 10×Advantage 2PCR缓冲液,1.0μl dNTP Mix(10mM),1.0μl 50×Advantage 2聚合酶Mix。轻轻混合液体,注意不要产生气泡,短暂离心收集液体;
(2)制备用于5’RACE的PCR反应液:2.5μl 5’RACE–ready cDNA,5.0μl UPM(10×),1.0μl GSP1;41.5μl的步骤(1)中制备的PCR混合液;
制备用于3’RACE的PCR反应:2.5μl 3’RACE–ready cDNA,5.0μlUPM(10×),1.0μl GSP2;41.5μl的步骤(1)中制备的PCR混合液;
(3)RACE扩增:反应体系为:94℃30秒,72℃3分钟,共5个循环:94℃30秒,70℃3分钟,72℃3分钟,共5个循环;94℃30秒,68℃30秒,72℃3分钟,共20个循环。
取PCR产物于1.0重量%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,回收目的条带,用T4DNA连接酶(Takara)连接回收产物于PMD18-T(Takara)载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
3重组质粒的大肠杆菌转化
(1)DH5α感受态细胞在冰上融化,吸取50μl,加入5μl的DNA连接产物,混合均匀后冰浴30min。
(2)42℃热击60sec,立即冰浴3-5min。
(3)加入700μl LB液体培养基,37℃恒温振荡器(150r/min)上培养60min。
(4)5000rmp离心3min收集菌体。
(5)LB平板上(Amp)涂布X-gal(l5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷,2%)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷,50mg/ml),使其均匀涂布平板表面,常温晾干。
(6)取100μl菌液均匀涂布于含抗生素Amp(100mg/L)的LB平板上,培养箱中37℃倒置培养过夜;次日将平板放入4℃放置使之充分显色。
(7)挑选白色单菌落于1ml LB液体培养基中(Amp终浓度100mg/L),225r/min 37℃培养过夜。
对菌液进行PCR检测,挑选阳性菌液,送Invitrogen公司进行测序。对结果进行序列拼接,结果显示该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列(1536bp)。
实施例2农杆菌介导的MsWRKY33基因转化拟南芥植株
1.1、材料与试剂
1.1.1、植物材料
供试苜蓿品种为紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1,中苜一号)。
1.1.2、农杆菌菌株和质粒载体
所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌:LBA4404(北京天恩泽基因科技有限公司)
农杆菌培养基:
试剂 | 含量(1L) |
MgSO4.7H2O | 1g/L |
蛋白胨 | 10g/L |
酵母提取物 | 1g/L |
蔗糖 | 5g/L |
琼脂(固体培养基) | 15g/L |
pH | 7.0 |
121℃高压蒸汽灭菌20min;载体:PBI 121
1.2、实验方法
1.2.1将MsWRKY33基因插入到PBI121载体质粒DNA中,具体步骤为:设计5’端包含XbaI酶切位点的上游引物和BamHI酶切位点的下游引物(F:5'-GCTCTAGAATGACCTCCTCTTTCTTCTCTGACC-3'(氨基酸序列如SEQID NO.5所示),R:5'-CGGGATCCTCAAGATAGGAAAGATTC-3'(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示),其中,下划线部分为酶切位点;用该引物从紫花苜蓿cDNA模板中扩增MsWRKY33的全长阅读框,PBI载体和目的基因全长片段经XbaI和BamHI双酶切后回收产物,经T4DNA连接酶连接,得到插入有MsWRKY33基因的PBI21载体,其含有CaMV35s启动子、MsWRKY33基因(SEQ ID NO.1)以及一个卡那霉素抗性筛选标记,进行遗传转化的时候可通过卡那霉素筛选初步鉴定获得的转基因植株。含有目的片段的质粒载体的结构图1所示。
1.2.2将插入有MsWRKY33基因的PBI21载体导入到根癌农杆菌LBA4404中,具体步骤如下:
A.向100μl农杆菌感受态细胞LBA4404中加入约1μg质粒DNA,轻轻混匀,冰浴30min;
B.于液氮中速冻1min,立即置于37℃水浴中温育5min;
C.加入800μl YEB液体培养基,28℃150rpm培养4-6h;
D.菌体涂布于含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin Sulfate)和100mg/L链霉素(streptomycin)的YEB选择平板上,28℃倒置培养两天。
E.挑取单菌落,接种于YEB液体培养基中(含50mg/L Kan和100mg/LStr),28℃震荡培养过夜。
提取导入有MsWRKY33基因的农杆菌的质粒并测序,结果显示导入基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1一致,表明含有目的基因MsWRKY33的表达载体构建成功。
1.2.3、农杆菌的培养
将导入有MsWRKY33基因的农杆菌于含有50mg/LKan和100mg/L Str的固体培养基上划平板,放于培养箱内,28℃培养。两天后,从平板上挑取单菌落,接种于含有50mg/L Kan和100mg/L Str的20ml YEB液体培养基中,180rpm,28℃培养。用摇好的菌液划平板,28℃培养,待长出单菌落后,将平板放于4℃保存。
在平板上挑取单菌落,接种于20ml含有50mg/L Kan和100mg/L Str的YEB液体培养基内,在恒温摇床上于28℃,180rpm培养。两天以后取少量菌液,以1:50-1:100的比例稀释到含50μg/m1Kan和100μg/m1Str的YEB液体培养基中,28℃培养6-12h至对数生长期。将菌体收集到离心管中,4,000rpm离心10min富集菌体,弃上清,再用约20ml不含抗生素的改良的SH液体培养基重悬菌体,使菌液的OD600值为0.6-0.8,待用。
1.2.4、拟南芥的准备:
Col生态型拟南芥种子灭菌后,将种子铺在1/2MS固体培养基的培养皿上,放在4℃下春化48小时。
将春化后的种子平板放在拟南芥培养箱(24℃16h/22℃8h)中培养,7天后,移到花盆中(蛭石:营养土:珍珠岩大约为1:1:1)。按上述方法培养拟南芥,约三星期左右,剪去已经开花的主茎,抑制顶端优势。约四星期左右,抽出的侧枝大量开花,此时是用浸润法转基因的最佳时机。
1.2.5、农杆菌培养和收获
取原菌液20μl,加入5ml YEP(yeast extract 10g/L,Tryptone10g/L,Nacl5g/L,灭菌后,添加抗生素),30℃恒温振摇过夜,将此5ml菌液倒入250mlYEP(添加抗生素),30℃恒温振摇过夜,此时,农杆菌的浓度应达到OD600=1.8。4000rpm离心15分钟,弃去上清,加入浸润法培养基(1/2MS大量+1×MS微量+1×MS铁盐+1×MS肌醇+1×MS维生素+MES0.5g/L+Sucrose5%,pH5.7高压灭菌)。使农杆菌以1:1的比例重悬于浸润培养基,并加入表面活性剂Silwet,使其终浓度达到0.02%(每升加200μl)。
1.2.6、浸润法转基因
将拟南芥花盆蒙上纱布,用橡皮筋扎紧,以免花盆倒扣时培养基质下漏。将花盆倒扣于装有250ml菌悬液的浸润罐上,使植株的花序浸没在菌液中,浸润持续2min,转化后用吸水纸吸去过多的菌液,但不需要吸得很干。转化后的植株,用保鲜膜覆盖过夜后揭膜。正常生长,收取种子。
1.2.7转基因拟南芥植株的筛选
收获的拟南芥种子70%酒精2min,5%次氯酸钠5min进行消毒。将拟南芥种子播到含50mg/L Kan的1/2Ms固体培养基的培养皿中,放到4℃低温下春化2天。在抗性培养基上正常生长的拟南芥幼苗为转化成功拟南芥,转化失败拟南芥幼苗将不能正常生长。将能正常生长的拟南芥幼苗移栽到花盆,在人工气候室条件下生长。以转基因拟南芥植株的基因组DNA为模板,以nptⅡ基因引物P3/P4(氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示),gus基因引物P5/P6(氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示)检测含pBI121-WRKY33载体转基因植株。阳性植株保留(共获得19株:L1-L19),单独收种。T1代经同样抗生素筛选,其分离比(3:1)经卡方检验,共获得6个3:1分离的株系:L1,L2,L5,L6,L9,L13。将这些株系保留收种得到T2代。从T2代中筛选纯合体,单独收种。
实施例3MsWRKY33基因的PBI21载体拟南芥幼苗的耐盐性评价
用质粒PBI21转化农杆菌,获得重组农杆菌,用重组农杆菌转化拟南芥,得到转空载体的对照植株,方法如实施例1,获得转空载体对照植物(CK),作为对比例1。
评价对比例1中得到的转空载体的紫花苜蓿和实施例1中得到的转化插入有MsWRKY33基因的PBI21载体拟南芥幼苗的耐盐性,具体方法如下:
将转基因材料和对照材料的种子灭菌,铺在装有1/2MS固体培养基的培养皿上,放在4℃条件下春化两天。春化后的平板在超净台上吹干水气,用封口膜封好,竖直放在拟南芥培养箱中培养。待种子萌动后,在超净台上将萌动的小苗移到1/2MS培养基和含有50mM NaCl的1/2MS培养基上,放回培养箱继续竖直培养。对转基因拟南芥株系(L1,L2,L5,L6,L9,L13)处理的第5天和第10天测量拟南芥的根长,进行统计分析。结果见图2:转基因植株(L1,L2,L5,L6,L9,L13)的根长比对照(CK)平均长了27%和36.7%(10天)。
Claims (7)
1.一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白,其特征在于,其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法,其特征在于,具体按照以下步骤实施:
步骤1、采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA;
步骤2、对步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE克隆基因cDNA全长,并对PCR进行胶回收;
步骤3、构建PCR产物的重组质粒,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到菌液;
步骤4、对得到的菌液进行PCR检测,挑选阳性菌液,送Invitrogen公司进行测序,将测序结果进行拼接,得到紫花苜蓿MsWRKY33转录因子全长序列,紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的紫花苜蓿WRKY转录因子的克隆方法,其特征在于,所述采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA具体按照以下步骤实施:
步骤1.1、将0.3g左右紫花苜蓿材料加入大约3000μl Trizol试剂,加入液氮快速磨碎,放在无菌环境中直至变为匀浆;
步骤1.2、用移液枪吸取大约1mL匀浆到1.5mL Eppendorf离心管中,剧烈振荡混匀,于室温放置5min,4℃,13000rpm离心10min;
步骤1.3、取上清,加入200μL氯仿,剧烈振荡,室温放置2-3min,4℃,13,000rpm离心15min;
步骤1.4、溶液从下到上依次分为三层:有机相、蛋白质、无色水相;取上层移入新Eppendorf离心管,加等体积氯仿,重复第3步;
步骤1.5、取其上清加入等体积异丙醇,混合混匀,室温放置10min左右,4℃,13,000rpm离心10min,得到白色RNA沉淀;
步骤1.6、弃上清,加1000μL用DEPC水配制的75%乙醇,将沉淀冲起,于4℃,13000rpm离心10min,倒掉乙醇,留下沉淀;
步骤1.7、重复第6步,在无菌环境下晾干,加20~50μl无菌DEPC水溶解;进行RNA电泳,检测RNA提取质量,IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。
5.根据权利要求3所述的紫花苜蓿WRKY转录因子的克隆方法,其特征在于,所述对步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE-ready cDNA合成具体按照以下步骤实施:
步骤2.1、RACE-ready cDNA的合成;
步骤2.1.1、准备缓冲液:2.0μl 5×第一链缓冲液,1.0μl、20mM的DTT,1.0μl、10mM的dNTP Mix;
步骤2.1.2、制备用于5’RACE的cDNA反应液:2.75μl RNA,1.0μl5'-CDS Primer A,制备用于3’RACE的cDNA:3.75μl RNA,1.0μl 3'-CDSPrimer A;
步骤2.1.3、将步骤2.1.2中制备好的液体混匀,离心,72℃孵育3分钟,再于42℃冷却2分钟,离心收集反应液液体;
步骤2.1.4、向5’RACE的cDNA反应液中加入1μl的SMARTer IIA oligo,离心收集液体;
步骤2.1.5、制备5’RACE和3’RACE-Ready cDNA反应液:4.0μl的步骤2.1.1得到的缓冲液,0.25μl RNA酶抑制剂40U/μl,100U、1.0μlSMARTScribe逆转录酶;
步骤2.1.6、向步骤2.1.3中得到的3’RACE和步骤2.1.4中得到的5’RACE反应液中分别加入5.25μl步骤2.1.5中得到的反应液,混合,离心收集液体;
步骤2.1.7、将制备好的反应液于42℃中孵育90分钟;70℃加热10分钟,完成Ready-cDNA的合成;
步骤2.2、cDNA末端的快速合成;
步骤2.2.1、制备足够的PCR混合液:每50μl PCR反应体系中加入以下试剂:34.5μl PCR用水,5.0μl 10×Advantage 2PCR缓冲液,1.0μl、10mM的dNTP Mix,1.0μl 50×Advantage 2聚合酶Mix,混合液体,离心收集液体;
步骤2.2.2、制备用于5’RACE的PCR反应液:2.5μl 5’RACE-ready cDNA,5.0μl UPM(10×),1.0μl GSP1,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;41.5μl的步骤2.2.1中制备的PCR混合液;
制备用于3’RACE的PCR反应:2.5μl 3’RACE–ready cDNA,5.0μlUPM(10×),1.0μl GSP2,其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;41.5μl的步骤2.2.1中制备的PCR混合液;
步骤2.2.3、RACE扩增:反应体系为:94℃30秒,72℃3分钟,共5个循环:94℃30秒,70℃3分钟,72℃3分钟,共5个循环;94℃30秒,68℃30秒,72℃3分钟,共20个循环;得到PCR产物;
取PCR产物于1.0重量%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,回收目的条带。
6.根据权利要求3所述的紫花苜蓿WRKY转录因子的克隆方法,其特征在于,所述步骤3中的构建PCR产物的重组质粒,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到菌液,具体按照以下步骤实施:
步骤3.1、用T4DNA连接酶连接回收产物于PMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,DH5α感受态细胞在冰上融化,吸取50μl,加入5μl的DNA连接产物,混合均匀后冰浴30min;
步骤3.2、42℃热击60sec,立即冰浴3-5min;
步骤3.3、加入700μl LB液体培养基,于150r/min条件下37℃恒温振荡器上培养60min;
步骤3.4、5000rmp离心3min收集菌体;
步骤3.5、LB平板上涂布2%的l5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和50mg/ml的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷,均匀涂布平板表面,常温晾干;
步骤3.6、取100μl菌液均匀涂布于含100mg/L抗生素Amp的LB平板上,培养箱中37℃倒置培养过夜;次日将平板放入4℃放置使之充分显色
步骤3.7、挑选白色单菌落于1ml LB液体培养基中,其中,Amp终浓度100mg/L,225r/min 37℃培养过夜。
7.一种权利要求1所述的紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410783876.8A CN104450740B (zh) | 2014-12-16 | 2014-12-16 | 一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410783876.8A CN104450740B (zh) | 2014-12-16 | 2014-12-16 | 一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104450740A true CN104450740A (zh) | 2015-03-25 |
CN104450740B CN104450740B (zh) | 2016-06-15 |
Family
ID=52897491
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410783876.8A Active CN104450740B (zh) | 2014-12-16 | 2014-12-16 | 一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104450740B (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106350537A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-25 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID转化紫花苜蓿的方法 |
CN109576284A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-05 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一个多功能的myb转录因子基因及其用途 |
CN110804090A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-02-18 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 蛋白质CkWRKY33及其编码基因与应用 |
CN111304220A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-06-19 | 南京林业大学 | 一种春兰CgWRKY3基因及其应用 |
CN111635903A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-08 | 哈尔滨师范大学 | 一种增强植物生存能力的方法 |
CN115894647A (zh) * | 2022-09-05 | 2023-04-04 | 上海交通大学 | 一种紫花苜蓿MsWRKY41转录因子及其应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4997376B2 (ja) * | 2005-05-26 | 2012-08-08 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 転写因子遺伝子の導入による植物の病害抵抗性の改良 |
CN102939384A (zh) * | 2010-02-24 | 2013-02-20 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 在植物中赋予胁迫耐受性的基因及其用途 |
CN103031282A (zh) * | 2011-09-30 | 2013-04-10 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 紫花苜蓿花青素还原酶基因及其编码的蛋白和应用 |
CN103929947A (zh) * | 2011-09-16 | 2014-07-16 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
CN104004767A (zh) * | 2013-02-25 | 2014-08-27 | 先锋海外公司 | Wrky转录因子多肽基因应用的载体和方法 |
CN104059937A (zh) * | 2013-03-18 | 2014-09-24 | 中国农业大学 | 一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途 |
-
2014
- 2014-12-16 CN CN201410783876.8A patent/CN104450740B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4997376B2 (ja) * | 2005-05-26 | 2012-08-08 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 転写因子遺伝子の導入による植物の病害抵抗性の改良 |
CN102939384A (zh) * | 2010-02-24 | 2013-02-20 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 在植物中赋予胁迫耐受性的基因及其用途 |
CN103929947A (zh) * | 2011-09-16 | 2014-07-16 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
CN103031282A (zh) * | 2011-09-30 | 2013-04-10 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 紫花苜蓿花青素还原酶基因及其编码的蛋白和应用 |
CN104004767A (zh) * | 2013-02-25 | 2014-08-27 | 先锋海外公司 | Wrky转录因子多肽基因应用的载体和方法 |
CN104059937A (zh) * | 2013-03-18 | 2014-09-24 | 中国农业大学 | 一个来源于苜蓿的蛋白质及其编码基因的新用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
YOUNG,N.D.等: "GenBank登录号:XM_003599239.1", 《GENBANK数据库》 * |
崔琰,等: "小麦成熟胚脱分化过程中WRKY 家族转录因子基因及其下游基因的表达.", 《植物生理学通讯》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106350537A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-25 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID转化紫花苜蓿的方法 |
CN109576284A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-05 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一个多功能的myb转录因子基因及其用途 |
CN110804090A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-02-18 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 蛋白质CkWRKY33及其编码基因与应用 |
CN111304220A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-06-19 | 南京林业大学 | 一种春兰CgWRKY3基因及其应用 |
CN111304220B (zh) * | 2020-04-16 | 2022-04-26 | 南京林业大学 | 一种春兰CgWRKY3基因及其应用 |
CN111635903A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-08 | 哈尔滨师范大学 | 一种增强植物生存能力的方法 |
CN115894647A (zh) * | 2022-09-05 | 2023-04-04 | 上海交通大学 | 一种紫花苜蓿MsWRKY41转录因子及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104450740B (zh) | 2016-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104450740A (zh) | 一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用 | |
CN107435047B (zh) | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 | |
CN106244607B (zh) | 棉花细胞色素p450 cyp94c1基因在抗黄萎病中的应用 | |
CN104829700A (zh) | 一种玉米CCCH型锌指蛋白及其编码基因ZmC3H54与应用 | |
CN104357456A (zh) | 葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列及其应用 | |
CN117660478A (zh) | 一种提高马铃薯对晚疫病抗性的基因及应用 | |
CN109879947B (zh) | 毛竹转录因子PheDof 2基因及应用 | |
CN113754748A (zh) | 一种提高水稻抗虫抗病力的多肽免疫激活剂 | |
CN110358776A (zh) | 一种水稻纹枯病菌致病相关基因及其应用 | |
CN112430584B (zh) | 一种杜梨泛素连接酶基因、编码蛋白及其在植物抗旱遗传改良中的应用 | |
CN104004073B (zh) | 来源于小麦的抗病性相关蛋白TaCPK7-R及其相关生物材料与应用 | |
CN103290014B (zh) | 一个逆境诱导表达的基因启动子及其应用 | |
CN107937417A (zh) | 一种来自棉花抗病耐旱蛋白基因GhSNAP33及其应用 | |
CN103275202A (zh) | 来源于小麦的抗病性相关蛋白rcr1及其相关生物材料与应用 | |
CN106892973A (zh) | 植物抗逆性相关蛋白GhMYB4及编码基因与应用 | |
CN108559753B (zh) | 小麦条锈菌pstg_17694基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法 | |
CN102732553B (zh) | 提高植物产量的基因工程方法及材料 | |
CN105087587A (zh) | 花生Δ12脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因的启动子及其应用 | |
CN112195178B (zh) | 番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法 | |
CN105505956A (zh) | 一种紫花苜蓿对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因及应用 | |
CN102336826A (zh) | 一种大豆逆境相关转录因子erf及其编码基因与应用 | |
CN103088053B (zh) | 高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法 | |
CN102115751A (zh) | 油菜BnPABP5基因及其启动子的应用 | |
CN104450708A (zh) | 一个受高盐和水杨酸诱导的逆转录转座子启动子及其应用 | |
CN104611335A (zh) | 花生特异启动子AhRSP与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |