JP4997376B2 - 転写因子遺伝子の導入による植物の病害抵抗性の改良 - Google Patents
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Description
(1)植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)から(d)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(d)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(2)植物が単子葉植物由来である、(1)に記載のDNA。
(3)植物の病害が糸状菌性の病害である、(1)に記載のDNA。
(4)植物の病害が細菌性の病害である、(1)に記載のDNA。
(5)(1)から(4)のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
(6)(5)に記載のベクターが導入された宿主細胞。
(7)(5)に記載のベクターが導入された植物細胞。
(8)(7)に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。
(9)(8)に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
(10)(8)または(9)に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
(11)(1)から(4)のいずれかに記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法。
(12)(1)から(4)のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質。
(13)(6)に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、(12)に記載のタンパク質の製造方法。
(14)(12)に記載のタンパク質に結合する抗体。
(15)配列番号:1に記載の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むポリヌクレオチド。
(16)(1)から(4)のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させる工程を含む、植物の病害への抵抗性を向上させる方法。
(17)(1)から(4)のいずれかに記載のDNA、もしくは(5)に記載のベクターを有効成分とする、植物の病害への抵抗性を向上させる薬剤。
本発明において、「植物の病害」とは、糸状菌(主にカビ)、細菌、ウイルスなどの病原体によって引き起こされる植物の生理障害に相当し、農業生産や生態環境を損なう危険性のあるものをいう。病原体は特に限定されず、上記3つの病原体の他に、放線菌類、藻類、ファイトプラズマ(植物病原微生物)等による病害も存在する。
本発明において、病害が発症する植物は特に限定されるものではないが、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくはイネ科植物であり、最も好ましくはイネである。
糸状菌類の病害には様々な症状が存在し、茎葉に病斑を作るものや腐敗させるもの、地際や根を侵して立ち枯れを招くもの、コブなどのできものを作るもの、などがある。糸状菌性の病態の大きな傾向としては、発病部分に粉のようなカビや、黒い粒々(菌核=菌糸の塊)を生じることがよくある。イネにおける糸状菌性の代表的な病害としては、イネ褐色米病、イネ褐色菌核病、イネ褐色米病、イネ黄化萎縮病、イネ褐色葉枯病、イネ褐色小粒菌核病、イネ眼斑病、イネ黒しゅ病、イネごま葉枯病、イネシナモン色かび病、イネ小球菌核病、イネシナモン色かび病、イネ墨黒穂病、イネ赤色菌核病などを挙げることが出来る。実施例におけるモデル病態であるイネいもち病も、糸状菌性病害にあたるが、この病態に制限されるものではない。
病害への抵抗性の向上効果は、植物の生存期間内は継続的に続く効果であってもよいし、ある一定期間(例えば、生育初期段階のみ)に発現する効果であってもよい。
また、複数の病原体に対して抵抗性を持つものであってもよいし、ある特定の病原体にのみ抵抗性を持つものであってもよい。
本発明の転写因子遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号:1に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:2に示す。
本発明の転写因子は、植物の病害への抵抗性を向上させる作用を有していることから、該タンパク質をコードするDNAで植物を形質転換することにより、病原体に対する抵抗力を持った植物の育成が可能である。
本発明の薬剤においては、有効成分であるDNAまたはベクター以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕BTHによって発現誘導される転写因子遺伝子の検出
BTHによって発現誘導される転写因子遺伝子を検出するために、播種後10日目のイネの幼苗(3.5葉期)に対して0.5 mM BTH (0.01% Tween20/0.5%アセトン0.5 mM BTHを処理し、BTH処理およびmock処理したイネの葉から経時的(12,24、72、120時間)に調整したRNAを用いてイネ22Kアレイ(Agilent)によるマイクロアレイ解析を行った。その結果、BTH処理によって発現誘導を受けるWRKY型転写因子遺伝子(OsWRKY45,AK066255,配列番号:1および2)を見出した。ノーザンブロッティング解析の結果、OsWRKY45はBTH処理後3時間以内に発現誘導を受けることを見出した(図1)。
OsWRKY45遺伝子を植物で構成的に発現させるためのベクターは以下のような手順で作製した。まず、pUCAP/35S-NT (Kapoor et al. 2002) をHindIII-BamHIで切断し、pAHC27 (Christensen and Quail 1996) 由来のトウモロコシUbi-1 プロモーターを含むHindIII-BamHI断片を挿入した。次に、このプラスミドをUbi-1 プロモーターと Nosターミネーターの間のBamHI-SacIで切断し、相補的オリゴ DNA (top 鎖:5'-GATCTGGCCAAATCGGCCGGTACCGGATCCGCGGCCGCGAGTC(配列番号:3)及びbottom 鎖:CGCGGCCGCGGATCCGGTACCGGCCGATTTGGCCA (配列番号:4)をアニールしたもの)を挿入してUbi-1 プロモーターと Nosターミネーターの間にSfiI、BamHI部位を有するpUCAP/Ubi-NT を作製した。pUCAP/Ubi-NT をSfiI-BamHIで切断し、OsWRKY45遺伝子の完全長 cDNA を含むSfiI-BamHI断片を挿入した。最後に、このプラスミドをHindIII-PacIで切断し、HindIII-PacIで切断した pZH1 に挿入し、OsWRKY45遺伝子高発現ベクター pZH-Ubi-W45-NT を作製した(図2)。
プラスミドpZH-Ubi-W45-NTをAgrobacterium tumefaciens EHA101株に導入するために、Agrobacterium tumefaciens EHA101株を、5mlのYEB培地(0.1%酵母抽出物、0.5%肉抽出物、0.5%ペプトン、0.5%スクロース、0.05%MgSO4・7H2O)において、30℃で一晩振盪培養した。次いで、1リットルフラスコ中で200mlのYEB培地に5mlの上記培養物を加え、さらに30℃で5〜6時間培養した。遠心分離(4000rpmで5分間)により菌体を集め、そして100mlの10mM Tris-HCl(pH 8.0)中に懸濁した。再度、遠心分離を行い、得られた菌体を2mlのYEB培地中に懸濁した。微量遠心チューブ中でこの懸濁液の200μlと0.5μgのpBE7133H-Thioninを含む100μlのDNA溶液とを混合し、ドライアイス/エタノール浴中で凍結させた(5分間)。次いで、37℃の温浴中で融解し、25分間放置した。その後、2mlのYEB培地を添加し、30℃で1時間、振盪培養した。100μlの培養液をカナマイシン(50μg/ml)およびハイグロマイシン(50μg/ml)を含有するYEB培地上に塗布し、そして30℃で約36時間の培養によりAgrobacterium tumefaciens EHA101株の耐性菌を得た。このAgrobacterium tumefaciens EHA101株中のチオニン発現カセットをアルカリ-SDS法により単離して、制限酵素分析によりその存在および構造を確認した。
滅菌したイネの種子を、2mg/mlの2.4-ジクロロフェノキシ酢酸(以下2.4-D)を含むMS培地(T. Murashige et al., Physiol. Plant., 15, 473 (1962))で27℃で2週間培養し、カルスを形成させた。このカルスを共存培地(2mg/ml 2.4-Dおよび1g/l カザミノ酸を含むMS培地)に移植し、27℃で培養を行った。培養3日目に、カナマイシンおよびハイグロマイシンを含むYEB培地で上記チオニン発現カセットを含むAgrobacterium tumefaciens EHA101株を増殖させ、遠心分離した。ペレット化した菌体をLB培地に懸濁させた後、アセトシリンゴンを添加して感染用のAgrobacterium tumefaciens EHA101株菌液を作製した。この菌液を30℃で20分間保温した。培養4日目に感染用Agrobacterium tumefaciens EHA101株菌液に上記カルス塊を加え、30℃で15分間緩やかに撹拌して、このカルス塊を感染させた。15分後にカルスを回収し、共存培地に置床した。27℃、16時間日長で3日間培養し、次いで、カルベニシリンを含むLB培地にて30℃で1時間培養し、その後、カルスのみを回収して選抜(増殖)培地(500mg/l カルベニシリン、50mg/l ハイグロマイシンを含む共存培地)に置床した。これを、27℃、16時間日長で2週間培養した。新たに増殖してきた黄白色のカルスを選抜(再分化前処理)培地(1mg/l 2.4-D、0.5mg/l BAP、2g/l カザミノ酸、20g/l ショ糖、30g/l ソルビトール、500mg/l カルベニシリン、100mg/l ハイグロマイシンを含むN6培地)に移植し、約2週間培養した後、選抜(再分化)培地(0.01mg/l β-ナフタレン酢酸(NAA)、0.1mg/l BAP、1g/l カザミノ酸、500mg/lカルベニシリン、100mg/lハイグロマイシンを含むN6培地)に移植した。約2〜3週間で再分化した形質転換イネが得られた。
OsWRKY45過剰発現体によるいもち病抵抗性の変化を検定するために、播種後グロースチャンバー内における生育15日目のOsWRKY45過剰発現体と非形質転換体のイネ幼苗(4葉期)にいもち菌(race 007)を接種し、7日後に第4葉中心付近5cm長における病斑数を計数した。4系統のOsWRKY45過剰発現体(OsWRKY45-ox)のT1世代について検定した結果、いもち病感染による病斑数が非形質転換体に比べて顕著に減少しており(図3)、いもち病抵抗性が改善していることがわかった。これらの形質転換体は発芽後2,3葉期までの初期生育に若干の遅延を示し、栽培条件によって軽微な疑似病斑が出現したが、それ以外は、非形質転換体と同様に生育した。また、稔実率について顕著な影響は認められない。これらのことからOsWRKY45過剰発現による植物生長等への影響は少ないものと考えられる。
実施例5では、グロースチャンバーにて生育させたOsWRKY45過剰発現イネにおいて、いもち病抵抗性が発現したことを示した。本実施例では、生育条件が抵抗性発現に及ぼす影響を調べるため、温室内で生育させたOsWRKY45過剰発現イネについても、実施例5と同様にいもち病検定を行った。その結果、温室で生育したOsWRKY45過剰発現イネも、グロースチャンバーで生育させた場合と同じく、顕著ないもち病抵抗性を示した(図4)。
OsWRKY45過剰発現が形質転換体の生育に及ぼす影響を調べるため、いもち病抵抗性を示した形質転換体(5系統)のT2ホモ個体を温室で生育させ、播種後7週目における生育を調査した。その結果、葉齢、草丈、分げつ数の3項目において、4系統(#15, 19, 21, 24)には若干の生育遅延が認められたが、系統#23は非形質転換体とほとんど変わらない数値を示した(図5)。これらの結果は、OsWRKY45過剰発現がイネの生育に及ぼす影響は比較的小さく、適当な形質転換系統を選ぶことで、生育をほとんど犠牲にすることなくいもち病抵抗性を高められることを示している。これは実用レベルで本遺伝子の利用を考える際の重要なポイントである。
PR遺伝子の発現はしばしば病害抵抗性応答のマーカーとして用いられる。そこで2種類のPR遺伝子(PR1b,PR2)の発現を、2つの異なる環境(グロースチャンバーおよび温室)で育てたOsWRKY45過剰発現体イネについて調べた(図6)。OsWRKY45 (AK066255,塩基番号1126-1426)、PR-1b (AK107926,塩基番号577-793)、PR2 (AK070677,塩基番号1095-1295) のcDNAをそれぞれプローブとし、異なる条件で生育させたイネから抽出したRNAを用いて、ノーザン・ブロッティングによって発現解析した。
その結果、グロースチャンバー生育OsWRKY45過剰発現イネでは両PR遺伝子が恒常的に発現していたのに対し、温室生育OsWRKY45過剰発現イネではいずれのPR遺伝子の発現も認められなかった。この結果は、生育条件に関わらず高いいもち病抵抗性が認められた結果(実施例5および実施例6)と対照的である。同様のPR遺伝子の発現の生育条件依存性は、非形質転換体イネをBTH処理した場合にも認められた。この結果は、BTHの作用(potentiation)がOsWRKY45過剰発現によって再現されていることを強く支持している。
RNAiによりOsWRKY45の発現を抑制した形質転換イネを作製するため、下記の方法によりプラスミドを構築した。OsWRKY45 cDNAの3’非翻訳領域の一部(塩基番号1047-1535)をPCR増幅し、pANDA ベクター(Miki, D., and Shimamoto, K. (2004). Simple RNAi vectors for stable and transient suppression of gene function in rice. Plant Cell Physiol. 45, 490-495.、Miki, D., Itoh, R., and Shimamoto, K. (2005). RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice. Plant Physiol. 138, 1903-1913.)中のユビキチン・プロモーターの下流に、リンカー配列(GUS)をはさんでアンチセンス、センス配列の順に配置されるように挿入した(図7)。プラスミド構築の手順は、中間ベクターとしてpENTRの代わりにpDONR207を用いた以外は、Mikiらの手順に従って行った(Miki, D., and Shimamoto, K. (2004). Simple RNAi vectors for stable and transient suppression of gene function in rice. Plant Cell Physiol. 45, 490-495.、Miki, D., Itoh, R., and Shimamoto, K. (2005). RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice. Plant Physiol. 138, 1903-1913.)。
OsWRKY45過剰発現体イネがイネ白葉枯病菌に対して抵抗性を示すか否かを、剪葉接種法(Kauffman, 1973)を用いて評価した。すなわち、イネ白葉枯病菌T7174株(レースI代表菌株)を脇本培地において25℃で2日間斜面培養後、滅菌蒸留水で希釈し、108 cfu/mlの濃度の細菌浮遊液とし、これを接種源とした。接種は供試イネ(播種後48日)完全展開葉の葉の先端から約5cmを接種源に漬けた外科用鋏で剪除して行った。接種イネは隔離温室で管理し、接種後2週間後に葉先からの病斑長を測定した。その結果、OsWRKY45過剰発現体イネ(T2ホモ個体)では、対照の非形質転換体(日本晴)に較べて、病斑の進展が顕著に抑制されていた(図9)。この結果から、OsWRKY45過剰発現体イネは、イネ白葉枯病に対しても強い抵抗性を示すことが明らかになった。
最近、アラビドプシスでは、WRKY型転写因子の一つであるWRKY70の導入により、糸状菌Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性が高まることが報告された (Li, J., Brader, G., Kariola, T., and Palva, E.T. (2006). WRKY70 modulates the selection of signaling pathways in plant defense. Plant J. 46, 477-491.)。アラビドプシスのWRKY70は、病害抵抗性シグナル伝達経路のキー因子であるNPR1の変異体npr1では、サリチル酸による発現誘導が著しく低下している。このことから、WRKY70はNPR1の下流の転写因子と考えられる。そこでWRKY70とOsWRKY45の機能の比較のため、NPR1のイネ・ホモログであるNH1(Chern, M., Fitzgerald, H.A., Canlas, P.E., Navarre, D.A., and Ronald, P.C. (2005). Overexpression of a rice NPR1 homolog Leads to constitutive activation of defense response and hypersensitivity to light. Mol. Plant-Microbe Int. 18, 511-520.)のRNAi抑制体において、PR1bおよびOsWRKY45のBTHによる発現誘導を調べた。その結果、NH1 のRNAi抑制体では、PR1bのBTH発現誘導は完全に失われているが、OsWRKY45の発現誘導はまったく影響を受けないことが示された(図10)。このことは、OsWRKY45は、NH1の下流ではないことを示しており、OsWRKY45とWRKY70の機能は異なることを示している。
OsWRKY45導入形質転換体は、初期生育時における若干の生育遅延と軽微な擬似病斑形成が見られたのみで、生育および稔実率に関して顕著な悪影響は認められない。病害への抵抗性効果、副作用の低さの両面でBTH等の病害予防薬剤に匹敵することから、現場で用いられる実用技術に発展する可能性があるものと考えられる。
Claims (15)
- 植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記(a)から(c)のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号:2に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。 - 植物が単子葉植物由来である、請求項1に記載のベクター。
- 植物の病害が糸状菌性の病害である、請求項1に記載のベクター。
- 植物の病害が細菌性の病害である、請求項1に記載のベクター。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のベクターが導入された宿主細胞。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のベクターが導入された植物細胞。
- 請求項6に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。
- 請求項7に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
- 請求項7または8に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
- 請求項1から4のいずれかに記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法。
- 下記(a)から(c)のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号:2に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列の相同性を有するアミノ酸配列からなる、植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項5に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項11に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項11に記載のタンパク質に結合する抗体。
- 下記(a)から(c)のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させる工程を含む、植物の病害への抵抗性を向上させる方法。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号:2に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列の相同性を有するアミノ酸配列からなる、植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするDNA。 - 下記(a)から(c)のいずれかに記載のDNA、もしくは請求項1から4のいずれかに記載のベクターを有効成分とする、植物の病害への抵抗性を向上させる薬剤。
(a)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
(b)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号:2に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列の相同性を有するアミノ酸配列からなる、植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするDNA。
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