CN104450740B - 一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明还公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明还公开了一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法，本发明还公开了一种上述紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用。本发明在基因工程改良牧草的研究中，特别是耐盐性改良的转基因新种质创制中发挥重要作用。

Description

一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子及其编码蛋白、制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子，本发明还涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白，本发明还涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法，本发明还涉及一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用。

背景技术

WRKY转录因子是植物中一类比较大的转录因子家族，这类转录因子蛋白包括一个或两个保守的WRKYGQK序列(由此而命名为WRKY)，C端通常有锌指结构。WRKY蛋白可以和启动子序列中的W-box结合来调节靶标基因的表达。很多证据表明：WRKY转录因子广泛的参与植物的生长发育以及各种生理过程，也参与植物抵抗逆境的过程。WRKY转录因子逆境防御功能研究取得极大进展，但大多集中在生物胁迫，如抗真菌/病原菌和虫害等生物逆境的胁迫，关于非生物胁迫研究较少。现有的研究表明，许多WRKY转录因子表达受非生物胁迫，如高盐、干旱、伤害等诱导。结构相近的WRKY基因受诱导方式基本相同，如AtWRKY25、AtWRKY33都受NaCl、干旱、冷等诱导。超表达WRKY转录因子可以提高植物抗逆性。超表达OsWRKY45增强了转基因拟南芥抗旱性和抗盐性。过表达AtWRKY25或AtWRKY33均提高了转基因拟南芥耐盐性，超表达大豆(Glycinemax)GmWRKY54增强转基因拟南芥抗旱性、抗盐性；超表达GmWRKY21增强抗冷性。玉米的ZmWRKY33受高盐、干旱、冷以及外源ABA诱导，转基因拟南芥具有更强耐盐性。

紫花苜蓿是重要豆科牧草，不仅是家畜日粮中不可缺少组分，而且是生态恢复、土壤改良的优选植物。近年来，苜蓿干草消费逐年增加，同时紫花苜蓿种植面积也迅猛扩大，但干旱、高盐、冷害等非生物胁迫极大影响其产量和品质的提高。紫花苜蓿属于异花授粉的四倍体豆科牧草，其遗传转化困难，生长周期长，基因功能的研究比较滞后，到目前为止，对紫花苜蓿WRKY转录因子功能深入研究几乎是空白。因此，对这一重要豆科植物WRKY转录因子的研究，不仅在理论上有助于我们对其抗性机理的了解，为通过分子改良来增强其抗逆能力提供理论基础，同时对其它豆科植物的抗逆研究也有着积极的推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子，具体涉及一个紫花苜蓿抗逆相关的MsWRKY33转录因子基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。为进一步研究紫花苜蓿WRKY基因的功能，以及WRKY转录因子基因改良牧草抗逆性，特别是分子改良抗盐性的应用奠定基础。

本发明的另一目的是提供一种紫花苜蓿盐诱导MsWRKY33转录因子的编码蛋白。

本发明的另一目的是提供一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种上述的紫花苜蓿盐诱导MsWRKY33转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。

本发明所采用的第一技术方案是，一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明所采用的第二技术方案是，一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的编码蛋白，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明所采用的第三技术方案是，一种紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA；

步骤2、对步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE克隆基因cDNA全长，并对PCR产物进行胶回收；

步骤3、构建PCR产物的重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到菌液；

步骤4、对得到的菌液进行PCR检测，挑选阳性菌液，送Invitrogen公司进行测序，将序列进行拼接，得到紫花苜蓿MsWRKY33转录因子序列，紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

上述技术方案中，

进一步地，采用Trizol试剂法提取紫花苜蓿总RNA具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、将0.3g左右紫花苜蓿材料加入大约3000μlTrizol试剂，加入液氮快速磨碎，放在无菌环境中直至变为匀浆；

步骤1.2、用移液枪吸取大约1mL匀浆到1.5mLEppendorf离心管中，剧烈振荡混匀，于室温放置5min，4℃，13000rpm离心10min；

步骤1.3、取上清，加入200μL氯仿，剧烈振荡，室温放置2-3min，4℃，13,000rpm离心15min；

步骤1.4、溶液从下到上依次分为三层：有机相、蛋白质、无色水相；取上层移入新Eppendorf离心管，加等体积氯仿，重复第3步；

步骤1.5、取其上清加入等体积异丙醇，混合混匀，室温放置10min左右，4℃，13，000rpm离心10min，得到白色RNA沉淀；

步骤1.6、弃上清，加1000μL用DEPC水配制的75％乙醇，将沉淀冲起，于4℃，13000rpm离心10min，倒掉乙醇，留下沉淀；

步骤1.7、重复第6步，在无菌环境下晾干，加20～50μl无菌DEPC水溶解；进行RNA电泳，检测RNA提取质量，IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。

进一步地，步骤1中提取的紫花苜蓿总RNA进行RACE-readycDNA合成具体按照以下步骤实施：

步骤2.1、RACE-readycDNA的合成；

步骤2.1.1、准备缓冲液：2.0μl5×第一链缓冲液，1.0μl、20mM的DTT，1.0μl、10mM的dNTPMix；

步骤2.1.2、制备用于5’RACE的cDNA反应液：2.75μlRNA,1.0μl5'-CDSPrimerA，制备用于3’RACE的cDNA：3.75μlRNA，1.0μl3'-CDSPrimerA；

步骤2.1.3、将步骤2.1.2中制备好的液体混匀，离心，72℃孵育3分钟，再于42℃冷却2分钟，离心收集反应液液体；

步骤2.1.4、向5’RACE的cDNA反应液中加入1μl的SMARTerIIAoligo，离心收集液体；

步骤2.1.5、制备5’RACE和3’RACE-ReadycDNA反应液：4.0μl的步骤2.1.1得到的缓冲液，0.25μlRNA酶抑制剂40U/μl，100U、1.0μlSMARTScribe逆转录酶；

步骤2.1.6、向步骤2.1.3中得到的3’RACE和步骤2.1.4中得到的5’RACE反应液中分别加入5.25μl步骤2.1.5中得到的反应液，混合，离心收集液体；

步骤2.1.7、将制备好的反应液于42℃中孵育90分钟；70℃加热10分钟，完成Ready-cDNA的合成；

步骤2.2、cDNA末端的快速合成；

步骤2.2.1、制备足够的PCR混合液:每50μlPCR反应体系中加入以下试剂：34.5μlPCR用水，5.0μl10×Advantage2PCR缓冲液，1.0μl、10mM的dNTPMix，1.0μl50×Advantage2聚合酶Mix，混合液体，离心收集液体；

步骤2.2.2、制备用于5’RACE的PCR反应液：2.5μl5’RACE-readycDNA，5.0μlUPM(10×)，1.0μlGSP1，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；41.5μl的步骤2.2.1中制备的PCR混合液；

制备用于3’RACE的PCR反应：2.5μl3’RACE–readycDNA,5.0μlUPM(10×)，1.0μlGSP2，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；41.5μl的步骤2.2.1中制备的PCR混合液；

步骤2.2.3、RACE扩增：反应体系为：94℃30秒，72℃3分钟，共5个循环：94℃30秒，70℃3分钟，72℃3分钟，共5个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃3分钟，共20个循环；得到PCR产物；

取PCR产物于1.0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带。

步骤3中的构建PCR产物的重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到菌液，具体按照以下步骤实施：

步骤3.1、用T4DNA连接酶连接回收产物于PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，DH5α感受态细胞在冰上融化，吸取50μl，加入5μl的DNA连接产物，混合均匀后冰浴30min；

步骤3.2、42℃热击60sec，立即冰浴3-5min；

步骤3.3、加入700μlLB液体培养基，于150r/min条件下37℃恒温振荡器上培养60min；

步骤3.4、5000rmp离心3min收集菌体；

步骤3.5、LB平板上涂布2％的l5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和50mg/ml的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，均匀涂布平板表面，常温晾干；

步骤3.6、取100μl菌液均匀涂布于含100mg/L抗生素Amp的LB平板上，培养箱中37℃倒置培养过夜；次日将平板放入4℃放置使之充分显色

步骤3.7、挑选白色单菌落于1mlLB液体培养基中，其中，Amp终浓度100mg/L，225r/min37℃培养过夜。

本发明所采用的第四技术方案是，上述紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用。

本发明的有益效果是：本发明基于对苜蓿中抗逆性的生物学机制的研究，一方面提供了苜蓿MsWRKY33转录因子基因及该基因编码蛋白，另一方面还提供了含有所述苜蓿MsWRKY33转录因子基因的表达载体和细胞，以及培育耐盐性提高的拟南芥的方法，还提供了它们的应用。

本发明对了解WRKY基因在牧草耐盐和其他逆境因子中的作用，对牧草抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。本发明提供的苜蓿MsWRKY33基因在拟南芥中的增强表达可以显著提高拟南芥的耐盐性。本发明的重要应用前景在于：该基因的发现为提高主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)中耐盐性提供了基因资源，在基因工程改良牧草的研究中，特别是耐盐性改良的转基因新种质创制中发挥重要作用。

附图说明

图1是对紫花苜蓿植株进行农杆菌介导的MsWRKY33基因同源转化所用的插入有MsWRKY33基因的PBI121载体的结构；

图2是转MsWRKY33基因的拟南芥株系(L1，L2，L5，L6，L9，L13)与空载体对照株系(CK)盐处理5天后的比较分析结果；

图3是转MsWRKY33基因的拟南芥株系(L1，L2，L5，L6，L9，L13)与空载体对照株系(CK)盐处理处理10天后的比较分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的制备

本发明提供的紫花苜蓿MsWRKY33转录因子基因是通过以下方法筛选得到的：

通过发明人之前所进行的紫花苜蓿耐盐转录组测序结果(Z.Wang,G.Yu,B,Shi,etal.,DevelopmentandCharacterizationofSimpleSequenceRepeat(SSR)MarkersBasedonRNA-SequencingofMedicagosativaandInsilicoMappingontotheM.truncatulaGenome.PLOSone,2014,9(3):e92029)，以及BLAST对比分析，获得了一段与已公布的近源物种WRKY基因高度同源的Unigene序列。利用SMARTer^TMRACEcDNAAmplificationKit(Clontech，USA)分别对该Unigene序列进行5’RACE和3’RACE克隆，最后获得了该基因全长序列(SEQIDNO.1)。其中，基因克隆的方法为分子生物学领域的常规实验操作，具体方法如下：

1、紫花苜蓿总RNA的提取：

紫花苜蓿总RNA的提取采用Trizol试剂法，具体步骤如下：

(1)将0.3g左右紫花苜蓿材料加入大约3000μlTrizol试剂，加入液氮快速磨碎，放在无菌环境中直至变为匀浆。

(2)用移液枪吸取大约1mL匀浆到1.5mLEppendorf离心管中，剧烈振荡混匀，于室温放置5min，4℃，13，000rpm离心10min。

(3)取上清，加入200μL氯仿，剧烈振荡，室温放置2-3min，4℃，13,000rpm离心15min。

(4)溶液从下到上依次分为三层：有机相、蛋白质、无色水相；取上层移入新Eppendorf离心管，加等体积氯仿，重复第3步。

(5)取其上清加入等体积异丙醇，混合混匀，室温放置10min左右，4℃，13,000rpm离心10min，得到白色RNA沉淀。

(6)弃上清，加1000μL75％乙醇(用DEPCDEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水配制)，将沉淀冲起，于4℃，13000rpm离心10min，倒掉乙醇，留下沉淀。

(7)重复第6步，在无菌环境下晾干。加20～50μl无菌DEPC水溶解。

进行RNA电泳，检测RNA提取质量，IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。

2、RACE克隆基因cDNA全长

RACE-readycDNA的合成

(1)准备缓冲液：2.0μl5×第一链缓冲液(First-StrandBuffer)，1.0μlDTT(20mM)，1.0μldNTPMix(10mM)；

(2)制备用于5’RACE的cDNA反应液：2.75μlRNA，1.0μl5'-CDSPrimerA，制备用于3’RACE的cDNA反应液：3.75μlRNA，1.0μl3'-CDSPrimerA；

(3)将步骤(2)中制备好的液体混匀，短暂离心，72℃孵育3分钟，再于42℃冷却2分钟，短暂离心收集反应液液体；

(4)向5’RACE的cDNA反应液中加入1μl的SMARTerIIAoligo，短暂离心收集液体；

(5)制备5’RACE和3’RACE-ReadycDNA反应液(MasterMix)：4.0μl步骤(1)中得到的缓冲液，0.25μlRNA酶抑制剂(40U/μl)，1.0μlSMARTScribe逆转录酶(100U)，将以上试剂混匀；

(6)向步骤(3)中得到的3’RACE和步骤(4)中得到的5’RACE反应液中分别加入5.25μl步骤(5)中得到的反应液，轻柔混合，短暂离心收集液体；

(7)将制备好的反应液于42℃中孵育90分钟；

(8)70℃加热10分钟，完成Ready-cDNA的合成。

RACE引物的设计

(1)基因特异引物(Gene-SpecificPrimers，GSPs)满足以下条件：23－28bp；GC含量50－70％；Tm值最好>70℃；与3’-端通用引物(UniversalPrimerMix，试剂盒提供)不发生互补。

(2)需设计两个GSP引物，反向引物(GSP1)用于5’RACE,正向引物(GSP2)用于3’RACE。

根据以上原则，设计GSP1(5'-AGAGCAGTGATTAGACTCGGTGGCA-3'，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示)和GSP2(5'-AGACCCTGGCAGAACAAGAAGCA-3'，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示)两条引物。

cDNA末端的快速合成

(1)制备足够的PCR混合液(MasterMix):每50μlPCR反应体系中加入以下试剂：

34.5μlPCR用水，5.0μl10×Advantage2PCR缓冲液，1.0μldNTPMix(10mM)，1.0μl50×Advantage2聚合酶Mix。轻轻混合液体，注意不要产生气泡，短暂离心收集液体；

(2)制备用于5’RACE的PCR反应液：2.5μl5’RACE–readycDNA，5.0μlUPM(10×)，1.0μlGSP1；41.5μl的步骤(1)中制备的PCR混合液；

制备用于3’RACE的PCR反应：2.5μl3’RACE–readycDNA,5.0μlUPM(10×)，1.0μlGSP2；41.5μl的步骤(1)中制备的PCR混合液；

(3)RACE扩增：反应体系为：94℃30秒，72℃3分钟，共5个循环：94℃30秒，70℃3分钟，72℃3分钟,共5个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃3分钟，共20个循环。

取PCR产物于1.0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带，用T4DNA连接酶(Takara)连接回收产物于PMD18-T(Takara)载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

3重组质粒的大肠杆菌转化

(1)DH5α感受态细胞在冰上融化，吸取50μl，加入5μl的DNA连接产物，混合均匀后冰浴30min。

(2)42℃热击60sec，立即冰浴3-5min。

(3)加入700μlLB液体培养基，37℃恒温振荡器(150r/min)上培养60min。

(4)5000rmp离心3min收集菌体。

(5)LB平板上(Amp)涂布X-gal(l5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，2％)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，50mg/ml)，使其均匀涂布平板表面，常温晾干。

(6)取100μl菌液均匀涂布于含抗生素Amp(100mg/L)的LB平板上，培养箱中37℃倒置培养过夜；次日将平板放入4℃放置使之充分显色。

(7)挑选白色单菌落于1mlLB液体培养基中(Amp终浓度100mg/L)，225r/min37℃培养过夜。

对菌液进行PCR检测，挑选阳性菌液，送Invitrogen公司进行测序。对结果进行序列拼接，结果显示该基因具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列(1536bp)。

实施例2农杆菌介导的MsWRKY33基因转化拟南芥植株

1.1、材料与试剂

1.1.1、植物材料

供试苜蓿品种为紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv.ZhongmuNo.1，中苜一号)。

1.1.2、农杆菌菌株和质粒载体

所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌：LBA4404(北京天恩泽基因科技有限公司)

农杆菌培养基：

试剂	含量(1L)
		MgSO4.7H2O	1g/L
蛋白胨	10g/L
		酵母提取物	1g/L
蔗糖	5g/L

琼脂(固体培养基)	15g/L
		pH	7.0

121℃高压蒸汽灭菌20min；载体：PBI121

1.2、实验方法

1.2.1将MsWRKY33基因插入到PBI121载体质粒DNA中，具体步骤为：设计5’端包含XbaI酶切位点的上游引物和BamHI酶切位点的下游引物(F：5'-GCTCTAGAATGACCTCCTCTTTCTTCTCTGACC-3'(氨基酸序列如SEQIDNO.5所示)，R：5'-CGGGATCCTCAAGATAGGAAAGATTC-3'(氨基酸序列如SEQIDNO.6所示)，其中，下划线部分为酶切位点；用该引物从紫花苜蓿cDNA模板中扩增MsWRKY33的全长阅读框，PBI载体和目的基因全长片段经XbaI和BamHI双酶切后回收产物，经T4DNA连接酶连接，得到插入有MsWRKY33基因的PBI21载体，其含有CaMV35s启动子、MsWRKY33基因(SEQIDNO.1)以及一个卡那霉素抗性筛选标记，进行遗传转化的时候可通过卡那霉素筛选初步鉴定获得的转基因植株。含有目的片段的质粒载体的结构图1所示。

1.2.2将插入有MsWRKY33基因的PBI21载体导入到根癌农杆菌LBA4404中，具体步骤如下：

A.向100μl农杆菌感受态细胞LBA4404中加入约1μg质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；

B.于液氮中速冻1min，立即置于37℃水浴中温育5min；

C.加入800μlYEB液体培养基，28℃150rpm培养4-6h；

D.菌体涂布于含有50mg/L卡那霉素(KanamycinSulfate)和100mg/L链霉素(streptomycin)的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。

E.挑取单菌落，接种于YEB液体培养基中(含50mg/LKan和100mg/LStr)，28℃震荡培养过夜。

提取导入有MsWRKY33基因的农杆菌的质粒并测序，结果显示导入基因的核苷酸序列与SEQIDNO.1一致，表明含有目的基因MsWRKY33的表达载体构建成功。

1.2.3、农杆菌的培养

将导入有MsWRKY33基因的农杆菌于含有50mg/LKan和100mg/LStr的固体培养基上划平板，放于培养箱内，28℃培养。两天后，从平板上挑取单菌落，接种于含有50mg/LKan和100mg/LStr的20mlYEB液体培养基中，180rpm，28℃培养。用摇好的菌液划平板，28℃培养，待长出单菌落后，将平板放于4℃保存。

在平板上挑取单菌落，接种于20ml含有50mg/LKan和100mg/LStr的YEB液体培养基内，在恒温摇床上于28℃，180rpm培养。两天以后取少量菌液，以1:50-1:100的比例稀释到含50μg/m1Kan和100μg/m1Str的YEB液体培养基中，28℃培养6-12h至对数生长期。将菌体收集到离心管中，4,000rpm离心10min富集菌体，弃上清，再用约20ml不含抗生素的改良的SH液体培养基重悬菌体，使菌液的OD₆₀₀值为0.6-0.8，待用。

1.2.4、拟南芥的准备：

Col生态型拟南芥种子灭菌后，将种子铺在1/2MS固体培养基的培养皿上，放在4℃下春化48小时。

将春化后的种子平板放在拟南芥培养箱(24℃16h/22℃8h)中培养，7天后，移到花盆中(蛭石：营养土：珍珠岩大约为1：1：1)。按上述方法培养拟南芥，约三星期左右，剪去已经开花的主茎，抑制顶端优势。约四星期左右，抽出的侧枝大量开花，此时是用浸润法转基因的最佳时机。

1.2.5、农杆菌培养和收获

取原菌液20μl，加入5mlYEP(yeastextract10g/L，Tryptone10g/L，Nacl5g/L，灭菌后，添加抗生素)，30℃恒温振摇过夜，将此5ml菌液倒入250mlYEP(添加抗生素)，30℃恒温振摇过夜，此时，农杆菌的浓度应达到OD600＝1.8。4000rpm离心15分钟，弃去上清，加入浸润法培养基(1/2MS大量+1×MS微量+1×MS铁盐+1×MS肌醇+1×MS维生素+MES0.5g/L+Sucrose5％，pH5.7高压灭菌)。使农杆菌以1：1的比例重悬于浸润培养基，并加入表面活性剂Silwet，使其终浓度达到0.02％(每升加200μl)。

1.2.6、浸润法转基因

将拟南芥花盆蒙上纱布，用橡皮筋扎紧，以免花盆倒扣时培养基质下漏。将花盆倒扣于装有250ml菌悬液的浸润罐上，使植株的花序浸没在菌液中，浸润持续2min，转化后用吸水纸吸去过多的菌液，但不需要吸得很干。转化后的植株，用保鲜膜覆盖过夜后揭膜。正常生长，收取种子。

1.2.7转基因拟南芥植株的筛选

收获的拟南芥种子70％酒精2min，5％次氯酸钠5min进行消毒。将拟南芥种子播到含50mg/LKan的1/2Ms固体培养基的培养皿中，放到4℃低温下春化2天。在抗性培养基上正常生长的拟南芥幼苗为转化成功拟南芥，转化失败拟南芥幼苗将不能正常生长。将能正常生长的拟南芥幼苗移栽到花盆，在人工气候室条件下生长。以转基因拟南芥植株的基因组DNA为模板，以nptⅡ基因引物P3/P4(氨基酸序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示)，gus基因引物P5/P6(氨基酸序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示)检测含pBI121-WRKY33载体转基因植株。阳性植株保留(共获得19株：L1-L19)，单独收种。T₁代经同样抗生素筛选，其分离比(3：1)经卡方检验，共获得6个3：1分离的株系：L1，L2，L5，L6，L9，L13。将这些株系保留收种得到T₂代。从T₂代中筛选纯合体，单独收种。

实施例3MsWRKY33基因的PBI21载体拟南芥幼苗的耐盐性评价

用质粒PBI21转化农杆菌，获得重组农杆菌，用重组农杆菌转化拟南芥，得到转空载体的对照植株，方法如实施例1，获得转空载体对照植物(CK)，作为对比例1。

评价对比例1中得到的转空载体的紫花苜蓿和实施例1中得到的转化插入有MsWRKY33基因的PBI21载体拟南芥幼苗的耐盐性，具体方法如下：

将转基因材料和对照材料的种子灭菌，铺在装有1/2MS固体培养基的培养皿上，放在4℃条件下春化两天。春化后的平板在超净台上吹干水气，用封口膜封好，竖直放在拟南芥培养箱中培养。待种子萌动后，在超净台上将萌动的小苗移到1/2MS培养基和含有50mMNaCl的1/2MS培养基上，放回培养箱继续竖直培养。对转基因拟南芥株系(L1，L2，L5，L6，L9，L13)处理的第5天和第10天测量拟南芥的根长，进行统计分析。结果见图2：转基因植株(L1，L2，L5，L6，L9，L13)的根长比对照(CK)平均长了27％和36.7％(10天)。

Claims (1)

1.紫花苜蓿MsWRKY33转录因子在提高拟南芥株系耐盐性中的应用，所述紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，所述紫花苜蓿MsWRKY33转录因子编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。