JP5164093B2 - イネの病原菌に対する抵抗性を高める方法及び病原菌耐性イネ形質転換体 - Google Patents
イネの病原菌に対する抵抗性を高める方法及び病原菌耐性イネ形質転換体 Download PDFInfo
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即ち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
まず、ノーザンブロットプローブ用の合成ヌクレオチドを作製するために各遺伝子のプローブ断片を合成し、また各遺伝子を増幅するためにPCR用プライマーを合成し、トレハロース処理したイネの根組織からのcDNAライブラリーを用いてPCRで部分長cDNAを増幅する。増幅に際して、市販のPCRキット(例えば宝酒造のEx TaqPCRキット)を用いてもよい。PCR条件は、例えばDNA変性を約95℃で15秒〜5分、プライマーのアニーリングを約50〜58℃で30秒〜1分、伸長反応を約65℃〜72℃で30秒〜10分間行い、これを1サイクルとして20〜40サイクル行い、最後に約65℃〜72℃の伸長反応を1〜5分行うことを含む。
イネ(品種:ゆきひかり)種子を70%アルコール5分間、次に次亜塩素酸(和光純薬)の2倍希釈液で30分間滅菌を行った後、3日間暗所25℃に静置して吸水させ、発芽誘導した。その後、プラスチック製メッシュ上に発芽種子を播種し、水を張ったプラスチック製容器をメッシュの下に置き、25℃連続明所下で2週間水耕栽培した。処理開始直前のイネ幼苗から根組織を採取し「C0」とし、5mMトレハロース処理2時間後のイネ幼苗から根組織を採取し「T2」とした。試料は採取と同時に液体窒素中で瞬間凍結し、RNA抽出時まで-80℃で保存した。トレハロース処理は、事前に25℃に保温しておいた5mMトレハロース溶液を根に直接接触させることにより行った。試料C0及びT2を液体窒素中で粉末にした後、-80℃で保存した。
5 x First strandバッファー 2.0 μl
0.1 M DTT 1.0 μl
10mM dNTP ミックス 0.5 μl
MMLV-RT 0.5 μl
RNaseOUT 0.25μl
合計 4.25μl
水 7.65μl
4 x 転写バッファー 10.0 μl
0.1 M DTT 3.0 μl
NTP ミックス 4.0 μl
50%PEG 3.2 μl
RNaseOUT 0.25μl
無機ピロホスファターゼ 0.3 μl
T7 RNA ポリメラーゼ 0.4 μl
合計 28.8 μl
前記マイクロアレイ実験で同定されたトレハロース誘導性遺伝子のうち病害応答に関与すると考えられるいくつかの遺伝子を表2の通り選択した。これらの遺伝子のトレハロースに応答した発現をノーザン解析により調べることを目的とし、まず、各遺伝子のプローブ断片を合成した。当該遺伝子の部分配列を特異的に増幅する下記のヌクレオチドを合成し、Ex TaqPCRキット(宝酒造)を用いて前述と同様にして部分長cDNAを増幅、クローニングした後、塩基配列を決定した。PCR条件及びノーザンブロットプローブ増幅用に使用した合成ヌクレオチドは配列番号1〜18に示した。
Takara Ex Taq (5u/μl) 0.1 μl
10 x Ex Taq バッファー 2.5 μl
dNTPミックス(各2.5mM) 2.0 μl
鋳型cDNA 0.2 μl
20μM Fwプライマー 0.5 μl
20μM Rvプライマー 0.5 μl
滅菌水 19.2 μl
合計 25.0 μl
ステップ1 95℃ 3分
ステップ2 95℃ 30秒
ステップ3 52℃ 30秒
ステップ4 68℃ 30秒
ステップ5 68℃ 3分
ステップ2からステップ4を30回繰り返した。
トレハロース誘導性遺伝子のうち、トレハロースシグナル伝達に関わると考えられる転写因子及びレセプターキナーゼ遺伝子として、表3の遺伝子を特定した。
これらの遺伝子を単離するため、Genbankに登録されているイネゲノム配列情報を参考にしてプライマー(配列番号19〜40)を設計し、RT-PCR法により全長遺伝子を増幅した。5mMトレハロース処理2時間後のイネ(品種:日本晴)根組織より調製した全RNA約0.1μgより、Applied Biosystem社GeneAmp RNA PCR core kitを用いて、製造業者の使用説明書に従い一本鎖cDNAを合成した(一本鎖cDNA合成液の組成は後記参照)。遺伝子発現の制御に重要である転写因子及び受容体タンパク質リン酸化酵素の翻訳領域を特異的に増幅可能なヌクレオチドを合成した。一本鎖cDNAを鋳型とし、各遺伝子に特異的な合成ヌクレオチドのセット及びKOD-Plus-DNA polymeraseキット(東洋紡)を使用して、製造業者の使用説明書に従い反応液を調製し、以下に示した条件により目的遺伝子の断片をApplied Biosystem Cirmal cycler 9700で増幅した。増幅した遺伝子断片を含む反応液を95℃で20分間処理した後、20 mM dATPを1.5μl加え、60℃で20分保温することで遺伝子断片にA付加をした。この断片をpGEM-Teasyクローニングベクター(Promega)に組込み、塩基配列決定用試薬BigDye sequencing kit ver 1.1及びシークエンサーABI310(Applied Biosystem)により塩基配列を確認した。これらの遺伝子の塩基配列を配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59及び61に示した。各遺伝子の増幅に使用した反応条件は以下のとおりである。
25mM MgCl2 2 μl
10 x PCRバッファーII 1 μl
水 1 μl
dNTPミックス 4 μl
RNaseインヒビター 0.5 μl
MuLV逆転写酵素 0.5 μl
オリゴd(T)16プライマー 0.5 μl
RNA溶液 0.5 μl
合計 10.0 μl
ステップ1 25℃ 10分
ステップ2 42℃ 30分
ステップ3 99℃ 5分
ステップ4 4℃ 5分
KOD-Plus用10 x PCRバッファー 2.5 μl
2mM dNTPs 2.5 μl
25mM MgSO4 1.0 μl
プライマーミックス(各10μM) 0.8 μl
鋳型cDNA 0.5 μl
KOD-Plus-DNAポリメラーゼ 0.5 μl
滅菌水 17.2 μl
合計 25.0 μl
ステップ1 94℃ 3分
ステップ2 94℃ 30秒
ステップ3 58℃ 30秒
ステップ4 68℃ 1分(ただし配列番号53のみ2分)
ステップ5 68℃ 3分
ステップ2からステップ4を30回繰り返した。
[栽培]
品種「日本晴れ」を使用し、イネいもち病が十分に発病するように調節した温室内で栽培した。栽培に使用したポットは内径28mmx高さ115mmのものを使用し、5本/potのイネを生育させた。
発病しやすいイネの第4葉が1-3cm程度まで生長した個体に対して、1mM及び5mMのトレハロースを灌注処理した。なお、比較例として、イネいもち病に使用される農薬BIT(プロベナゾール、化学名:1,2-ベンズイソチアゾール-1,1-ジオキシド)を0.5mMで同様に処理したイネを用意した。薬剤処理5日後にいもち病菌の接種を行った。
オートミール培地プレートでいもち病菌が一面に生えるように生育させ(28℃)、気中菌糸を除去した後、BLBランプ照射下で生育を続けて胞子形成を行う。生育した胞子を滅菌水に懸濁して調製した胞子液を、感染試験に用いた。
イネを接種箱(60x60x60cm)内に静置し、いもち病菌胞子液を噴霧接種した。イネは接種箱内で暗黒下、湿度100%の条件で24時間静置した後、接種箱から出し温室内で栽培を継続した。接種5日後に第4葉に出現した病斑の数を計測して発病の度合いを評価し、対照区に対して発病が抑制された割合((対照区の病斑数-トレハロース処理区の病斑数)÷対照区の病斑数×100)を防除価(%)として求めた。
図2に示すように、1mM及び5mMトレハロース処理により、BITと同様なレベルの抵抗性が誘導された。
イネユキヒカリ種子を70%エタノールで3分間滅菌し、その後滅菌水で充分に洗浄した。滅菌種子を90mm滅菌シャーレに移し、滅菌した5mMトレハロース溶液を20ml加え、暗所25℃で24時間静置した。対照として滅菌後トレハロース溶液の代わりに滅菌水に浸した種子を用意した。24時間後トレハロース溶液を捨て、種子を滅菌水で充分にすすいだ。PY(Bacto Yeast extract 2g、 Bacto Pepton 5g/L)培地で30℃で一晩生育し、106 CFU/mlに調整したイネ苗立枯細菌病菌(Burkholderia plantarii)培養液を20mlシャーレに加え、更に暗所25℃で48時間静置した。90mm滅菌シャーレにバーミキュライト敷き詰め、滅菌水を全体に湿らす程度加え、そこにイネ種子を20粒ずつ植え、明期16時間(25℃)暗期8時間(25℃)に設定した人工気象室において発芽させ、約一週間後苗の生育状況を観察した。
図3に示すように、5mMトレハロース処理したイネの枯死率は25.3±3.3%、対照は60.1±3%であり、トレハロースにより明確な抵抗性が誘導されていた。
表3に示したトレハロースによる誘導性が高い遺伝子のうち、遺伝子番号AK112056(配列番号59)及びAK108522(配列番号49)の遺伝子について、実際に発現を高めた形質転換体を下記の方法によって作出した。
形質転換体植物を作出する目的で、新たに制限酵素Xba I及びKpn I部位を変異導入するプライマーセット(AK112056用プライマーセット1:配列番号63及び64、AK108522用プライマーセット2:配列番号65及び66)を作製した。実施例3と同様の方法を用いて合成した一本鎖cDNAを鋳型とし、KOD-Plus-DNA polymerase キット(東洋紡)を用い、製造業者の使用説明書に従いPCR反応を行なって、AK112056とAK108522の遺伝子の断片を増幅した。増幅したcDNA断片をpGEM-Teasyベクターに組み込み塩基配列を確認した。
形質転換体植物の作出は、Tokiらの方法(S. Toki, N. Hara, K. Ono, H. Onodera, A. Tagiri, S. Oka, H. Tanaka, 2006. Plant Journal 47: 969-976)に従った。具体的な操作方法を以下に示す。
[N6D固形培地(1リットル当たり)]
KNO3 2,830mg, (NH4)2SO4463mg, MgSO4・7H2O 185mg, CaCl2・2H2O 166mg, KH2PO4 400mg, Na2EDTA 37.3mg, FeSO4・7H2O 27.8mg, MnSO4・4H2O 4.4mg, ZnSO4・7H2O 1.5mg, KI 0.8mg, H3BO3 1.6mg, Casamino acid 300mg, Glycine 2mg, L-Proline 2,878mg, myo-Inositol 100mg, Nicotinic acid 0.5mg, Pyridoxine-HCl 0.5mg, Thiamine-HCl 1mg, 2,4-D 2mg, Sucrose 30g, Gellan Gum 3g (pH 5.8)
KNO3 2,830mg, (NH4)2SO4463mg, MgSO4・7H2O 185mg, CaCl2・2H2O 166mg, KH2PO4 400mg, Na2EDTA 37.3mg, FeSO4・7H2O 27.8mg, MnSO4・4H2O 4.4mg, ZnSO4・7H2O 1.5mg, KI 0.8mg, H3BO3 1.6mg, Casamino acid 300mg, Glycine 2mg, myo-Inositol 100mg, Nicotinic acid 0.5mg, Pyridoxine-HCl 0.5mg, Thiamine-HCl 1mg, 2,4-D 2mg, Sucrose 30g, Glucose 10g, Gellan Gum 3g, Acetosyringone 10mg (pH 5.2)
MgSO4・7H2O 250mg, CaCl2・2H2O 150mg, NaH2PO4・2H2O 150mg, KCl 3g, Fe-EDTA 40mg, MnSO4・4H2O 10mg, ZnSO4・7H2O 2mg, CuSO4・5H2O 0.025mg, CoCl2・6H2O 0.025mg, KI 0.75mg, H3BO3 3mg, Na2MoO4・2H2O 0.25mg, Casamino acid 500mg, Glycine 7.5mg, L-Arginine 176.7mg, L-Glutamine 900mg, L-Aspartic acid 300mg, myo-Inositol 100mg, Nicotinic acid 1mg, Pyridoxine-HCl 1mg, Thiamine-HCl 10mg, Sucrose 68.5g, Glucose 36g, Acetosyringone 10mg (pH 5.2)
KNO3 1,900mg, NH4NO3 1,650mg, MgSO4・7H2O 370mg, CaCl2・2H2O 440mg, KH2PO4170mg, Na2EDTA 37.3mg, FeSO4・7H2O 27.8mg, MnSO4・4H2O 22.3mg, ZnSO4・7H2O 8.6mg, CuSO4・5H2O 0.025mg, CoCl2・6H2O 0.025mg, KI 0.83mg, H3BO36.2mg, Na2MoO4・2H2O 0.25mg, Casamino acid 2g, Glycine 2mg, myo-Inositol 100mg, Nicotinic acid 0.5mg, Pyridoxine-HCl 0.5mg, Thiamine-HCl 0.1mg, NAA 0.02mg, Kinetin 2mg, Sucrose 30g, Sorbitol 30g, Gellan Gum 3g (pH 5.8)
KNO3 1,900mg, NH4NO3 1,650mg, MgSO4・7H2O 370mg, CaCl2・2H2O 440mg, KH2PO4170mg, Na2EDTA 37.3mg, FeSO4・7H2O 27.8mg, MnSO4・4H2O 22.3mg, ZnSO4・7H2O 8.6mg, CuSO4・5H2O 0.025mg, CoCl2・6H2O 0.025mg, KI 0.83mg, H3BO36.2mg, Na2MoO4・2H2O 0.25mg, Glycine 2mg, myo-Inositol 100mg, Nicotinic acid 0.5mg, Pyridoxine-HCl 0.5mg, Thiamine-HCl 0.1mg, Sucrose 30g, Gellan Gum 3g (pH 5.8)
NH4Cl 1g, MgSO4・7H2O 296mg, CaCl2・2H2O 10mg, NaH2PO4・2H2O 1.3g, K2HPO43g, KCl 150mg, FeSO4・7H2O 2.5mg, Glucose 5g, Agar 15g (pH7.2)
上記方法により作出したイネ形質転換体について、イネいもち病の抵抗性をパンチ接種法により検定した。
Claims (8)
- イネにおいて、配列番号59の塩基配列を有する生体防御関連遺伝子の発現レベルを高めることを含む、イネの病原菌に対する抵抗性を高める方法。
- 前記遺伝子の発現レベルが、イネ又はその種子をトレハロース又はその誘導体で処理することによって高められる、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現レベルが、イネに該遺伝子を外来的にかつ発現可能に導入することによって高められる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現レベルが、対照のイネに対して2倍以上高まる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記病原菌が、いもち病菌又は苗立枯細菌病菌である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号59の塩基配列を有する生体防御関連遺伝子が外来的にかつ発現可能に導入されたことを特徴とする、病原菌耐性イネ形質転換体。
- 前記病原菌が、いもち病菌又は苗立枯細菌病菌である、請求項6に記載の形質転換体。
- イネの病原菌に対する抵抗性を高めるための、配列番号59の塩基配列を有する生体防御関連遺伝子の使用方法。
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