KR100965422B1

KR100965422B1 - ＡＰ２ (Ａｐｅｔａｌａ 2) 도메인의 유전자에 의해형질전환된 스트레스 저항성 식물

Info

Publication number: KR100965422B1
Application number: KR1020070125730A
Authority: KR
Inventors: 문용환; 박희연; 석혜연
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2010-06-24
Also published as: KR20090058924A

Abstract

본 발명은 스트레스 저항성을 가지는 AP2 (Apetala 2) 도메인의 유전자에 의해 형질전환된 스트레스 저항성 식물체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 저산소(anoxia), 고염, 건조, ABA (abscisic acid), ROS (reactive oxigen species) 등에 의한 환경적 스트레스에 대해 저항성을 가지는 스트레스 저항성 AP2 (Apetala 2) 도메인을 코딩하는 DNA로 형질전환된 스트레스 저항성 식물체에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 환경적 스트레스에 대해 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 수득할 수 있기 때문에, 작물의 환경적 생장 제한 조건에 의한 피해를 최소화하고, 생산성 향상의 효과를 유도하는데 유용하다.

스트레스 저항성, 스트레스 특이적, AP2 도메인

Description

ＡＰ２ (Ａｐｅｔａｌａ 2) 도메인의 유전자에 의해 형질전환된 스트레스 저항성 식물{Stress-Resistant Plants Transformed with AP2 (Apetala 2) Domain-Containing Genes}

본 발명은 저산소(anoxia), 고염, 건조, ABA(abscisic acid), ROS(reactive oxygen species) 등에 의한 환경적 스트레스에 대해 저항성을 가지는 AP2 (Apetala 2) 도메인의 유전자에 의해 형질전환된 스트레스 저항성 식물체에 관한 것이다

식물은 성장과 발달을 제한하는 스트레스 환경에서 벗어날 수 없기 때문에, 이런 환경에 대응하고 적응하기 위해, 세포 내 일부 신호전달과정을 통한 방어 기작을 가지도록 진화해 왔다(Knight H. et al ., Trends in Plant Science, 6:261, 2001; Lexer C. et al ., J. Evol . Biol ., 18:893, 2005). 이 신호전달의 최종 목적지는 세포의 핵으로서 신호가 핵에 도달하면 여러 유전자들의 전사가 활성화되는데, 이러한 활성화에 관여하는 전사 조절자들에 의한 유전자의 발현의 변화로 인하 여 식물에서 환경적 스트레스에 대한 저항성을 나타낼 수 있게 된다.

수해(flooding)는 식물에 가해지는 대표적인 스트레스 중의 하나인데, 식물의 뿌리 또는 전초가 물에 잠기게 되면 스트레스 상태가 식물체에 가해지기 시작하여 저산소증(hypoxia) 또는 산소결핍증(anoxia)의 상태에 도달하게 된다(Subbaiah, C.C. et al ., Ann . Bot . ( Lond ), 91:119, 2003). 저산소증 또는 산소결핍증의 스트레스 하에서는 이에 대한 방어기전으로 다양한 유전자의 발현변화가 빠르게 일어나는 데, 옥수수 뿌리에서 발현되는 20 개의 ANPs (anaerobic proteins)가 대표적인 예로서, 대부분 해당, 대사 그리고 발효와 연관된 단백질로 알려져 있다(Sachs, M.M. et al., Cell , 20:761, 1980). 그 외 방어기전으로는 전사인자의 발현 변화(de Vetten, N.C. et al., Plant J., 7:589, 1995; Hoeren, F.U. et al, Genetics , 149:479. 1998), 신호전달 인자(Dordas, C. et al ., Plant J., 35:763, 2003), 공생하지 않는 헤모글로빈의 생성(Dordas, C. et al ., Planta , 219:66, 2004), 에틸렌 생합성(Vriezen, W.H. et al ., Plant Physiol., 121:189, 1999), 또는 대체 경로 또는 신규 경로를 통한 질소대사(Mattana, M. et al ., Plant Physiol., 106:1605, 1994)가 개시되는 것으로 밝혀졌다. 상기 연구에서는 공통적으로 산소결핍(anoxia)에 대해 옥수수 및 애기장대의 알코올 탈수소효소 유전자(ADH1) 및 다른 유전자의 산소결핍 특이적 프로모터가 활성화된다는 사실이 증명되었으며, 또한 AtMYB의 결합 부위인 GC, GT 모티프 또한 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다(Olive, M.R. et al ., Nucleic Acids Res., 19:7053, 1991; Dolferus, R, et al ., Plant Physiol ., 105:1075, 1994; Hoeren, F.U. et al ., Genetics , 149:479, 1998).

여러 가지의 스트레스에 대한 저항성 유전자의 발현을 유도하는 전사인자(transcriptional factor)를 밝히기 위해, 애기장대를 이용한 식물에서의 스트레스에 대한 반응이 연구되어 왔으며, 일부 ERF 유사 전사 인자의 발현이 산소 결핍에 의하여 벼와 애기장대에서 증가하는 것으로 관찰되었다(Rushton, P.J. and Somssich, I.E., Biol . Chem . 1:311, 1998; Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Curr . Opin . Plant Biol ., 3:217, 2000; Lasanthi-Kudahettige, R. et al., Annu . Rev . Genet ., 34:77, 2007; Loreti, E. et al., Plant Physiology, 137:1130, 2005). 또한, 최근 연구에서는 벼의 침수에 대한 반응 기전에 관여하는 Submergence 1 (Sub 1)이 발견되었으며, 상기 신규 벼 유전자는 침수에 의해 생성된 에틸렌에 의해 유전자 발현이 유발되어, 그로 인하여 초엽의 신장이 억제되고, 생존에 필요한 에너지 소모가 감소함으로써 환경 스트레스에 대한 저항성이 부여되는 것으로 밝혀졌다(Lansanthi-Kudahettige, R. et al., Annu. Rev . Genet ., 34:77, 2007).

AP2 (Apetala 2)는 식물의 전사인자로 꽃기관의 발달에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 종자 발달에도 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Jofuku, K.D. et al ., Plant Cell, 6:1611, 1994; Riechmann, J.L. and Meyerowitz, E.M., Biol . Chem. 379:633, 1998; Ohto, M.A. et al ., Proc . Natl . Acad. Sci ., 102:3123, 2005). AP2 패밀리는 145개로 구성되어 있으며, DNA상의 AP2 결합 도메인의 염기서열의 상동성을 기준으로 AP2 서브패밀리, RAV 서브패밀 리, DREB 서브패밀리(그룹 A), ERF 서브패밀리(그룹 B) 등을 포함하는 다섯 개의 서브 패밀리로 분류된다. AP2는 모두 전사인자로 알려져 있으며, 다양한 스트레스 자극에 의해 발현되는 유전자를 비롯하여 에틸렌, 자스몬산 등과 관련된 유전자의 발현을 조절한다(Sakuma, Y, et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun ., 290:998, 2002; Gutterson, N. and Reuber, T.L., Curr . Opin . Plant Biol ., 7:465, 2004).

이에, 본 발명자들은 궁극적으로 환경적 스트레스에 대해 저항성을 가지는 식물체를 제조하기 위해 예의 노력한 결과, 애기장대에서 분리한 신규 AP2 도메인 및 이를 과발현하는 형질전환 식물체가 저산소, 고염, 건조 스트레스 저항성을 갖는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 스트레스 저항성 AP2(Apetala 2) 도메인을 코딩하는 DNA로 형질전환된 재조합 미생물 및 재조합 식물체를 제공하는 데 있다.

삭제

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스트레스 저항성 AP2(Apetala 2) 도메인을 코딩하는 DNA로 형질전환된 스트레스 저항성 식물세포 또는 식물체를 제공한다.

삭제

본 발명은 저산소(anoxia), 고염, 건조, ABA(abscisic acid) 처리, ROS (reactive oxygen species) 처리에 의한 스트레스 환경에서 스트레스 저항성을 부여하는 AP2 도메인 유전자으로 형질전환된 식물체를 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 스트레스 저항성 AP2 도메인 유전자를 함유하는 형질전환 식물체는 산소결핍과 같은 스트레스 저항성을 나타내므로, 수해 등의 저산소 조건에서도 식물의 생장을 유지가 가능하기 때문에 생산성 향상을 도모할 수 있을 뿐만 아니라, 농작물 생산이 어려운 환경에서 재배가 가능한 식물체를 생산하는데 기여할 수 있다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 스트레스 저항성 AP2 (Apetala 2) 도메인을 코딩하는 DNA로 형질전환되고, 저산소(anoxia), 고염, 건조, ABA (abscisic acid), ROS(reactive oxygen species)로 구성된 스트레스에 저항성을 갖는 식물세포 또는 식물체에 관한 것이다.

본 발명에서는 저산소 스트레스에 대해 저항성을 부여하는 신규의 식물 유전자를 검색하기 위하여, 애기장대에 저산소 스트레스를 처리하고, 이로부터 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행한 후, 발현이 증가된 유전자를 선별하였다. 선별된 유전자 단편에 대해 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)를 포함하는 당업자가 통상으로 사용하는 데이터베이스를 이용한 염기서열 분석에 통하여, 애기장대로부터 얻어진 AT2g47520의 유전자 부위가 식물 전사인자인 AP2 (Apetala 2) 패밀리를 발현하는 유전자임을 확인하였다. 본 발명의 AT2g47520는 각각 서열번호 11의 염기서열을 가진다.

본 발명의 AT2g47520를 사용하여 과발현되도록 형질전환시킨 식물체는 저산소 스트레스뿐만 아니라, 염 스트레스 및 건조 스트레스에 대해서도 저항성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 저산소(anoxia), 고염, 건조, ABA(abscisic acid), ROS (reactive oxygen species) 처리에 의한 스트레스 환경에서 발현이 많이 증가 되었다.

따라서, 본 발명의 AP2 도메인을 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체는 저산소(anoxia), 고염, 건조, ABA(abscisic acid), ROS(reactive oxygen species) 처리에 대한 스트레스에 대해 저항성을 가진다.

본 발명의 AP2 도메인을 가지는 AT2g47520는 애기장대에서 분리한 것이지만, 애기장대에서만 국한되어 발현되는 유전자가 아니라는 사실은 당업자에게 자명하며, 다만 식물 종에 따라 스트레스 하에서 발현 정도 또는 유전자가 가진 염기서열의 상동성의 차이는 있을 수 있다.

본 발명에서 '벡터(vector)'는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명에서 벡터(vector)는 플라스미드(plasmid)와 때로 상호 교환적으로 사용할 수 있다.

형질전환의 목적으로 사용될 수 있는 벡터는 전형적으로 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점; (b) 벡터로 형질전환된 숙주세포를 효율적으로 선별하는데 필요한 항생제 내성 유전자; (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위 및 (d) 외래 유전 자를 발현할 수 있는 전사개시에 관여하는 조절부위를 포함하는 프로모터의 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 외래 DNA를 용이하게 벡터의 제한효소 절단부위에 삽입할 수 있다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 식물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드(plasmid), 코스미드(Cosmid), YACs (yeast artificial chromosoems), BACs (bacterial artificial chromosomes) 또는 다른 클로닝 시스템일 수 있다. 이러한 벡터들은 공통적으로 발현 카세트를 포함하고 있으며, 여기에는 발현을 관장하는 프로모터, 본 발명의 유전자를 발현할 수 있는 cDNA 혹은 DNA 단편, 폴리링커, 발현 종결코드, 발현 외에 필요한 조절 유전자 및 형질전환체를 선별할 수 있는 마커 등을 포함할 수 있다. 벡터에 목적하는 유전자 등을 삽입하기 위해서는 당업계에서 알려진 기술을 사용하여 용이하게 이루어질 수 있다.

본 발명의 식물세포 또는 식물체는 AP2 도메인을 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환시켜 용이하게 제조할 수 있으며, 상기 재조합 벡터를 사용한 형질전환 혹은 유전자의 발현 방법은 당해 분야에 숙지되어 있다. 예를 들면, 목적유전자를 포함하는 벡터는 직접적으로 세포에 삽입하는 수단으로서는 열화학처리에 의한 직접적인 DNA 흡수방법, 리포홈, 일렉트로포레이션, 미세주입법 또는 입자피폭법 등을 이용하며, 또한, 간접적인 벡터 전달방법으로는 아그로박테리움(Agrobacterium) 속과 같은 세균을 이용하여 식물세포를 형질전환 시킬 수 있다.

삭제

형질전환은 원형질체에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 이용한 방법이나 일렉트로포레이션에 의해 DNA 벡터를 전달하거나 또는 입자 피폭법을 이용하는 등의 직접적인 유전자 전달 기술에 의해 수행할 수 있으며, 그 외에 입자 피폭법을 사용하여 통상적으로 형질전환시킬 수 있다(Christo, P et al ., Biotechnology, 9:957, 1991).

식물의 형질전환을 목적으로 하는 간접적인 DNA 벡터 전달방법으로는 아그로박테리움 속의 미생물을 사용할 수 있다. 상기 박테리아에는 아그로박테리움 튜메판시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)을 포함하며, 아그로박테리움 투메판시엔스(예를 들면, LBA4404 또는 EHA105)가 식물의 형질 전환에 가장 널리 사용되기 때문에 특히 유용하다.

아그로박테리움에 벡터를 삽입시키는 방법은 화학 또는 열처리에 의한 직접적인 DNA 전달방법(Holsters, M. et al ., Mol . Gen . Genet ., 163:181, 1978), 일렉트로포레이션에 의한 전달방법(S. Wen-jun and B. Forde, Nucleic Acids Res ., 17:8385, 1989), Tra+인 E. coli로부터 벡터를 전이 받는 삼조접합전달(triparental conjugational transfer)방법(Ditta, G.S. et al ., Proc . Natl . Acad. Sci . U S A., 77:7347, 1980) 또는 직접접합전달(direct conjugational transfer)방법을 통상적으로 사용할 수 있다.

상기의 방법으로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환대상 식물 의 조직 등에 감염시키는데 사용하여 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(pre-culture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동 배양하여 형질감염시키는 단계 (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여, 캘러스를 수득하는 단계 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 스트레스 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 환경 스트레스에 저항성을 가지는 특징이 있으며, 상기 식물체는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 포함하는 식용작물, 난 등을 포함하는 관상용 식물일 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는, 형질전환 대상 식물로 애기장대만을 예시하였으나, 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 포함하는 식용작물, 난 등을 포함하는 관상용 식물 등의 유용식물을 대상으로도 형질전환 시켰을 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업자에게는 자명하다.

실시예 1: 식물체 발아 및 재배

애기장대의 종자(Arabidopsis Biological Resource Center, USA)는 70% 에탄올과 10% 클로락스로 살균한 다음, 이틀 동안 4℃ 암상태에서 춘화처리를 하였고, MS 배지(Murashige, T. and Skoog, F., Physiol . Plant, 5:473, 1962)에서 8/16 시간의 명/암의 단일조건으로 22℃에서 발아시켰다. 애기장대 종자 발아 후, 10~12일 된 유식물체를 흙으로 옮긴 다음, 16/8 시간 명/암의 장일 조건에서 재배하였다.

애기장대는 강광(high light), 저산소, 고염, 건조, 식물 스트레스 호르몬인 ABA(abscisic acid) 처리 또는 ROS 처리를 포함한 다양한 스트레스 처리를 하였으며, 강광 및 저산소 스트레스는 2개월 정도 재배한 애기장대의 잎을 대상으로, 그리고 고염, 건조 ABA처리 및 ROS 처리는 발아 후 10일간의 재배기간이 경과 된 애기장대를 대상으로 스트레스 처리를 하였다.

실시예 2: AP2 도메인 유전자의 분리

벼의 마이크로어레이 데이터 (Kim, Unpublished dissertation of Master, Pusan National University, 2007)를 통해 저산소에 의해 발현이 증가하는 AP2 도메인 유전자인 LOC_Os03g08460과 LOC_Os07g47790, 두 개를 선별하였다. 상기 벼 유전자들의 애기장대 상동체를 찾기 위해 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용해 각각의 전체 아미노산 서열과 유사도가 가장 높은 것들을 상동체로 결정하였다. 그 결과 LOC_Os03g08460의 상동체는 AT1g72360, LOC_Os07g47790의 상동체는 AT2g47520으로 결정되었다.

상기 애기장대 상동체들이 벼에서와 마찬가지로 저산소에 의해 유전자 발현이 증가하는지 알아보기 위해 야생형 애기장대 잎에 99.99% 질소 가스를 주입하고 암상태로 12시간 동안 방치하여 산소결핍 스트레스 처리를 하였다. 산소결핍 스트레스가 처리된 잎의 total RNA를 TRI-Reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 분리하였다. 상기 분리된 RNA의 5 ㎍을 취하여, RNase-free DNase I (Promega, USA)을 처리한 다음, MMLV-reverse transcriptase (Promega, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 상기 cDNA를 주형으로 하여, 서열번호 1 ~ 6의 프라이머를 사용하여 AT1g72360 및 AT2g47520에 대한 RT-PCR을 수행하였다. 이때, 대조군으로는 GAPc (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C subunit) 유전자를 사용하였다. RT-PCR을 실시한 결과 저산소 처리를 하지 않았을 때보다 저산소 처리를 했을 때 AT1g72360과 AT2g47520의 발현이 증가한 것을 확인하였다.

그리고 인터넷 데이터베이스를 이용해 두 유전자가 AP2 도메인을 가진 단백질을 코딩하는 유전자임을 확인하였다.

실시예 3: 스트레스 조건에 대한 AP2 도메인 유전자의 발현 변화

스트레스에 의한 AP2 도메인 유전자의 발현변화를 알아보기 위하여, 애기장대의 잎에 여러 가지 스트레스 처리를 시간별로 다양하게 수행하고, 처리가 종료되면 식물체에서 RNA를 추출하여 실시예 1에서 분리한 AP2 도메인 유전자인 AT2g47520 및 AT1g72360 유전자의 발현변화를 RT-PCR로 확인하였다. 이 때, 대조군으로는 GAPc (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase C subunit)를 사용하였으며, PCR에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.

AT1g72360 F: 5'-AGAATCCGTGGAGCCAAAGC-3' (서열번호 1)

AT1g72360 R: 5'-TCGGTCTGGTTCTCAAAAGC-3' (서열번호 2)

AT2g47520 F: 5'-CTGTTAGCAGCAGGAAGAAG-3' (서열번호 3)

AT2g47520 R: 5'-TTGATTCCCCCCTGGTTTAG-3' (서열번호 4)

GAPc F: 5'-CACTTGAAGGGTGGTGCCAAG-3' (서열번호 5)

GAPc R: 5'-CCTGTTGTCGCCAACGAAGTC-3' (서열번호 6)

2개월 정도 재배한 애기장대의 잎을 물이 띄운 후, 1000 μmole photon m^-2s^-1 조건의 빛을 최대 4 시간 동안 가함으로써 강광 스트레스를 유발하였으며, 동일한 조건의 식물체를 암상태에서 99.00% 질소가스에 최대 24시간 동안 노출시켜 저산소 스트레스 상태를 유발하고, 상기 식물체에 대해 AT2g47520 및 AT1g72360 유전자 발현변화를 확인하였다.

또한, 만니톨(mannitol), ABA (abscisic acid) 또는 ROS (reactive oxygen species) 유발 물질인 10 μM MV (methyl viologen)를 흡수한 필터 페이퍼 위에 발아 후 10일이 경과된 애기장대를 올리고 최대 8 시간 내지 24시간을 방치하여 건조 스트레스, 호르몬에 의한 스트레스 및 ROS 처리를 하여, 이로부터 얻어진 식물체에 대해 AT2g47520 및 AT1g72360 유전자의 발현변화를 확인하였다.

그 결과, AT2g47520 및 AT1g72360 유전자는 저산소 조건에서 모두 발현이 강하게 증가되었으며, AT2g47520 유전자의 경우에는 염, 건조 스트레스, ABA 처리 또는 ROS 처리시에 특히 발현이 증가하는 반면, AT1g72360 유전자의 경우에는 염, 건조 스트레스, ABA 처리 또는 ROS 처리 시 발현이 감소하는 것으로 나타났다 (도 1 및 도 2).

실시예 4: 식물체 과발현용 binary 벡터( pFGL571 )의 제작

식물체 발현용 벡터의 프로모터로서 사용되는 CaMV35S 프로모터가 B-도메인과 minimal 프로모터(core) 만을 포함할 경우, 식물 유래 임의의 유전자를 과발현시킬 수 있는 특징이 있다(Philip N.B. et al ., EMBO J., 9:1685, 1990). 이를 이용하여 식물체 내의 모든 부위에서 목적 유전자를 과발현시킬 수 있고 또한 조작이 용이한 식물체 과발현용 벡터를 만들기 위해, CaMV35S 프로모터의 B domain과 minimal 프로모터(core)를 PCR로 증폭하여 쌍자엽용 binary 벡터인 pPZP211(Peter H. et al ., Plant Molecular Biology , 25:989, 1994)의 HindIII/PstI 부위에 클로닝하였으며, 제조된 벡터를 pFGL571이라 명명하였다.

애기장대의 AP2 유전자인 AT2g47520 및 AT1g72360를 과발현시키기 위하여, 하기의 프라이머를 사용하여 PCR로 분리하고, 각각의 PCR 산물에 BamHI과 SalI을 처리한 다음, 상기 pFGL571 벡터의 BamHI - SalI위치에 삽입하여 벡터를 완성하였다 (도 3).

AT1g72360 F: 5'-CGCGTCGACATGTCTCAAAGCTTTGAACT-3' (서열번호 7)

AT1g72360 R: 5'-GATGGATCCTCAGGACCATAGACCCATGT-3' (서열번호 8)

AT2g47520 F: 5'-GATGTCGACATGTGTGGGGGAGCTATCAT-3' (서열번호 9)

AT2g47520 R: 5'-CGCGGATCCTTAATTGGAGTCTTGATAGC-3' (서열번호 10)

실시예 5 : AP2 도메인 과발현 식물체의 제조

실시예 4에서 제조된 AT2g47520 및 AT1g72360가 각각 삽입된 벡터를 사용하여 Agrobacterium (GV3101)을 형질전환하고, floral-dipping 방법(Clough and Bent, Plant J., 16:735, 1998)으로 식물체(애기장대)를 형질전환시켜, T₀ 종자를 확보하였다.

상기 형질전환된 T₀ 종자를 대상으로 벡터의 카나마이신 저항성을 이용해 T₁ 식물체를 일차 선별하였으며, 선별된 형질전환체 잎의 total RNA를 TRI-Reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 분리하였다. 상기 분리된 RNA의 5 ㎍을 취하여, RNase-free DNase I (Promega, USA)을 처리한 다음, MMLV-reverse transcriptase (Promega, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 상기 cDNA를 주형으로 하여, 서열번 호 1 ~ 6의 프라이머를 사용하여 AT2g47520 및 AT1g72360에 대한 RT-PCR을 수행하였다. 이때, 대조군으로는 GAPc (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C subunit) 유전자를 사용하였다.

그 결과, AT2g47520의 AP2 도메인이 과발현되는 형질전환 애기장대는 3번 및 7번이, 그리고 AT1g27360의 AP2 도메인이 과발현되는 형질전환 애기장대는 2번 7번이 선별되었다 (도 4).

실시예 6: AP2 도메인 유전자의 과발현에 의한 스트레스 저항성 변화

실시예 5에서 선별된 AP2 도메인 유전자가 과발현되는 애기장대의 종자를 배지에서 각각 발아시킨 다음, 7일이 된 어린 식물체에 대해 NaCl을 사용한 염 스트레스 및 만니톨을 사용한 건조 스트레스에 대한 저항성의 변화를 관찰하였다.

7일이 된 어린 식물체를 배양하는 배지에 각 스트레스 유발물질인 130 mM 내지 150 mM NaCl, 또는 400 mM의 만니톨을 혼합하여 1 내지 2주간 재배하여 스트레스에 대한 저항성을 조사하였다.

그 결과, AT2g47520 및 AT1g72360의 과발현 형질전환체 모두 염(NaCl) 및 건조(Mannitol) 스트레스에 대해 저항성을 가지는 것으로 관찰되었다 (도 5 및 6).

실시예 7: AP2 도메인 유전자의 돌연변이에 의한 스트레스 저항성 변화

식물 크로모좀 1에 존재하는 AT1g72360의 두 번째 엑손 부위의 서로 다른 위치에 T-DNA가 삽입된, 각각 ap2 2-1 및 ap2 2-2로 명명된 돌연변이 애기장대를 Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, www.arabidopsis.org)에서 분양받아, 이를 사용하여 스트레스 저항성 변화를 관찰하였다 (도 7).

과발현 형질전환체와 동일하게 돌연변이 애기장대의 종자를 배지에서 각각 발아시킨 다음, 7일이 된 어린 식물체에 대해 120 mM 내지 160 mM의 NaCl을 사용하여 염 스트레스 처리를 하고 이에 대한 저항성의 변화를 관찰한 결과, 염 스트레스에 대해 생장이 매우 취약한 것으로 나타났으며, 야생형에 비해 뿌리 생장이 느린 것으로 나타났다 (도 8 및 도 9).

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의한 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 강광, 저산소, 고염 스트레스에 대한 AP2 도메인 유전자인 AT1g72360 및 AT2g47520의 발현변화를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 건조, ABA (abscisic acid), ROS (reactive oxygen species) 처리에 의한 AP2 도메인 유전자인 AT1g72360 및 AT2g47520의 발현변화를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 AT1g72360 또는 AT2g47520가 삽입된 pFGL571의 벡터 지도이다.

도 4는 AT1g72360 또는 AT2g47520을 과발현하는 벡터로 형질전환된 식물체를 선별하기 위한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 AT1g72360 과발현 형질전환체의 고염(NaCl) 및 건조(Mannitol) 스트레스 저항성에 대한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 AT2g47520 과발현 형질전환체의 고염(NaCl) 및 건조(Mannitol) 스트레스 저항성에 대한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 AT1g72360의 두 돌연변이 형질전환체를 제조하기 위해, AT1g72360의 두 번째 엑손에서 T-DNA의 삽입부위(ap2 2-1 및 ap2 2-2)를 나타내는 크로모좀 1의 유전자 지도이다.

도 8은 AT1g72360 돌연변이체의 고염(NaCl) 스트레스 저항성에 대한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 AT1g72360의 ap2 2-1 돌연변이체에 대한 NaCl 농도에 따른 고염 스트레스 저항성에 대한 결과를 야생종과 비교하여 나타낸 그래프이다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Stress-REsistant Plants Transformed with AP2 (Apetala 2) Domain-Containing Genes <130> P07-B259 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT1g72360 F <400> 1 agaatccgtg gagccaaagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT1g72360 R <400> 2 tcggtctggt tctcaaaagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT5g47520 F <400> 3 ctgttagcag caggaagaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT2g47520 R <400> 4 ttgattcccc cctggtttag 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPc F <400> 5 cacttgaagg gtggtgccaa g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPc R <400> 6 cctgttgtcg ccaacgaagt c 21 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT1g72360 F <400> 7 cgcgtcgaca tgtctcaaag ctttgaact 29 <210> 8 <211> 29 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Glu Asn His Glu Ala Asp Leu Asp Val Ala Val Val Ser 100 105 110 Ser Ala Pro Ser Ser Ser Cys Leu Asp Phe Leu Trp Glu Glu Asn Asn 115 120 125 Pro Asp Thr Leu Leu Ile Asp Thr Gln Trp Leu Glu Asp Ile Ile Met 130 135 140 Gly Asp Ala Asn Lys Lys His Glu Pro Asn Asp Ser Glu Glu Ala Asn 145 150 155 160 Asn Val Asp Ala Ser Leu Leu Ser Glu Glu Leu Leu Ala Phe Glu Asn 165 170 175 Gln Thr Glu Tyr Phe Ser Gln Met Pro Phe Thr Glu Gly Asn Cys Asp 180 185 190 Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ser Leu Phe Asp Gly Gly Asn Asp Met Gly 195 200 205 Leu Trp Ser 210

Claims

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서열번호 11의 염기서열로 표시되는 스트레스 저항성 AP2 (Apetala 2) 도메인을 코딩하는 DNA로 형질전환되고, 저산소(anoxia), 고염, 건조, ABA (abscisic acid), ROS(reactive oxygen species)로 구성된 스트레스에 저항성을 갖는 식물세포 또는 식물체.