KR101465692B1

KR101465692B1 - AtbHLH113 유전자를 이용한 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR101465692B1
Application number: KR20140029381A
Authority: KR
Inventors: 박연일; 신동호; 최명구
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2014-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2014-12-02

Abstract

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절하는 방법, 상기 bHLH113 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 식물의 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 bHLH113 단백질 코딩 유전자를 포함하는 유효성분으로 포함하는, 식물체의 안토시아닌 생합성 조절용 조성물 및 상기 bHLH113 단백질 코딩 유전자의 발현이 저해되어 안토시아닌 생합성이 증가된 돌연변이 식물체에 관한 것이다.

Description

AtbHLH113 유전자를 이용한 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with regulated anthocyanin biosynthesis using AtbHLH113 gene and the plant thereof}

본 발명은 AtbHLH113 유전자를 이용한 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절하는 방법, 상기 bHLH113 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 식물의 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 bHLH113 단백질 코딩 유전자를 포함하는 유효성분으로 포함하는, 식물체의 안토시아닌 생합성 조절용 조성물 및 상기 bHLH113 단백질 코딩 유전자의 발현이 저해되어 안토시아닌 생합성이 증가된 돌연변이 식물체에 관한 것이다.

안토시아닌(anthocyanin)은 식물의 꽃, 열매, 줄기 또는 잎 등의 색깔을 결정할 뿐 아니라 식물의 성장 및 발달에 있어서도 아주 중요한 기능을 한다. 안토시아닌은 꽃잎에서 곤충 등의 꽃가루 매개자를 유혹하고, 열매 및 씨앗에서 종자의 분산을 돕는다. 또한, 안토시아닌을 포함한 플라보노이드 화합물은 곤충 및 외부 스트레스에 대한 식물의 손상을 보호하는 기능을 하고, 특히 활성산소 등에 의한 손상을 막는 항산화제로 작용한다(Gould et al., 2004, J. Biomed. Biotechnol. 5:314-320).

식물에서 안토시아닌 생합성 경로는 잘 알려져 있는데, 식물체 내 안토시아닌의 축적은 플라보노이드 생합성 경로에 포함된 주요 효소들을 암호화하는 구조 유전자군의 조절과 이들 구조 유전자들의 발현을 조절하는 조절 유전자들에 의해 이루어진다. 금어초, 페튜니아 및 애기장대에서 CHS(chalcone synthase), CHI(chalcone isomerase), F3H(flavanone 3-hydroxylase) 등은 플라보노이드계 화합물의 초기 합성에 관여하는 EBGs(early biosynthetic genes)로서 다양한 플라보노이드 화합물 생합성 기작에 모두 공통으로 관련되어 있으며, 초기에 발현이 이루어진다. 한편 DFR(dihydroflavonol 4-reductase), LDOX(leucoanthocyanidin oxygenase), ANR(anthocyanidin reductase), UF3GT(UDP-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase) 등은 LBGs(late biosynthetic genes)로서 EBG들의 발현이 이루어진 후 나중에 발현되며, 안토시아닌 생합성 경로의 후반부를 담당하고 있다.

식물체에서 안토시아닌의 축적은 다양한 환경자극에 반응하여 조절되는 것으로 알려져 있는데 특히 빛, 온도, 당, 식물호르몬 및 무기염류 등은 식물체의 안토시아닌 생합성에 있어 아주 중요한 인자들이며, 이들의 상호작용에 의해 다양한 조직 및 세포에서 색소 축적이 조절된다. 따라서 안토시아닌 생합성에 있어 이들 인자의 상호작용을 밝히는 것은 식물체의 안토시아닌 색소 축적 및 식물 2차 대사 기작을 이해하는 데 있어 매우 중요하다. 이전의 연구에서 다양한 빛 조건 하에서 안토시아닌의 생합성 변화를 연구하여, 빛이 안토시아닌 생합성에 있어서 아주 중요한 인자 중 하나임이 밝혀졌으며, 특히 인산의 결핍, 저온 스트레스 및 당의 증가는 빛에 의해 야기되는 안토시아닌 축적에 있어 중요한 인자로 작용하는 것으로 알려졌다(Lea et al., 2007, Planta. 225:1245-1253). 또한, 안토시아닌 생합성에 있어 수크로즈, 호르몬 에틸렌, 시토키닌, 지베렐린 및 앱시스산의 상관관계에서 당에 의한 안토시아닌 생합성이 에틸렌 및 지베렐린에 의해서 억제되는 것으로 알려졌다(Das et al., 2012, Mol. Cell. 34:501-507).

내적 및 외적 요인에 의한 안토시아닌 생합성은 구조 유전자에 의해서 조절되는데, 현재까지 당에 의한 안토시아닌 생합성 촉진은 R2R3 MYB 전사인자인 PAP1(production of anthocyanin pigment 1) 및 PAP2, WD-40 단백질인 TTG1(transparent testa glabra 1) 그리고 bHLH(basic helix-loop-helix) 전사인자인 TT8, GL3 및 EGL3로 구성된 MBW(MYB-bHLH-WD40) 전사복합체에 의해서 조절되는 것으로 알려져 있다. 반면에 R3 MYB 전사인자인 MYBL2는 LBW(MYBL2-bHLH-TTG1) 복합체를 형성하여 안토시아닌 생합성에 있어 억제적 조절자(negative effector)로 작용한다. 다시 말해서 안토시아닌 생합성은 MBW 및 LBW 복합체 간의 경쟁적 관계에 의해서 조절된다. 상기 복합체 이외에 MYB11, 12, 111, 113 및 114는 복합체를 형성하지 않고 독립적으로 안토시아닌 생합성 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려졌다. 당에 의한 안토시아닌 생합성은 PAP1 발현은 촉진되는 반면 MYBL2 발현은 억제됨으로서 안토시아닌 생합성 양의 증가를 유도한다. 반면, 에틸렌 및 당에 의한 안토시아닌 생합성 억제는 PAP1 발현을 억제함으로써 일어난다. 시토키닌에 의한 당 유도 경로의 촉진은 PAP1 발현의 촉진을 통해서 나타나는 것으로 알려졌다. 이와 같이 전사수준에서 PAP1 전사인자의 발현 조절은 안토시아닌 생합성 경로에서 매우 중요함을 알 수 있다. 그럼에도 불구하고 당 및 호르몬의 신호에 의해서 PAP1의 전사를 조절하는 경로에 대해서는 밝혀진 바는 없다.

본 발명의 bHLH113 유전자는 애기장대에 존재하는 총 170개의 bHLH(basic Helix-Loop-Helix) 단백질 중의 하나로서, At3G15900으로 명시되어 있다. 진핵 단세포에서 bHLH는 염색체 분리나 대사경로를 조절하며, 동물에서는 외부환경 신호 감지, 세포주기 및 일주리듬 조절, 신경발생, 성 결정, 분화 등의 발달을 조절한다. 식물에서는 안토시아닌 생합성의 조절, 상처, 한발, 과일 성숙, 기공 및 뿌리 발달 등의 생장과 분화에 매우 중요한 역할을 한다. 본 발명에서는 애기장대 bHLH113 유전자가 안토시아닌 생합성 경로 조절 전사인자 일종인 PAP1과 MYBL2의 전사체 수준을 조절하는 신규 기능을 확인하였다.

한편, 한국등록특허 제0809736호에는 '안토시아닌 생합성 억제 활성을 가진 MYB60 유전자와 상기 유전자가 도입된 형질전환 상추 및 그 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1337243호에는 '펩티드 수송체 AtPTR2의 안토시아닌 생합성을 조절자로서의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 AtbHLH113 유전자를 이용한 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 T-DNA 삽입 돌연변이를 통해서 안토시아닌 색소의 생합성이 증가된 돌연변이 식물체를 선발하였고, 상기 돌연변이 식물체가 전사인자 bHLH113 유전자의 프로모터 부위에 T-DNA 삽입으로 인한 돌연변이로 인해 bHLH113의 발현이 저해되어 안토시아닌 생합성이 증가된 것임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 bHLH113 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 식물의 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 bHLH113 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 안토시아닌 생합성 조절용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어 안토시아닌 생합성이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다.

본 발명에 따르면, 애기장대 유래 전사인자 bHLH113 유전자를 이용하면 대표적인 식물 색소 물질인 안토시아닌의 생합성을 조절할 수 있으므로, 본 발명의 bHLH113 유전자는 안토시아닌의 함량이 증가된 식물체의 개발에 이용될 수 있으며, 안토시아닌은 대표적인 항산화 물질이므로 본 발명의 방법을 통해 경제적으로 가치가 높은 식물체를 개발할 수 있으므로, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 PAP1 유전자 3' 말단 UTR 부근에 T-DNA가 삽입된 부위(A) 및 pap1D 돌연변이체의 표현형 분석(B)을 나타낸 것이다. Basta^r는 바스타(barstar) 저항성을 나타내고, LB는 왼쪽 보더(left border), RB는 오른쪽 보더(right border), 4X 35S는 35S의 4 카피를 나타낸다. Col-0는 애기장대 야생형인 Columbia-0를 나타내고, pap1D는 PAP1 유전자가 과발현된 돌연변이체를 나타낸다.
도 2는 광 세기에 따른 안토시아닌 축적 변화를 야생형, pap1D 및 r394 3차 돌연변이 계통에서 분석한 결과이다. Col-0는 애기장대 야생형인 Columbia-0, pap1D는 PAP1 유전자가 과발현된 돌연변이체, r394는 pap1D 식물체에 T-DNA 삽입을 통해 안토시아닌 함량이 pap1D 모본에 비해 180% 증가한 선별된 식물체를 의미한다.
도 3은 140μmolem^-2s^-1의 광 세기에서 수크로스 농도에 따른 야생형, pap1D 및 r394 2차 돌연변이 계통에서 안토시아닌 함량 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 R394 돌연변이체의 bHLH113 유전자 내 T-DNA 삽입 위치 및 TAIR(http://www.arabidopsis.org/)의 T-DNA 삽입 돌연변이체 집단 중 bHLH113에 T-DNA 태깅(tagging)된 계통(m21, Sail_390H03; m22, Salk_091084)의 모식도를 나타낸다.
도 5는 야생형, pap1D 및 r394 돌연변이 식물체에서 bHLH113의 전사체 수준을 분석한 결과이다.
도 6은 야생형, pap1D 및 r394 돌연변이 식물체에서 제초제 저항성 유전자(도 4 참고) bar의 전사체 수준을 분석한 결과이다.
도 7은 야생형, pap1D 및 r394 돌연변이 식물체에서 안토시아닌 생합성에 관련된 구조 유전자 및 조절 유전자의 전사체 수준을 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 야생형(Col-0), m21(Sail_390H03) 및 m22(Salk_091084) 돌연변이 식물체에서 bHLH113의 전사체 수준을 나타낸다.
도 9는 야생형(Col-0), m21(Sail_390H03) 및 m22(Salk_091084) 돌연변이 식물체에서 광 세기에 따른 안토시아닌 축적 변화를 확인한 결과이다. HL은 높은 광(240μmolem^-2s^-1)을, LH은 낮은 광(60μmolem^-2s^-1)을 의미한다.
도 10은 야생형(Col-0), m21(Sail_390H03) 및 m22(Salk_091084) 돌연변이 식물체에서 안토시아닌 생합성에 관련된 구조 유전자 CHS, DFR, LDOX 및 UF3GT의 전사체 수준을 분석한 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 bHLH113 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 bHLH113 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 안토시아닌 생합성의 조절 방법에 있어서, 상기 bHLH113 코딩 유전자의 발현 조절은 bHLH113 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 애기장대 유래 bHLH113 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절은 바람직하게는 bHLH113 단백질 코딩 유전자의 발현이 저해된 것으로, 이는 상기 유전자의 프로모터에 T-DNA가 삽입되어 유도된 것으로, 식물세포에서 bHLH113 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 안토시아닌 생합성을 증가시켰다. bHLH113 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 상기 bHLH113 유전자를 발현 저해 벡터인 VIGS 벡터나 RNAi 벡터에 삽입하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

애기장대 유래 bHLH113 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 bHLH113 단백질 코딩 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

bHLH113 단백질 코딩 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 VIGS 벡터 또는 RNAi 벡터이다. VIGS (Virus-induced gene silencing)는 바이러스 벡터에 식물유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 식물유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후(post-transcriptional), RNA 턴오버(RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적(nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 상기 VIGS 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 지속적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 지속적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 bHLH113 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 안토시아닌 생합성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 bHLH113 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어 안토시아닌 생합성이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다. 상기 bHLH113 유전자의 발현 저해는 bHLH113 유전자의 프로모터에 T-DNA가 삽입되어 돌연변이체를 유도하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, bHLH113 유전자의 발현을 저해하는 방법이면 모두 가능할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물 재료 및 생장 조건

본 발명에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 야생형인 Col-0(Columbia-0) 및 Ws(Wassilewskija), 안토시아닌 과축적 돌연변이 식물체인 pap1D 식물체(CS3884, ABRC, 미국)를 사용하였다(도 1). 애기장대 식물체는 4.44g/ℓ MS(Murashige 및 Skoog) 염과 0.7% 한천 분말, 60mM 수크로스 또는 5.5mM 포도당을 함유한 pH 5.7의 배지에서 생장시켰다. 모든 종자는 4℃의 암소에서 5일 동안 저온 처리를 거친 뒤, 18시간의 광 조건 및 6시간의 암 조건이 반복되는 광주기를 거친 후에 22℃의 배양실로 옮겨 12일간 생장시켰다. 필요에 따라 0, 70, 140 및 240μmolem^-2s^-1 광도의 빛을 조사시켰다. 필요 시 애기장대를 4.44g/ℓ MS 염과 0.7% 한천 분말을 포함한 배지에 엿당, 포도당, 과당, 만니톨 및 팔라티노스를 각각 60mM씩 첨가하거나, 포도당 및 과당을 각각 30mM씩 첨가한 후 pH 5.7로 조절한 배지에서 생장시켰다.

형질전환 및 제한효소자리 확장 중합효소연쇄반응 ( RSE - PCR )

pap1D 형질전환 돌연변이체로부터 T-DNA가 삽입된 부분을 동정하기 위해 제한효소자리 확장 중합효소연쇄반응(RSE-PCR, restriction site extension-polymerase chain reaction)을 실시하였다. RSE-PCR이란 DNA에 삽입된 알려지지 않은 게놈 DNA 단편의 효과적인 분리를 위해 구축한 방법으로, 1차 RSE-PCR의 첫 번째 사이클에서 제한효소로 절단된 DNA 단편이 확장되고, 그 후의 2차 네스티드(nested)-PCR 과정 동안 타겟 단편이 특이적으로 증폭된다. RSE-PCR은 큰 게놈 식물체에서 알려지지 않은 부위에 알려지지 않은 DNA로부터 태깅된 서열(T-DNA 또는 트랜스포존)을 밝힐 수 있는 고 효율의 방법이다. pap1D 돌연변이 식물체 조직 100mg을 액체질소를 이용하여 막자사발에서 분쇄한 후, DNA 추출 용액(50mM Tris-HCl pH 7.4, 250mM 염화나트륨, 25 mM EDTA, 0.5% SDS)을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 페놀/클로로포름 용액 추출 및 에탄올 침전을 통하여 게놈 DNA를 정제한 후, 약 500ng의 형질전환된 돌연변이 식물체의 게놈 DNA를 KpnI, PstI 및 SalI 제한효소로 절단하였다. T-DNA 특이적인 보더(border) 프라이머 및 임의적인 arbitary 프라이머(표 1)를 이용하여 1차 RSE-PCR을 실시하여 T-DNA 단편을 증폭하였다. 상기 증폭된 T-DNA 단편을 주형으로 이용하여 2차 네스티드-PCR을 실시한 후, 아가로스 겔에 전기영동하여 증폭된 단편을 분리하였다. 상기 분리된 단편을 겔 정제 키트를 이용하여 정제한 후, 시퀀싱하여 T-DNA 삽입부위를 확인하였다.

RES-PCR 분석에 사용한 프라이머 목록

프라이머	서열정보(5'→3')
L1	TCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGG (서열번호 3)
L2	TGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCCTA (서열번호 4)
L3	TGTTTACACCACAATATATCCTGC (서열번호 5)
L4	GGTTTCGCTCATGTGTTG (서열번호 6)
ADkpn	GTAATACGACTCACTATAGGGCGTACC (서열번호 7)
ADPst	GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAG (서열번호 8)
ADSac	GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCTC (서열번호 9)
AP	GTAATACGACTCACTATAGGGC (서열번호 10)

RNA 추출, 역전사 PCR 및 실시간 정량 PCR 분석

0.1g의 식물체 조직을 액체 질소로 얼려 막자 사발에서 분쇄한 후, RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, 독일)를 사용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 추출하였다. cDNA를 합성하기 위하여 추출한 총 RNA 1㎍을 15개의 티민(thymine)이 연결된 올리고-dT 프라이머 및 dNTP와 함께 65℃ 항온수조에서 5분간 반응시켜 단일가닥을 생성한 뒤, 역전사효소인 SuperScript II 역전사효소(Invitrogen, 미국)를 첨가하여 42℃ 항온수조에서 1시간 동안 역전사 시켰다. 총 20㎕의 반응액을 끓는 물에 5분간 반응시켜 역전사효소의 활성을 제거한 후, 핵산 분해 효소가 없는 물(nuclease-free water) 80㎕를 첨가하여 1/5로 희석하였다. mRNA 발현 정도를 비교하기 위한 역전사-PCR은, 합성된 cDNA 2㎕를 주형으로 하고, 각 유전자와 상보적인 10pmole의 프라이머(표 2) 1㎕를 Taq-중합효소 혼합물(Bioneer, 한국)에 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR은 DNA Engene(BioRAD, 미국)을 이용하여 각 PCR 산물이 포화되지 않는 조건으로 반복횟수를 결정하였다. 합성된 PCR 산물을 10㎍/㎖EtBr(ethidium bromide)이 포함된 1% 아가로스 겔에서 전기영동 하였고, GELDOC 2000 농도계 및 영상 분석 시스템(BioRad, 미국)으로 확인하였다. 실시간 정량 PCR(Quantitative Real-Time PCR)을 수행하기 위해, 역전사-PCR 방법과 같이 주형 cDNA 및 프라이머를 섞어준 후, 10㎕의 iQSYBR Green Supermix(BioRad, 미국)를 섞어 Exicycler 96(Bioneer, 한국)을 이용하여 순환 역치(cycle threshold, C_T)를 얻었다. 각 유전자의 C_T를 액틴 유전자의 C_T 값으로 나눈 후, 그 역수를 취하여 mRNA 발현 정도를 계산하였다.

RT-PCR 분석에 사용한 프라이머 목록

유전자	서열정보(5'→3')		용도
유전자	정방향 (서열번호)	역방향 (서열번호)	용도
R394-1	CGAACTCTTCCAGCGAGCC (11)	CGTGACTTTTCGTGGAAAGAG (12)	돌연변이 스크리닝
R394-2	AGCATAAATTGGCATCCAATG (13)	TCGACGTGACTGACATCTGAG (14)	돌연변이 스크리닝
R394	CTCCATACGGCAAGACAG (15)	CCTTGAGGTAACGACGG (16)	역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)
PAP1	AGACATTACGCCCATTCCTACAAC (17)	GTCGCTTCAGGAACCAAAATATCT (18)
ACT2	ATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT (19)	GAAACATTTTCTGTGAACGATTCCT (20)
18S rRNA	CCTGCGGCTTAATTTGACTC (21)	CCGGATCATTCAATCGGTA (22)
ACTIN2	GCTGAGAGATTCAGATGCCCA (23)	GTGGATTCCAGCAGCTTCCAT (24)	정량적 중합효소 연쇄반응 (Q-PCR)
CHS	GGCAAAGAAGCGGCAGTGAAG (25)	CGGAAGGACGGAGACCAAGAAG (26)
DFR	CTTTGTTCGTGCCACCGTTCG (27)	TCCTTCCTCAGATAAATCAGCCTTCC (28)
LDOX	GTTTGCAGCTTTTCTACGAGG (29)	TGAGCAAAAGTCCGTGGAGG (30)
UF3GT	TGTCAGATCGTTTTGGTTCC (31)	GATTCTTCCTCACTTTCTCAC (32)
PAP1	CAAGAGGTAGATATTTTGGTTCC (33)	CTATACACAAACGCAAACAAATG (34)
PAP2	ATGGAGAAGGCAAATGGCATCAAG (35)	CCAGCAATCAAGGACCACCTATTTC (36)
TTG1	CTCCGCTCATCCTCCGGTCACAG (37)	CAACGGCGCACAAAACTCGCTCG (38)
TT8	GGCGGTTCAATCTGTGGAC (39)	CTGTTGGCTCCTCTCTAACG (40)
EGL3	GGATTCAACGGTTAGGTCAG (41)	ATCATCTTCTGCGATTTCTCTC (42)
GL3	GAGCAACAGAGAAATGTGAAGAC (43)	GTTCCTGATGATGATGACGA (44)
MYBL2	GCCCATTCCAAGTACCAA (45)	AGCGTTTCTTGACCTGTTGA (46)

안토시아닌 추출 및 정량

광 세기가 다른 각 조건에서 12일간 생장한 식물을 처리구 당 20개의 유식물을 취하여 600㎕의 추출 용액(1%(v/v) 염산이 포함된 메탄올)에 담궈 4℃ 암소에서 6시간 동안 보관하였다. 이후 증류수 200㎕ 및 클로로포름 200㎕를 순서대로 첨가하고 12,000rpm으로 5분간 원심분리하여 얻어진 상층액을 UV-VIS 분광기(Shimadzu, 일본)를 이용하여 530nm 및 657nm에서 흡광도를 측정하였다. A₅₃₀-0.33A₆₅₇의 수식에 대입하여 얻어진 안토시아닌의 양을 추출에 이용된 식물 개체의 수로 나누었다.

실시예 1. PAP1 과발현체의 2차 돌연변이 유도를 통한 안토시아닌 색소 생합성에 관련된 새로운 돌연변이주의 선발

PAP1(production of anthocyanin pigment 1) 유전자가 과발현된 pap1D 돌연변이체를 모본으로 하여 T-DNA로 형질전환한 후, 무작위 T-DNA 삽입 이중 돌연변이체 집단을 구축하였다. 형질전환을 통해서 총 832계통의 T2 돌연변이주를 선발할 수 있었으며, 이들 중 444 계통은 T-DNA가 1 카피 삽입된 돌연변이주로 항생물질 선발에서 나타났으며, 134 계통은 2 카피, 82 계통은 3 카피 이상 T-DNA가 삽입된 것으로 나타났다. 또한, 나머지 172 계통은 멘델의 분리비를 따르지 않는 것으로 나타났다. 상기 1 카피 T-DNA가 삽입된 444 계통 중 219 계통은 pap1D 타입의 표현형을 보여 안토시아닌 색소의 과축적을 보여 주었으며, 165 계통은 pap1D 타입의 표현형이 억제되어 야생형과 비슷하게 색소축적이 거의 유도되지 않았다. 반면에 60종은 야생형과 pap -1D 돌연변이의 중간 수준 정도의 안토시아닌 색소축적을 보여주었다.

상기 T-DNA가 삽입된 돌연변이주의 안토시아닌 색소축적의 표현형을 관찰한 후, 219종의 pap1D 타입 중에 모본 pap1D 보다 더 높은 색소축적을 보이는 돌연변이 식물체를 사용해서 T-DNA가 삽입된 위치를 동정하여 PAP1 유전자의 전사 또는 전사체의 안정성 조절에 관여하는 유전자를 발굴하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, 모본으로 사용한 pap1D 돌연변이주는 PAP1 유전자의 3'UTR 부근에 CaMV의 35S 증폭자(enhancer)가 삽입되어 PAP1 유전자의 발현이 촉진되어 식물체 전반에 걸쳐 과도한 안토시아닌 색소의 축적이 이루어지는 변이체이다. 본 발명에서 대조군으로 사용한 애기장대 야생형인 Col-0(Columbia-0) 및 pap1D 돌연변이체의 표현형을 도 1B에 나타내었다.

실시예 2. 광(빛) 세기에 따른 안토시아닌 함량

안토시아닌 함량은 빛의 세기 및 파장에 의존하는데, 애기장대의 경우 암소에서는 안토시아닌 축적이 일어나지 않으며 빛 세기가 증가함에 따라 함량 축적이 증가되는데, 240μmolem^-2s^-1의 빛 세기까지 안토시아닌 함량이 지속적으로 증가한다(Jeong et al., 2010, Plant Physiol. 154:1514-1531). 본 발명자들은 T-DNA가 삽입된 돌연변이체에서 빛 세기에 따른 안토시아닌 함량 변화를 분석하였다.

r394 돌연변이는 상기 실시예 1의 1 카피 T-DNA가 삽입된 444 계통 중 pap1D 표현형이 더욱 심화되어 높은 수준의 안토시아닌 색소축적 양상을 보이는 8 계통 중의 하나이다. 상기 r394 돌연변이가 빛의 세기와 무관하게 PAP1 유전자를 조절하는지 조사하고자 낮은 빛 세기와 중간 빛 세기의 조건에서 돌연변이 식물체를 배양하여 안토시아닌 색소 함량 변화를 측정하였다. 도 2에 나타난 바와 같이 약한 빛 세기(70μmolem^-2s^-1)와 중간 빛 세기 조건(140μmolem^-2s^-1)의 토양에서 생장된 r394 계통은 매우 높은 안토시아닌 함량을 보였으며, pap1D의 표현형 보다 더욱 심화된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 수크로스 농도에 따른 안토시아닌 함량

당(sugar)은 애기장대를 포함함 식물의 안토시아닌 생합성을 촉진한다. 애기장대의 경우 포도당이나 과당에 비해 수크로스(sucrose) 또는 말토스(maltose)가 안토시아닌 생합성을 더욱 촉진한다. 반면에 다른 이당류인 팔라티노스(palatinose) 및 삼투조절자 만니톨(mannitol)은 안토시아닌 생합성에 영향을 미치지 못한다. 그래서, 애기장대의 안토시아닌 생합성을 촉진하는 수크로스 농도에 따른 안토시아닌 함량을 야생형(Col-0), pap1D 및 r394 돌연변이 식물체에서 조사하였다. 도 3에 나타난 바와 같이 수크로스 농도 증가에 따라, 안토시아닌 함량이 현저하게 증가하였다. 90mM의 수크로스 농도에서 야생형 및 pap1D 돌연변이체는 수크로스가 처리되지 않은 대조구에 비해 안토시아닌 함량이 각각 6배 및 10배 증가되었고, r394 돌연변이체에서는 pap1D 돌연변이체의 표현형 보다 150% 높은 색소 축적을 보였다.

실시예 4. R394 계통의 유전형 특성 분석

r394 계통에서 T-DNA가 삽입된 부분을, T-DNA를 포함하는 DNA 절편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 제한효소자리 확장 중합효소연쇄반응(RSE-PCR) 기법으로 조사하였다.

T-DNA가 삽입된 위치를 확인한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 T-DNA가 bHLH113 유전자의 프로모터 부위에 삽입되어 있었다(r394 붉은색 화살표시). 그리고, bHLH113 유전자의 3' 말단 특이 프라이머 세트(3F 및 3R; 서열번호 15 및 16)를 이용하여 역전사-PCR을 수행한 결과, 도 5와 같이 야생형(Col-0) 및 pap1D 돌연변이체에 비해서 r394 돌연변이체에서 bHLH113 유전자의 mRNA 양이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다. 즉, T-DNA 삽입에 의해서 bHLH113 전사체 수준이 감소하였음을 확인할 수 있었다.

또한, pap1D 돌연변이체에서와 같이 r394 돌연변이체에서 PAP1 유전자에 삽입된 제초제 저항 유전자 바스타(barstar)를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 DNA를 증폭한 결과, r394 돌연변이체에서도 바스타가 증폭된 PCR 밴드를 얻을 수 있었다(도 6). 상기 결과는 r394 돌연변이 계통의 PAP1이 3' UTR 부근에 T-DNA가 삽입되어 유지되고 있음을 나타낸다.

실시예 5. 안토시아닌 생합성 유전자 전사체 함량

PAP1 유전자는 안토시아닌 생합성 경로의 뒷 단계에 관여하는 유전자를 조절하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 애기장대 야생형(Col-0), pap1D 및 r394 돌연변이체에서 안토시아닌 생합성 경로에 관여하는 유전자들의 발현 수준을 확인해보았다.

알려진 바와 같이 pap1D 과발현 돌연변이체에서 안토시아닌 생합성 경로의 앞 단계에 관여하는 CHS(chalcone synthase) 유전자의 전사체 함량은 야생형과 큰 차이가 없었으나, 안토시아닌 생합성 경로의 뒷 단계에 관여하는 유전자인 DFR(dihydroflavonol 4-reductase), LDOX(leucoanthocyanidin oxygenase) 및 UF3GT(UDP-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase)의 전사체 함량은 야생형에 비해 10~90 배 이상 높게 확인되었다(도 7). 반면, r394 돌연변이체에서는 PAP1 전사체가 pap1D 돌연변이체에 비해 30% 감소하였고, MYBL2 전사체는 70% 감소하여 PAP1 전사체의 감소량보다 두 배 이상 크게 감소하였다. 그러나, 야생형에 비해서는 PAP1 및 MYBL2 두 전사체가 각각 40배와 2배 높게 유지되었다. 상기 결과는 r394 돌연변이체가 PAP1 및 MYBL2 전사체 수준을 조절하고 있음을 의미한다.

실시예 6. bHLH113 돌연변이체(m21 및 m22)에서 안토시아닌 및 안토시아닌 생합성 유전자 전사체의 함량 분석

애기장대는 bHLH 전사인자로 170개의 유전자를 가지고 있는데, bHLH113은 그 생물학적 기능이 보고된 바 없다. 전술한 실시예를 통해 r394 돌연변이체 라인은 T-DNA가 bHLH113 유전자의 프로모터 부위에 삽입된 결과로 나타났으며, 안토시아닌 색소의 함량은 pap1D 돌연변이체보다 더 높은 색소축적의 표현형을 보여주었다. 즉, 상기 결과를 통해 bHLH113가 PAP1의 발현을 조절하며, 결과적으로 안토시아닌 생합성 경로를 조절함을 의미했다. 따라서 bHLH113가 PAP1 전사체 조절에 관여할 가능성을 조사하고자 T-DNA 삽입 돌연변이 집단(http://www.arabidopsis.org) 중에서 bHLH113의 프로모터 위치와 2번째 인트론 위치에 T-DNA가 삽입된 라인인 m21과 m22(도 4) 라인을 확보한 후 순계라인을 구축하였고, 구축된 순계라인의 bHLH113 유전자 발현을 조사한 결과, 두 돌연변이종 모두에서 야생형(Col-0)에 비해 감소된 전사체 수준을 확인하였다(도 8). 또한, 안토시아닌 함량도 야생형에 비해 상기 두 돌연변이종에서 모두 증가하였는데, 특히 m22 돌연변이체는 낮은 광 세기(60μmolem^-2s^-1)나 높은 광 세기(240μmolem^-2s^-1)모두에서 빛 세기와 상관없이 야생형에 비해서 약 250% 높은 수준의 안토시아닌 함량을 보여주었다(도 9). 이러한 안토시아닌 함량 증가는 안토시아닌 생합성 유전자 중 후기 단계에 관여하는 DRF, NDOX 또는 UF3GT 유전자보다 초기 단계에 관여하는 유전자인 CHS의 발현 증가에서 기인하는 것으로 확인되었다(도 10).

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Method for producing transgenic plant with regulated anthocyanin biosynthesis using AtbHLH113 gene and the plant thereof <130> PN14040 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 426 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgtcaggtt ctgtcttcgt tcccggtatg gcgattggag ttcccacgct ttctcgttcg 60 agctctgttc accggagctt agaaccgacg aagaagatga ctatgagtag tgtcaaattc 120 gtgaccagtt ttcgaaaccc gtcaaactgt tcagggacaa aacggtcatt tcgcgttatg 180 gcttccgatg accggtcgga acaagcagat aacggtcaag gaattcagga ggacttaaac 240 tacttgttga agatcggagt tggttcagtg gcaggtgcag ctataatcaa atacggaagt 300 gtcttgttcc cacagatcac aagacctaat ctcactctag ccctcttcat tatcatagct 360 cctgttgtaa tctccgttat ccttttgtcc ctatcatcat catcttcctc caagaaacag 420 aactga 426 <210> 2 <211> 141 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ser Gly Ser Val Phe Val Pro Gly Met Ala Ile Gly Val Pro Thr 1 5 10 15 Leu Ser Arg Ser Ser Ser Val His Arg Ser Leu Glu Pro Thr Lys Lys 20 25 30 Met Thr Met Ser Ser Val Lys Phe Val Thr Ser Phe Arg Asn Pro Ser 35 40 45 Asn Cys Ser Gly Thr Lys Arg Ser Phe Arg Val Met Ala Ser Asp Asp 50 55 60 Arg Ser Glu Gln Ala Asp Asn Gly Gln Gly Ile Gln Glu Asp Leu Asn 65 70 75 80 Tyr Leu Leu Lys Ile Gly Val Gly Ser Val Ala Gly Ala Ala Ile Ile 85 90 95 Lys Tyr Gly Ser Val Leu Phe Pro Gln Ile Thr Arg Pro Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Ala Leu Phe Ile Ile Ile Ala Pro Val Val Ile Ser Val Ile Leu 115 120 125 Leu Ser Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Lys Gln Asn 130 135 140 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tctccataat aatgtgtgag tagttcccag ataaggg 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgtgagtagt tcccagataa gggaattagg gttccta 37 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgtttacacc acaatatatc ctgc 24 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggtttcgctc atgtgttg 18 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtaatacgac tcactatagg gcgtacc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtaatacgac tcactatagg gctgcag 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtaatacgac tcactatagg gcagctc 27 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cgaactcttc cagcgagcc 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cgtgactttt cgtggaaaga g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 agcataaatt ggcatccaat g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcgacgtgac tgacatctga g 21 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctccatacgg caagacag 18 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccttgaggta acgacgg 17 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 agacattacg cccattccta caac 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gtcgcttcag gaaccaaaat atct 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 attcagatgc ccagaagtct tgt 23 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gaaacatttt ctgtgaacga ttcct 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cctgcggctt aatttgactc 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ccggatcatt caatcggta 19 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gctgagagat tcagatgccc a 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gtggattcca gcagcttcca t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ggcaaagaag cggcagtgaa g 21 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cggaaggacg gagaccaaga ag 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ctttgttcgt gccaccgttc g 21 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tccttcctca gataaatcag ccttcc 26 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtttgcagct tttctacgag g 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tgagcaaaag tccgtggagg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 tgtcagatcg ttttggttcc 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gattcttcct cactttctca c 21 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 caagaggtag atattttggt tcc 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ctatacacaa acgcaaacaa atg 23 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 atggagaagg caaatggcat caag 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ccagcaatca aggaccacct atttc 25 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ctccgctcat cctccggtca cag 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 caacggcgca caaaactcgc tcg 23 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ggcggttcaa tctgtggac 19 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ctgttggctc ctctctaacg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ggattcaacg gttaggtcag 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 atcatcttct gcgatttctc tc 22 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gagcaacaga gaaatgtgaa gac 23 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gttcctgatg atgatgacga 20 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gcccattcca agtaccaa 18 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 agcgtttctt gacctgttga 20

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 bHLH113 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 애기장대 유래 bHLH113 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 안토시아닌 생합성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 애기장대 유래 bHLH113 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 저해는 bHLH113 유전자의 프로모터에 T-DNA가 삽입되어 돌연변이체를 유도하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 식물체의 안토시아닌 생합성을 조절하는 방법.
애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 애기장대 유래 bHLH113 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 안토시아닌 생합성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항 또는 제5항의 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체.
제6항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제6항에 따른 식물체의 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 안토시아닌 생합성 조절용 조성물.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 bHLH113 (basic helix-loop-helix 113) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어 안토시아닌 생합성이 증가된 돌연변이 식물체.
제10항에 있어서, 상기 bHLH113 유전자의 발현 저해는 bHLH113 유전자의 프로모터에 T-DNA가 삽입되어 돌연변이체를 유도하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 생합성이 증가된 돌연변이 식물체.