KR20150106528A

KR20150106528A - 식물의 비생물학적 스트레스 내성을 증가시키는 고추 유래의 msrb2 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150106528A
Application number: KR1020140028702A
Authority: KR
Inventors: 김연기; 김정숙; 남백희; 박향미; 김율호; 이상복; 정지웅; 강경호
Original assignee: 주식회사 그린진 바이오텍; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2015-09-22

Abstract

본 발명은 고추(Capsicum annuum) 유래 MSRB2(methionine sulfoxide reductase B2) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 상기 MSRB2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 야생형에 비해 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 비생물학적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자는 비생물학적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물의 비생물학적 스트레스 내성을 증가시키는 고추 유래의 MSRB2 유전자 및 이의 용도{MSRB2 gene from pepper for increasing abiotic stress resistance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 비생물학적 스트레스 내성을 증가시키는 고추 유래의 MSRB2 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추(Capsicum annuum) 유래 MSRB2(methionine sulfoxide reductase B2) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법, 상기 MSRB2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 야생형에 비해 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 비생물학적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.

식물은 광, 가뭄, 염분, 고온 및 병원균 감염 등 여러 환경 스트레스에 노출되어 있고, 여러 비생물학적 및 생물학적 스트레스를 받게 되면 성장, 신진 대사, 그리고 생산성에 중요한 영향을 받는다. 하지만 식물은 이러한 외부 자극 또는 스트레스에 따른 방어 관련 기작을 가지고 있다.

이러한 식물의 병 저항성 반응 또는 여러 비생물학적 및 생물학적 스트레스에 대한 내성을 가지는 식물의 방어 관련 기작 연구는 지금까지 알려져 있지 않은 생체 내 기작을 규명하는 과학 기술적 가치를 지닌다. 또한 식물방어관련 유전자의 정보는 작물의 분자적 유전육종의 직접적 재료로서 제공될 수 있을 뿐 아니라 전통적 유전육종에도 사용될 수 있는 장점을 지니고 있다.

환경친화적 식량생산의 측면에서 병 방어 관련 다양한 유전자, 또는 이들 형질을 이용한 작물 육종은 경제적으로 중요한 병원체, 잡초 및 환경적 스트레스에 의한 손실을 최소화함으로써 식량생산비용을 줄일 수 있으며, 고품질의 식량을 제공하여 농산물의 경쟁력 회복에 기여함과 동시에 신품종의 개발과 연관된 다양한 산업의 활성화에 기여한다.

다양한 환경 스트레스 중 가뭄은 식물의 성장과 생산성에 가장 유해한 영향을 미치는 환경 요소 중에 하나로, 가뭄 스트레스에 의한 피해 중 하나는 미토콘드리아, 엽록체, 그리고 퍼옥시좀에서 생산되는 활성화산소(ROS)에 의한 것이다. 세포 내에서 과도하게 생산된 ROS는 단백질의 구조를 변화시키고 기능을 손상시킨다. 따라서 이러한 세포 내 과도한 ROS 생성을 효율적으로 억제 또는 저해하여 식물의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 연구가 필요하다.

이에 본 발명자들은 고추(Capsicum annuum)에서 분리된 MSRB2(Methionine sulfoxide reductase B2) 유전자를 이용하여 식물의 가뭄 또는 산화 등의 스트레스에 대한 식물체의 저항성을 확인하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제1260935호에는 '환경 스트레스 내성 유도 고추 유전자 CaBl-1'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0827349호에는 '비생물적 스트레스 내성 유도 고추 유전자 CaABS2'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 비생물학적 스트레스 내성을 증가시키는 고추 유래의 MSRB2 유전자 및 이의 용도에 관해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 MSRB2 유전자가 과발현하는 벼 형질전환 식물체를 제작하였고, 상기 MSRB2 과발현 형질전환 식물체가 건조 또는 산화 스트레스 조건에서 야생형에 비해 스트레스에 대한 내성이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고추(Capsicum annuum) 유래 MSRB2(methionine sulfoxide reductase B2) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 야생형에 비해 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 비생물학적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자가 과발현하는 식물체는 가뭄 또는 산화 스트레스 처리 시 야생형 대조구에 비해 스트레스 내성이 증가된다. 따라서, 본 발명의 고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자는 비생물학적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 개발에 유용하므로, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 사용된 CaMSRB2 유전자를 포함하는 이식 유전자의 모식도(A) 및 야생형(WT) 및 형질전환 식물체에서 가뭄 스트레스 전후의 도입 유전자의 발현을 확인한 PCR 결과(B)이다.
도 2는 메틸 비올로겐 처리에 의한 야생형(WT)과 CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체의 산화 스트레스에 대한 반응을 확인한 결과이다.
도 3은 야생형(WT)과 CaMSRB2 - Bar 형질전환 식물체의 가뭄 스트레스 후의 생체중(FW) 및 건조 중량(DW)의 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 야생형(WT)과 CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체의 가뭄 스트레스 처리에 따른 Fv/Fm 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 야생형(WT)과 CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체의 가뭄 스트레스 처리 후의 모습(A)과 생존율(B) 및 엽록소 지표(C)를 확인한 결과이다.
도 6은 생식 단계의 야생형(WT) 및 CaMSRB2 - Bar 형질전환 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 반응을 확인한 결과로, (A)는 정상 재배 조건이며 (B)는 5일 동안 물 공급을 중단한 조건 그리고 (C)는 7일 동안 물 공급을 중단한 조건에서의 식물체의 상태를 보여주는 사진이며, (D)는 가뭄 스트레스 조건에서 토양의 수분 손실 정도를 측정한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추(Capsicum annuum) 유래 MSRB2(methionine sulfoxide reductase B2) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 MSRB2 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 MSRB2 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 MSRB2 단백질 코딩 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

MSRB2 단백질 코딩 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 지속적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 지속적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 가뭄, 산화, 열, 광 및 염 스트레스 등일 수 있으며, 바람직하게는 가뭄 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

고추 유래 MSRB2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 MSRB2 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함하며, 그 상세 범위는 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 제초제 저항성 유전자(bar)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 가뭄, 산화, 열, 광 및 염 스트레스 등일 수 있으며, 바람직하게는 가뭄 또는 산화 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 고추 유래 MSRB2 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 비생물학적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 MSRB2 단백질 코딩 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

플라스미드 제작

Rab21 : gfp(Yi et al., 2010, Planta 232:743-754) 플라스미드를 주형으로 하고 정방향(5'-CTTGTCACCACCGTCATGT-3'; 서열번호 3) 및 역방향(5'-TCTCAGAGATCGAGGTGTTC-3'; 서열번호 4) 프라이머를 사용하여 Rab21 프로모터 서열(1.6kb)를 증폭하였다. pSB-RTG(Jang et al., 1999, Mol. Breed. 5:453-461)의 rbcS 프로모터-Tp 서열을 Rab21 프로모터로 대체하여 pSB-Rab21 플라스미드를 제작하였다. ccdB 유전자와 클로람페니콜-저항성 유전자가 측면에 있는 attR 재조합 자리를 포함하고 있는 게이트웨이 카세트를 블런트-엔드(blunt-end)로 pSB-Rab21 플라스미드 내로 클로닝하여 pSB-RbGW를 제작하였다. 서울대학교 최도일 교수로부터 얻은 CaMSRB2 유전자의 cDNA를 제조사(Invitrogen)의 설명에 따라 LR 반응을 통해 바이러니 벡터인 pSB-RbGW 내로 삽입하여, MSRB2-Bar 플라스미드를 제작하였다. 또한, CaMSRB2 유전자를 감자 단백질가수분해효소 억제제 Ⅱ 터미네이터/35S 프로모터/bar 없이 pSB-RbGW 내로 삽입하여, MSRB2-mini 플라스미드를 제작하였다(도 1A).

만들어진 플라스미드는 삼친교배(triparental mating) 방법(Hiei et al., 1994, Plant J. 6:271-282)을 통해서 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404 균주로 형질전환하였다.

아그로박테리움 매개 벼 형질전환

MSRB2-Bar 또는 MSRB2-mini를 포함하고 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주를 벼(Oryza sativa L. Japonica cv. Ilmi)의 배발생캘러스 내로 도입하여, 캘러스를 유도하고, 형질전환된 캘러스를 이전의 방법(Sohn et al., 2006, Korean J. Breed. 38:173-179)을 통해서 선별하였다. 선별된 캘러스는 250㎎/ℓ의 세포탁심을 포함하고 있는 신선한 2N6 배지(Modified N6 salts and vitamins(Chu et al., 1975, Sci. Sin. 16:659-688), 300mg/ℓ 카사미노산, 500mg/ℓ 프롤린, 500mg/ℓ 글루타민, 30g/ℓ 수크로스, 2mg/ℓ 2,4-D, 2.5g/ℓ 겔란검, pH 5.8)에서 2주 동안 계대배양하다가 선별 및 재생을 위한 250㎎/ℓ의 세포탁심과 4㎎/ℓ의 포스피노트리신(phosphinotricin)을 포함하는 MSR 배지(4.4g/ℓ MS salts, 0.5g/ℓ MSE, 1mg/ℓ NAA, 5mg/ℓ kinetin, 30g/ℓ 수크로스, 4g/ℓ 파이토겔, pH 5.8)로 옮겨 27℃, 지속적인 명(light) 조건에서 4주 동안 배양하였다. 재생된 줄기는 4㎎/ℓ의 포스피노트리신을 포함하는 MSO 배지(MS(Murashige & Skoog) salts and vitamins, 30g/ℓ 수크로스, 2g/ℓ 겔란검, pH 5.8)로 옮겨 4주 동안 뿌리 유도를 하였다. 묘목들은 비닐 하우스 내 Wagner pot(200cm²)으로 옮겨심고 추가로 생장시켰다. MSRB2-Bar와 MSRB2-mini의 형질전환 벼의 T₃ 세대를 이후 연구에 사용하였다.

RNA 추출 및 역전사 중합효소연쇄반응( RT - PCR )

야생형과 형질전환 벼의 총 RNA는 TRI Reagent(molecular research center, 미국)를 사용하여 잎으로부터 추출하였고, RNeasy mini kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 회수하였다. cDNA 주형은 RevertAid H minus M-MulV 역전사효소(Fermentas, 미국)를 사용하여 합성하였고, 반정량적(semiquantitative) RT-PCR 반응은 95℃ 2분 1회, 94℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초의 25 내지 30 사이클을 통해 수행하였다. 실시간 정량적 RT-PCR 분석은 2X 실시간 PCR Pre-mix with EvaGreen(SolGent, 한국)을 사용하여 수행하였으며, 온도 사이클 및 형광 검출은 Stratagene Mx3000P 실시간 PCR 장비 및 소프트웨어(Stratagene, 미국)를 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR 반응은 각 cDNA 시료에 대해 세 번 반복 수행하였고, 벼의 튜불린 유전자를 내부 대조구로 사용하여 분석하였다. 본 발명에 사용된 프라이머 종류 및 서열정보는 하기 표 1과 같다.

유전자 이름	정방향(5'→3')(서열번호)	역방향(5'→3')(서열번호)
CaMSRB2	GCTCCACCTCATTGTTGAGATTC (5)	GTCAGGAGTGCGATTAATAGC (6)
Bar	GAGTCGACCGTGTACGTCTC (7)	GTCAAATCTCGGTGACGGG (8)
Rab21	ACCACCGACACCGGCGAGAA (9)	TTGCGCTCGGCTAGCTCATC (10)
RbcS	CACTCACCGTGGAGGATCTT (11)	AGCGCGATGCTTGATCTTAG (12)
Tubulin	ACCGTGATTGATGAGGTGAG (13)	CAGCGTTGAACACAAGGAAG (14)

메틸 비올로겐 ( methyl viologen ) 처리

4주령의 야생형 및 형질전환 식물체로부터 잎을 떼어내고, 0.1% 트윈-20 중의 메틸 비올로겐을 0.1mM 포함하고 있는 MS 배지에 담근 후 지속적인 명 조건(150μmol photons m^-2s^-1)의 28℃ 온도에서 2일 동안 두었다. 메틸 비올로겐에 대한 잎의 민감도는 잎의 총 면적 대비 chlorotic/necrotic의 면적(%)을 Image J 소프트웨어(http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 정량화하여 분석하였다.

가뭄 스트레스 처리

야생형 및 CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체를 가뭄 예비실험으로서 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 처리하여 관찰한 후, 식물체의 다양한 단계에서 가뭄 스트레스 조건을 처리하였다.

유식물에서의 가뭄 내성을 측정하기 위해서, 껍질을 벗기지 않은 씨앗을 15% 치아염소산나트륨(sodium hypochlorite)에 10분 동안 처리하여 멸균하고 클린 벤치안에서 증류수로 멸균하였다. 멸균된 씨앗은 MS 배지를 포함하고 있는 시험관에 넣고, 시험관은 형광등 하에서 주변 온도 25±2℃의 조건의 생장 챔버에 두어 배양하였다. 4주령 유식물을 10% PEG에 맞춰진 MS 배지에서 이틀 동안 배양하다가 PEG 용액을 다른 튜브로 옮기고, MS 배지를 채워 8일 동안 생장 챔버에서 추가로 배양하였다. 그런 후에 식물체의 생체중(fresh weight)과 건조 중량을 측정하였다.

영양 단계 동안의 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 측정하기 위해서, 멸균된 씨앗을 육묘용상토가 들어있는 5cm³ 포트 당 9개 씨앗의 밀도로 심었다. 상기 포트들이 있는 트레이를 물이 채워져 있는 플라스틱 상자로 옮기고, 자연광의 장일 조건(16시간 명/8시간 암)으로 30±2℃ 조건의 비닐 하우스 내에 두었다. 4주령 식물체들을 플라스틱 상자의 남은 물을 모두 옮기고 3일 동안 급수를 중단하는 것으로 가뭄 스트레스를 처리하였다. 생존율 및 엽록소 지표는 2주 동안 물을 재공급한 후에 측정하였다. 생존율은 각 유전자형에 대해 18개의 식물체로부터 계산하였으며, 엽록소 지표는 10개의 식물체로부터 엽록소 측정기 SPAD502(Spectrum technology, 미국)를 사용하여 측정하였다.

생식 단계 동안의 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 측정하기 위해서, 12개의 멸균된 씨앗들을 200cm² 크기의 포트에 각각 하나씩 심고, 자연광의 장일 조건(16시간 명/8시간 암)으로 30±2℃ 조건의 비닐 하우스에서 성장시켰다. 가뭄 스트레스는 원추 꽃차례 출수기(panicle heading stage, 출수 전 15일)에 시작하였다. 가뭄 스트레스를 유도하기 위해서, 12주령의 야생형 및 형질전환 식물체를 0, 3, 5, 7 또는 9일 동안 물을 공급하지 않았다. 가뭄 스트레스 처리 후, 종자 성숙 단계 동안 회복될 수 있도록 식물체들에 물을 다시 공급하였다. 가뭄 스트레스에 대한 잎의 저항성은 시각적으로 관찰하였고, 토양 수분 흡입은 수분력계 DIK-3023(Daiki Rika Kogyo Co., 일본)를 사용하여 측정하였다.

가뭄 스트레스 조건에서 엽록소 형광 분석

4주령 된 야생형 및 형질전환 식물체로부터 떼어낸 잎들을 지속적인 광 조건(100μmol photons m^-2s^-1)의 25℃ 온도 조건에서 풍건하였다. Fv/Fm은 mini PAM(WALZ, 독일) 장비를 사용하여 시간 경과에 따라 측정하였다. Fv/Fm은 잠재적 최대 광계Ⅱ 양자율을 나타내는 것으로, 건강한 잎의 수치는 약 0.8 정도이다. 분석 결과는 평균±SE(n=5)를 나타내며, 각 실험은 3회 반복 수행하였다.

통계 분석

모든 통계 분석은 Sigma plot 버전 10 소프트웨어(www.sigmaplot.com)를 사용하였다.

실시예 1. CaMSRB2 과발현 벼 형질전환 식물체의 분석

형질전환 벼 식물체에서 CaMSRB2의 역할을 확인하기 위해서, 두 가지 다른 플라스미드를 벼 형질전환에 사용하였다. 도 1A의 구조에서 CaMSRB2 유전자는 가뭄 스트레스에 의해서 발현유도되는 유전자인 벼 Rab21 프로모터에 의해 조절된다. MSRB2-Bar 플라스미드는 형질전환 세포를 확인하기 위한 선별 마커로써 bar 유전자를 포함하고 있는데, bar 유전자는 포스피노트리신을 무독성의 아세틸 형태로 변환시키는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(phosphinothricin acetyltransferase)를 코딩하고 있으며, 본 발명의 플라스미드에서 bar 유전자는 35S 프로모터의 조절하에 놓여져 있다. 그러나, 마커 유전자가 형질전환 세포의 증식 및 분화능 감소 및 종내 및 종간의 이종교배에 의한 유전자 전달과 같은 부작용이 보고되었기 때문에, 본 발명에서는 선별 마커가 포함되지 않은 MSRB2-mini 플라스미드를 추가로 제작하였다.

MSRB2-Bar 플라스미드에 대한 19개의 독립적인 형질전환 식물체를 아그로박테리움 매개 형질전환 방법과 bar 선별 조건을 통해 얻었다. 5개의 독립적인 MSRB2-mini 형질전환 식물체는 약 1,000개의 식물체로부터 bar 선별 과정 없이 얻었다. 상기의 24개 T₀ 형질전환 식물체로부터 T-DNA 측면 부위를 아답터-라이게이션 PCR 방법(Balzergue et al., 2001, Biotechniques 30:496-498)을 통해 분리하였고, 시퀀싱을 수행한 후, FSTVAL(http://bioinfo.mju.ac.kr/fstval/)을 사용하여 분석하였다. MSRB2-Bar 형질전환 식물체들 중 이식 유전자를 유전자간 단일 카피로서 가지고 있는 8번과 23번 라인을, MSRB2-mini 형질전환 식물체들 중 이식 유전자를 이식 유전자를 유전자간 단일 카피로서 가지고 있는 하나의 라인을 선택하고 추가 분석을 수행하였다. 4주령의 야생형과 형질전환 식물체로부터 물 공급을 중단하기 전과 중단 후 2일째에 RNA를 추출하였다. 가뭄 스트레스에 대한 확인은 스트레스 유도 마커 Rab21의 발현 여부로 확인하였다. MSRB2-Bar 및 MSRB2-mini 형질전환 벼 식물체에서 CaMSRB2 유전자는 이틀의 가뭄 스트레스 처리 후에 높게 발현되었다(도 1B). 흥미롭게도, MSRB2-Bar 형질전환 식물체에서 CaMSRB2 유전자가 가뭄 스트레스 처리 없이도 발현유도되었다(0 day). 이 결과는 식물체가 지속적인(constitutive) 35S 프로모터 또는 35S 프로모터 조절 하에서 bar 유전자의 지속적인 발현에 의한 스트레스에 의해 영향을 받은 것으로 사료되었다.

실시예 2. CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체의 산화 스트레스 반응 분석

MSRB2-Bar 및 MSRB2-mini 형질전환 벼 식물체에서 산화 스트레스 유도 물질인 메틸 비올로겐에 대한 저항성을 시험해보았다. 메틸 비올로겐 이온은 광계I(photosystem I)으로부터 생성된 전자와 반응하여 자유 라디칼 형태를 만든다. 이러한 자유 라디칼이 산소와 반응하여 불포화 막(membrane) 지방산을 공격하면 화학적으로 매우 반응성이 높은 과산화물(superoxide)이 생산되는데, 결과적으로 세포막과 조직의 분해를 야기한다.

야생형 또는 CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체로부터 떼어낸 잎을 0.1mM 메틸 비올로겐에 담궜을때, 황화 부위와 검은 반점 부위가 야생형에 비해서 형질전환 식물체에서 현저하게 감소됨이 확인되었다(도 2). 메틸 비올로겐 처리에 의해 활성산소종의 생성이 증가된 것을 고려하였을 때, 상기의 결과는 활성산소종의 생성에 의한 손상이 CaMSRB2 유전자의 발현에 의해 감소됨을 의미하였다. 또한 MSRB2-Bar 형질전환 식물체가 MSRB2-mini 형질전환 식물체에 비해 산화 스트레스에 대한 저항성이 보다 좋은 것을 확인할 수 있었는데, 이는 bar 유전자의 영향인 것으로 사료되었다.

실시예 3. CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체의 가뭄 스트레스 반응 분석

CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체에 있어서 CaMSRB2 유전자의 가뭄 스트레스에 대한 반응을 조사하였다. 유전자의(genic) 그리고 다중 카피의 이식 유전자에 의한 해석의 복잡함을 피하기 위해서, MSRB2-Bar 형질전환 식물체 중 유전자간 부위에 이식 유전자가 단일 카피로 들어가 있는 다섯 개의 형질전환 식물체(4, 8, 14, 23 및 30 라인)를 선별하여 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 처리하였다. 단일 카피의 이식 유전자가 유전자 부위에 도입된 형질전환 식물체(29 라인) 하나를 비교를 위해 포함시켰다. 4주령의 유식물을 10% PEG를 포함하고 있는 MS 배지에서 이틀간 배양한 후 생체중과 건조 중량을 측정한 결과 MSRB2-Bar 형질전환 식물체 4, 8, 14, 23 및 29 라인의 생체중이 의미있게 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 건조 중량 역시 야생형 대조구에 비해 높은 수준인 것을 확인할 수 있었다(도 3).

또한, 야생형과 CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체에서 건조 스트레스에 대한 엽록소의 형광 변화를 분석하였다. 광계Ⅱ의 최대 광화학적 효율(Fv/Fm)이 야생형 식물체에서는 건조 스트레스 처리에 의해 큰 폭의 감소를 보인 반면, CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체에서는 야생형 식물체보다 높은 값의 Fv/Fm를 보임을 확인하였다(도 4). 이는 야생형 식물체가 건조 스트레스 조건에서 CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체에 비해 광계Ⅱ 광억제로부터 보다 쉽게 영향을 받음을 의미했다.

식물체 전체를 사용한 가뭄 스트레스 실험에서, 가뭄 스트레스 처리 3일 후에 야생형과 CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체는 모두 마르고, 잎은 백화되었다. 그러나, 물을 다시 공급하고 5일 후에 형질전환 식물체의 성장은 회복된 반면, 야생형 식물체의 성장은 회복되지 못했다(도 5A). 또한, CaMSRB2 과발현 형질전환 식물체는 가뭄 스트레스 후에 18개의 유식물체로부터 14 개체가 회복되어 78%의 생존율을 나타냈으나, 야생형은 7 개체만 회복되어 39%의 생존율을 보여주었다(도 5B). 그리고 MSRB2-mini 및 MSRB2-Bar 형질전환 식물체가 야생형에 비해 각각 16% 및 25% 증가된 엽록소 지표를 보여주었다(도 5C). 이러한 결과들은 CaMSRB2 유전자의 과발현이 광계I 및 광계Ⅱ 모두에 영향을 미친다는 것을 의미하며, CaMSRB2 유전자가 벼에서 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 나타내는데 중요한 역할을 함을 보여주는 것이다. 게다가, 영양 단계 뿐만 아니라 생식 단계에서의 가뭄 스트레스 처리 결과에서도, MSRB2-Bar 형질전환 식물체가 야생형에 비해 스트레스 후의 회복능이 높은 것으로 확인되었다(도 6).

<110> GREENGENE BIOTECH INC. REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> MSRB2 gene from pepper for increasing abiotic stress resistance of plant and uses thereof <130> PN14032 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 atgggttctc agattctcaa aatctcaccg tttactctga ttttcagctc cacctcattg 60 ttgagattcc atgccaaaag gaattgtggc caattcaggc atttaggttt tgtttgttca 120 agtaagagaa ggttcagagg tgggattatt gcgatggcta caccaggctc cgttcacaag 180 tcagaggagg agtggcgtgc aattctctcc cctgagcagt tccgtattct aagacagaaa 240 ggaaccgagt acccaggtac tggagaatat gacaagtttt ctggtgaagg agtctaccaa 300 tgtgcaggat gtggcactcc cctctacaat tccacaacaa aattcaactc aggctgtggt 360 tggccagctt tctttgaggg tcttcctgga gctattaatc gcactcctga ccctgatggc 420 aggaggattg agattacttg tgcagcttgt ggtggccatc tcggtcatgt tttcaagggt 480 gaggggttcc cgaacccaac aaatgagcgc cattgcgtca atagtatttc cctcaagttt 540 acaccggcaa attcctaa 558 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 2 Met Gly Ser Gln Ile Leu Lys Ile Ser Pro Phe Thr Leu Ile Phe Ser 1 5 10 15 Ser Thr Ser Leu Leu Arg Phe His Ala Lys Arg Asn Cys Gly Gln Phe 20 25 30 Arg His Leu Gly Phe Val Cys Ser Ser Lys Arg Arg Phe Arg Gly Gly 35 40 45 Ile Ile Ala Met Ala Thr Pro Gly Ser Val His Lys Ser Glu Glu Glu 50 55 60 Trp Arg Ala Ile Leu Ser Pro Glu Gln Phe Arg Ile Leu Arg Gln Lys 65 70 75 80 Gly Thr Glu Tyr Pro Gly Thr Gly Glu Tyr Asp Lys Phe Ser Gly Glu 85 90 95 Gly Val Tyr Gln Cys Ala Gly Cys Gly Thr Pro Leu Tyr Asn Ser Thr 100 105 110 Thr Lys Phe Asn Ser Gly Cys Gly Trp Pro Ala Phe Phe Glu Gly Leu 115 120 125 Pro Gly Ala Ile Asn Arg Thr Pro Asp Pro Asp Gly Arg Arg Ile Glu 130 135 140 Ile Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly His Leu Gly His Val Phe Lys Gly 145 150 155 160 Glu Gly Phe Pro Asn Pro Thr Asn Glu Arg His Cys Val Asn Ser Ile 165 170 175 Ser Leu Lys Phe Thr Pro Ala Asn Ser 180 185 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cttgtcacca ccgtcatgt 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tctcagagat cgaggtgttc 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gctccacctc attgttgaga ttc 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtcaggagtg cgattaatag c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gagtcgaccg tgtacgtctc 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtcaaatctc ggtgacggg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 accaccgaca ccggcgagaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttgcgctcgg ctagctcatc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cactcaccgt ggaggatctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agcgcgatgc ttgatcttag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 accgtgattg atgaggtgag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cagcgttgaa cacaaggaag 20

Claims

고추(Capsicum annuum) 유래 MSRB2(methionine sulfoxide reductase B2) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 MSRB2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 가뭄 또는 산화 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.
고추 유래 MSRB2(methionine sulfoxide reductase B2) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 MSRB2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 가뭄 또는 산화 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 bar 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체.
제8항에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 가뭄 또는 산화 스트레스인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제8항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제8항에 따른 식물체의 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 고추 유래 MSRB2(methionine sulfoxide reductase B2) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 비생물학적 스트레스에 대한 내성 증가용 조성물.