KR101346586B1

KR101346586B1 - 애기장대 유래의 ｒｅｃａ１ 유전자를 이용한 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR101346586B1
Application number: KR1020120115249A
Authority: KR
Inventors: 김민균; 전혜성
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2014-01-15
Also published as: WO2014061932A1

Abstract

본 발명은 애기장대 유래의 RECA1 유전자를 이용한 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 본 발명의 애기장대 유래의 RECA1 단백질 코딩 유전자는 식물체의 생물적 또는 비생물적 스트레스, 특히 병원균에 대한 면역 반응 관련 유전자 발현을 조절하고, 특히 본 발명의 recA1 유전자 과발현 애기장대 식물체는 토마토반점세균병에 대해 저항성을 나타내는 것을 확인함으로써, 다른 작물에서의 병저항성 작물개발을 위한 분자육종 소재로 이용 가능하며, 병 저항성 품종육성으로 농약사용 절감을 가능하게 하고 그로 인해 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급을 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

Description

애기장대 유래의 ＲＥＣＡ１ 유전자를 이용한 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with increased ability of immune response against pathogen using RECA1 gene from Arabidopsis thaliana and the plant thereof}

본 발명은 애기장대 유래의 RECA1 유전자를 이용한 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 애기장대 유래의 RECA1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 RECA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 병원균에 대한 면역능력을 증진시키는 방법, 애기장대 유래의 RECA1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 애기장대 유래의 RECA1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 병원균에 대한 면역능력 증진용 조성물에 관한 것이다.

대장균(Escherichia coli)에서의 리콤비나아제 A(RecA) 단백질은 상동적 재조합(homologous recombination, HR), DNA 수복(DNA repair) 및 유전체 통합성의 유지에서 중요한 역할을 한다. 대장균 RecA 단백질의 상동체들이 원핵 및 진핵 생물체 모두에서 발견되었고, 리콤비나아제를 수반하는 HR 및 DNA 보수 메커니즘은 원핵생물 및 진핵생물 사이에서 유사하다는 것이 공지되어 있다. 박테리아 RecA의 진핵생물 상동체, 예컨대 RAD51s 및 Dmc1에 의해 매개되는 HR은 진핵생물 생물체에서의 이중 가닥 파손(DSB) 수복 및 감수분열 동안 유전자 다변화 생성에서 중요하다(Inouye et al. 2008 Biosci Biotechnol Biochem 72: 1340-1347).

HR은 UV 조사와 같은 유전자에 해로운 스트레스에 노출된 식물에서 유도된다는 것이 익히 공지되어 있다. 흥미롭게도, HR은 또한 식물이 박테리아 병원균 또는 바이러스에 의한 침습과 같은 생물적인 스트레스에 노출된 경우에도 유도되는 것으로 공지되어 있다(Kathiria et al. 2010 Plant Physiol 153: 1859-1870). 추가로, 진핵생물의 RecA 상동체들은 식물 방어 반응에 관여되는 것으로 보고되었다: 예를 들어, 애기장대에서 핵 RecA 상동체들 중 하나인 RAD51D은 SNI1과의 연결시 중요한 역할을 수행하여, 병원균 공격 또는 DNA를 손상시키고 유전자에 해로운 스트레스에 대한 식물 방어 반응 동안 핵 DNA 재조합 및 발병-관련(PR) 유전자 발현을 증가시키는 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다(Song et al. 2011 Cell Host Microbe 9: 115-124).

미토콘드리아 및 엽록체와 같은 식물 세포 소기관은 세포내 공생설 이론에 따르면 선조 박테리아로부터 기원하는 것으로 여겨지는 그들 자신의 박테리아 RecA 상동체를 갖는다. 애기장대에서의 엽록체 및 미토콘드리아 RecA 상동체, 예컨대 RECA1 및 RECA3은 각각 엽록체 DNA 통합성의 유지 및 미토콘드리아 재조합 감시에 관여되는 것으로 공지되어 있다(Rowan et al. 2010 J Exp Bot 61: 2575-2588).

엽록체는 식물 방어 반응에 관여되는 것들을 포함한 다양한 식물-특이적 대사 프로세스를 담당하고 있는 독특한 식물 세포 소기관이다. 예를 들어, 엽록체에서의 쉬키메이트(shikimate) 경로는 다양한 미생물들에 대한 식물 방어 반응과 관련되어 있는 피토알렉신, 리그닌, 플라보노이드 및 알칼로이드와 같은 2차적 대사물의 전구체로서 방향족 아미노산을 제공한다. 추가로, 식물 발생 및 스트레스 반응에 관여되는 식물호르몬의 전구체들, 예컨대 자스몬산, 에틸렌, 앱시스산이 또한 엽록체에서 합성되고, UV광 또는 박테리아 병원체에 대한 노출시 애기장대에서 합성되는 살리실산(SA)의 거의 90%가 엽록체 내의 이소코리스메이트 신타아제(ICS)에 의해 합성된다. SA는 생물적 스트레스(병원체) 및 비생물적 스트레스(UV, 오존, 메틸 바이올로젠(MV, 파라콰트로도 알려짐))에 대한 식물 방어 반응에 관여되는 중요한 내생적 신호 분자이고, 이는 기본적인 방어뿐만 아니라 전신적인 후천적 내성(SAR)에도 필요하다(Durrant et al. 2007 Proc Natl Acad Sci USA 104: 4223-4227).

최근 연구는 식물 방어 반응에 관여되는 몇가지 엽록체 단백질을 밝혀냈다: 기능적 로단세스 설퍼-트랜스퍼라아제인 NRIP1은 엽록체로부터 세포질로의 그의 유인 후 TIR-NB-LRR 유형 면역 수용체 N에 의한 바이러스 p50 효과기의 인식을 중재함으로써 담배 모자이크 바이러스에 대한 담배(Nicotiana benthamiana)의 내성에 관여되는 것으로 공지되어 있다(Caplan et al. 2008 Cell 132: 449-462). 추가로, 엽록체 단백질 RPH1 (Phytophthora 1에 대해 내성)은 난균류 병원체인 피토프토라 브라시캐(Phytophthora brassicae)-유도성 산화적 버스트(burst)의 양성 조절자로서 밝혀졌으며, 애기장대에서 면역 반응에 대한 방어-관련 유전자 발현을 증강시켰다(Belhaj et al. 2009 Plant J 58: 287-298). 통상적인 콩인 덩굴 강낭콩(Phaseolus vulgaris)에서 엽록체-표적화 리폭시게나아제 PvLOX6는 병원체 감염 및 상처에 의해 유도되는 것으로 공지되어 있다(Porta et al. 2008 Planta 227: 363-373).

본 발명에서는 상기 언급된 생물적 스트레스 반응에서의 엽록체의 연관성을 반영하는 증거와 함께 박테리아 병원체에 대한 식물 방어 반응에서의 애기장대 핵 RecA 상동체 RAD51D의 관여로 인해 엽록체 RecA 상동체 RECA1가 애기장대에서의 생물적 스트레스 반응에 관여되어 있는지 여부를 조사하게 되었다.

한국등록특허 제1170153호에서는 DNA 수복능이 향상된 대장균 recA 형질전환 담배 식물체가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0051847호에서는 세균의 유전물질을 포함하는 식물 병원균에 대한 저항성을 증가시키기 위한 조성물, 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 식물체가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 애기장대 유래의 RECA1 유전자를 이용한 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 애기장대 엽록체 단백질 RECA1이 식물체의 면역 반응과 연관되어 있는지 조사한 결과, SA, MeJA, 에테폰 및 BTH와 같은 생물적 스트레스 관련 식물 호르몬 또는 화합물 처리시 RECA1 전사체 발현양이 현저히 증가되었다. 또한, RECA1 과발현 형질전환체에서는 식물의 방어 반응에 연관된 신호 전달 물질을 코딩하는 유전자인 PAD, EDS1 및 NDR1, 그 다운스트림의 발병 관련 유전자 PR, 살리실산(SA) 생합성 유전자 PBS3 및 ICS1가 과발현된 반면, recA1 돌연변이체에서는 야생형 식물체보다 그 발현량이 감소된 것을 확인하였고, 또한 SA 수준은 야생형보다 RECA1 과발현체에서 현저히 높았다. 특히, 전신획득저항성(SAR) 마커 유전자로 알려진 PR1의 발현은 RECA1 과발현체에서 높았으나, recA1 돌연변이체에서는 SA 처리에도 불구하고 낮게 나타났다.

이러한 분자 수준의 결과와 일치하게도, 식물체의 토마토반점세균병의 원인균인 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000에 대해 RECA1 과발현체에서는 내성을 나타낸 반면, recA1 돌연변이체에서는 민감성을 나타냄으로써, 본 발명의 RECA1 유전자가 식물체의 면역력을 조절하는데 매우 중요한 역할을 수행하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래의 RECA1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 RECA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 병원균에 대한 면역능력을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 애기장대 유래의 RECA1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 유래의 RECA1 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 병원균에 대한 면역능력 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 애기장대 유래의 RECA1 단백질 코딩 유전자는 식물체의 생물적 또는 비생물적 스트레스, 특히 병원균에 대한 면역 반응 관련 유전자 발현을 조절하고, 특히 본 발명의 recA1 유전자 과발현 애기장대 식물체는 토마토반점세균병에 대해 저항성을 나타내는 것을 확인함으로써, 다른 작물에서의 병저항성 작물개발을 위한 분자육종 소재로 이용 가능하며, 병 저항성 품종육성으로 농약사용 절감을 가능하게 하고 그로 인해 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급을 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 다양한 식물호르몬 처리에 반응하여 RECA1 발현의 정량적 실시간 RT-PCR (qRT-PCR) 분석 결과를 나타낸다. 18일령 애기장대 식물을 1 mM SA, 330μM BTH, 100μM MeJA, 1 mM 에테폰 및 100μM ABA로 각각 처리했다. 조직을 식물호르몬 처리 후 다양한 시점에서 시료로 만들었다. 전사체 수준은 각 시료에서 측정된 18S rRNA의 발현에 의해 표준화했다. 오차 바는 표준 편차를 나타낸다(n = 3).
도 2는 RECA1 과발현 형질전환 식물의 구축을 나타낸다. (a) RECA1의 과발현을 위한 pCAMBIA-RECA1의 구축. RECA1 유전자의 코딩 영역은 pCAMBIA 1301의 NOS 말단 및 35S CaMV 프로모터 사이에 도입했다. (b) 및 (c)는 각각 RT-PCR 및 RNA 혼성화 분석에 의한 recA1 mt, WT 및 RECA1 과발현 형질전환 계통에서의 RECA1의 전사 수준을 나타낸다. RT-PCR를 위한 β- TUB 및 rRNA의 에티듐 브로마이드(EtBr)-염색을 동량의 RNA가 식물 계통에 이용되었음을 확인하기 위해 이용했다.
도 3은 RECA1 과발현 식물에서 WT와 비교하여 Gene Onthology (GO) 생물학적 프로세스 분석에 의해 분류된 상향- 및 하향-조절된 유전자의 파이(Pie) 차트를 나타낸다. RECA1 과발현 식물에서 상향조절된 유전자들은 GO 생물학적 프로세스에 의해 기능적 유사성에 따라 11개의 군으로 분류되었다(방어 관련, 키틴에 대한 반응, 2차적인 대사, 대사 프로세스, 식물호르몬 관련성, 비생물적 반응, ROS 반응 또는 대사, 단백질 인산화, 전사조절, 신호전달 및 기타). (a) RECA1 과발현 식물에서 WT 식물과 비교해 2배 초과하여 상향조절된 유전자의 파이 차트(p≤0.05, Student's t-test에 의함). (b) RECA1 과발현 식물에서 WT에 비해 2배 초과하여 하향조절된 유전자의 파이 차트(p≤0.05, Student's t-test에 의함).
도 4는 RNA 혼성화 및 semi-qRT PCR 분석을 이용한 RECA1에 의해 상향조절된 내성-연계 유전자들의 발현 분석을 나타낸다. (a) RNA 혼성화 분석에 의한 2주령 recA1 mt, WT 및 RECA1 과발현 계통에서의 PAD4, ICS1 및 PR5 발현 분석. (b) semi-qRT PCR에 의한 2주령 recA1 mt, WT 및 RECA1 과발현 계통에서의 NDR1, EDS1 및 PBS3 발현 분석. rRNA의 에티듐 브로마이드 (EtBr) 염색 영상 및 18S rRNA에 대한 semi-qRT PCR을 이용해 동량의 RNA가 각 식물 시료에 사용되었다는 것을 보여주었다.
도 5는 recA1 돌연변이, WT 및 RECA1 과발현(#4, #D) 식물 각각에서 PR1 발현을 보여주는 RNA 혼성화 분석을 나타낸다. 분석을 위해 사용된 총 RNA는 ±500μM SA로 처리된 3주령 식물로부터 수득했다. rRNA의 에티듐 브로마이드(EtBr) 염색 영상은 동량의 RNA가 사용되었다는 점을 보여주기 위해 사용되었다.
도 6은 recA1 돌연변이, WT 및 RECA1 과발현(#4, #D) 식물에서의 전체 SA의 내재적 수준을 나타낸다. 총 SA 수준 측정은 3주령 식물을 이용한 HPLC에 의해 수행했다. 데이터는 3회 반복실험의 평균±SD 이다. **, Student's t test에 의해 P < 0.01로 WT 와 유의하게 차이남.
도 7은 Pst DC3000 접종 후 recA1 돌연변이, WT 및 RECA1 과발현 (OE#D) 식물에서의 차별적인 질환 징후를 나타낸다. recA1 mt, WT 및 RECA1 OE#D 식물에 Pst DC3000의 현탁액 배양물을 이용해 분사접종했다. 3회씩의 실험으로부터 수득한 유사한 결과들 중에서 접종 3일 후 가장 대표적인 결과를 보여준다. 하단 사진은 카메라 렌즈의 컬러 필터를 이용해 촬영했다.
도 8은 recA1 돌연변이, WT 및 RECA1 과발현 (OE#D) 식물의 잎 조직에서의 Pst DC3000의 생장 측정 결과이다. 4주령 내지 5주령의 recA1 mt, WT 및 RECA1 OE#D 식물에 Pst DC3000을 접종했다. Pst DC3000의 집락 형성 단위(CFU)를 접종 후 0 또는 2일째(Days After Inoculation: DAI) 취한 잎 조직을 이용해 계수했다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균±SD이다 (0 DAI 일 때 n = 16, 2 DAI 일 때 n = 19). **, Student's t test에 의해 P < 0.01 로 WT와 유의하게 차이남.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 RECA1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 RECA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 병원균에 대한 면역능력을 증진시키는 방법을 제공한다.

상기 RECA1 단백질 코딩 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 RECA1 단백질 코딩 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

RECA1 단백질 코딩 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여,그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 RECA1 유전자의 과발현은 식물의 방어 반응 관련 유전자, 생물적 스트레스 반응 관련 유전자 또는 식물 호르몬 관련 유전자의 발현을 조절할 수 있고, 바람직하게는 식물의 PAD4(Phytoalexin deficient 4), EDS1(Enhanced disease susceptibility 1), NDR1(Non-race specific disease resistance protein 1), PR1(Pathogenesis-related gene 1), PR5(Pathogenesis-related gene 5), PBS3(GH3.12/avrPphB susceptible 3) 또는 ICS1(Isochorismate synthase 1) 유전자의 발현을 증가시켜 식물의 면역 능력을 증진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체의 병원균은 식물에서 발병하여 식물체에 악영향을 미치는 모든 병원균일 수 있으며, 바람직하게는 토마토반점세균병의 원인균일 수 있고, 더욱 바람직하게는 슈도모나스 시린개 피브이. 토마토 DC3000(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 RECA1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 RECA1 단백질 코딩 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두일 수 있고, 가장 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 RECA1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 병원균에 대한 면역능력 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 RECA1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물의 병원균에 대한 면역능력을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 다양한 처리에 의한 RECA1 의 반응

식물에서의 생물적인 스트레스 반응에서의 RECA1의 관여 가능성을 연구하기 위해, 생물적 또는 비생물적 스트레스 관련 식물호르몬 및 BTH 각각으로 처리된 식물에서 RECA1의 유도를 시험했다. 이를 위해, 2주령 애기장대 모종에 SA, BTH, MeJA, 에테폰 및 ABA를 분사-접종했다. 정량적 실시간 RT(qRT)-PCR 분석은 RECA1의 전사 수준이 SA, BTH, MeJA 및 에테폰 처리에 의해 2배 이상 증가했음을 보여줬다(식물호르몬 및 BTH 처리 후 8시간째; SA, BTH, MeJA, 에테폰 및 ABA에 의한 배수 변화는 각각 2.6, 3.0, 2.0, 2.1 및 1.1였다)(도 1). BTH는 여타 생물적 스트레스 관련 식물호르몬에 비해 RECA1 전사체 수준에 있어서 더 큰 증가를 유도했다. 그러나, RECA1 전사체 수준은 ABA 처리에 의해서는 거의 영향받지 않아, ABA가 애기장대에서의 RECA1 발현에 대해서는 영향력이 거의 없음을 나타냈다(도 1). 종합하면, 상기 결과들은 RECA1가 생물적 스트레스 반응에 관여될 가능성을 뒷받침한다.

실시예 2. 동형접합성 recA1 T- DNA 삽입 돌연변이의 선별 및 RECA1 과발현 식물의 구축

RECA1의 기능상 연구를 위해, T-DNA 삽입이 있는 억제자 돌연변이 및 RECA1 을 과발현하는 형질전환 애기장대 식물을 이용했다. RECA1 유전자의 첫번째 엑손(Salk_013480)에 T-DNA 삽입이 있는 recA1 돌연변이를 Arabidopsis Biological Resource Center (Columbus, Ohio, USA)로부터 입수했다. 동형접합성 돌연변이는 하기의 세가지 프라이머의 혼합물을 이용하는 PCR 근거의 유전자형 구분에 의해 스크리닝했다: RECA1 정방향, 5'-ATAAGGATGAGTTGAGAGTACAATGAAG-3'(서열번호 3); RECA1 역방향, 5'-ATGTGAGTAGCCTTGCAATACGTTCAGA-3'(서열번호 4); pROK2에 대한 좌측 경계 프라이머, 5'-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3'(서열번호 5).

또한, RECA1 과발현 계통을 구축했다: 총 RNA를 정상 조건 하에 생장한 2주령 야생형 애기장대(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, 생태형 Columbia-0) 모종으로부터 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, 독일)를 이용해 분리했다. 애기장대 RECA1 cDNA는 분리된 총 RNA 및 RECA1 특이적 역전사 프라이머(5'-TCATTGGAAATCGTCAAGCGAG-3'(서열번호 6))를 이용해 Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, USA)를 이용한 역전사 반응에 의해 수득했다. 이어서, RECA1의 전체 코딩 영역을 정방향 프라이머 5'-AACCATGGATTCACAGCTAGTCTTGTCTC-3' (밑줄친 NcoI 부위 포함 : 서열번호 7) 및 역방향 프라이머 5'-TTCACGTGTCATTGGAAATCGTCAAG-3' (밑줄친 PmaCI 부위 포함 : 서열번호 8)를 이용해 PCR 증폭시키고, GUS 제거된 pCAMBIA1301 (MRC, Cambridge, UK)로 클로닝했다(도 2a).

결과로서 수득한 재조합 플라스미드(p35S : RECA1)를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefacience) C58C1로 도입한 후, 플로랄 스프레이 형질전환 방법(Chung et al. 2000 Transgenic Res 9: 471-486)에 의해 애기장대 식물에 형질전환했다. 형질전환체를 하이그로마이신(30 mg/L)을 보충한 1/2 강도 MS 배지 상에서 선별하고, 이어서 트랜스진에 대해 동형접합성인 RECA1 과발현 T₃ 형질전환 계통을 하이그로마이신 내성에 대한 분리 비율을 근거로 수득했다.

트랜스진에 대해 동형접합성인 6개의 독립적인 T₃ 과발현 계통이 수득되었다. 형질전환 계통들은 RT-PCR, RNA 혼성화 분석 및 하이그로마이신 내성에 의해 선별했다(도 2b 및 2c). RT-PCR 및 RNA 혼성화 분석 결과는 RECA1 전사체가 야생형(WT) 식물에 비해 형질전환 계통에서 더 많이 발현된다는 것을 보여줬다. 대조적으로, recA1 돌연변이 계통의 전사체는 RT-PCR 및 RNA 혼성화 분석에서는 거의 검출되지 않았다(도 2).

실시예 3. RECA1 과발현 식물에서의 수많은 방어-반응성 유전자의 유도

생물적 스트레스 관련 식물호르몬 및 화학물질뿐만 아니라 메틸 비올로겐에 의한 RECA1의 유도를 근거로 하여 마이크로어레이 실험을 수행해, RECA1에 의해 발현이 조절되는 유전자를 찾아냈다. WT 및 RECA1 과발현 형질전환 식물(계통 #1)을 실험에 이용했다. 혼성화는 약 24,000개의 애기장대 유전자를 나타내는 22,500개를 초과하는 프로브 세트를 포함하는 Arabidopsis Affymetrix ATH1 유전체 어레이를 이용해 실시했다.

626가지의 애기장대 유전자가 RECA1 과발현 식물에서는 WT에 비해 2배 넘게 상향조절되는 한편, 동일한 형질전환 식물에서 299가지의 유전자가 2배 넘게 하향조절됨을 발견했다. 상향조절 및 하향조절된 유전자를 Gene Ontology (GO) 생물학적 프로세스(BP) 카테고리를 기준으로 하여 11가지 기능적인 군으로 분류했다(방어 반응 관련성, 키틴에 대한 반응, 2차적인 대사, 대사적인 프로세스, 식물호르몬 관련성, 비생물적 스트레스 반응, ROS 반응 또는 대사, 단백질 인산화, 전사조절, 신호 전달 및 기타)(도 3). BP에 의해 분류된 유전자의 수는 상향조절된 유전자의 실제 수보다 더 많이 계수되었는데, 이는 일부 유전자들이 다중의 생물학적 기능 지정으로 인해 1개를 초과하는 군으로 분류되었기 때문이다(표 1). 도 3 및 표 1에 나타낸 바와 같이, RECA1 과발현 식물에서의 상향조절된 유전자의 약 20%는 "방어 반응 관련성"의 것이다. 한편, 상기 카테고리에서 오직 9개의 유전자들만이 동일한 형질전환 식물에서 하향조절되었다. 한편, "생물적 스트레스 반응" 군 및 "식물호르몬 관련" 군에 속하는 유전자들은 각각 전체 상향-조절된 유전자의 11.4% 및 9.4%이다(표 1).

* 야생형 식물체와 비교하여 RECA1 과발현 식물체에서 적어도 2배의 발현량 변화를 나타내는 유전자들 (p-값: ≤ 0.05).

하기 표 2~4는 RECA1 과발현 식물에서 상향조절된 "방어 반응 관련성" 유전자들 중에서도 병원체 감시 수용체(PAMP- 또는 효과기-인식 인자들; Jones and Takemoto 2004 Curr Opin Immun 16: 48-62)를 코딩하는 유전자 또는 박테리아에 대한 방어 반응 또는 전신적인 후천적 내성에 필요한 방어 신호전달 및 하류방향 구성성분을 코딩하는 유전자만을 보여준다. 그러나, 흥미롭게도 표에서 제시된 상향조절된 "방어 반응 관련성" 유전자들은 상류방향 내성(R) 유전자뿐만 아니라 SA 생합성 또는 CS1 유도에 관여되는 PAD4, NDR1, CBP60g, PBS3 및 ICS1과 같은 방어 신호전달 중간체들(Wang et al. 2011 Plant Physiol 156: 1508-1519) 및 그의 하류방향 구성성분 유전자(예를 들어, PR5)(표 2~4)를 포함하는 박테리아 병원체에 대한 식물 방어 신호전달을 광범위하게 포괄한다.

마이크로어레이 결과를 확인하기 위해, 애기장대 내성 반응에 필요한 PAD4, NDR1, PBS3, ICS1 및 PR5과 같은 일부 병원체-유도성 유전자의 RNA 혼성화 및 semi-qRT PCR 분석(Brodersen et al. 2002 Genes Dev 16: 490-502)을 recA1 돌연변이, WT 및 RECA1 과발현 식물(OE#1, OE#4, OE#D)을 이용해 실시했다. 비록 EDS1가 표 2에는 등재되지 않았지만, 이것도 또한 분석했는데, 이는 EDS1가 PAD4와 상호작용하는 것으로 공지되어 있기 때문이다(Feys et al. 2001 EMBO J 20: 5400-5411). 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 전사체의 수준은 전부 RECA1 과발현 계통에서 더 높았고, 이들은 recA1 돌연변이 식물에서는 WT의 것에 비해 더 낮았다. 종합하면, 상기 결과들은 RECA1가 SA 생합성 및 신호전달에 관여되는 것들을 포함하여 박테리아 병원체에 대한 식물 방어와 연계되어 있는 유전자들의 발현에 상당한 영향력을 갖고 있음을 나타낸다.

실시예 4. PR1 발현 및 SA ( salicylic acid )의 축적을 양의 방향으로(positively) 조절하는 RECA1

마이크로어레이, RNA 혼성화 및 semi-qRT PCR 결과는 SA-매개성 방어 반응에서의 엽록체 RECA1의 관여 가능성을 보여줬다. 그러한 가능성을 더 시험하기 위해, SA-의존성 반응에 대한 전형적인 마커인 PR1의 발현을 recA1 돌연변이, WT 및 RECA1 과발현 식물을 이용한 노던 블랏 분석으로 시험했다. RECA1 과발현 계통 #1가 마이크로어레이 분석에 사용된 한편, 타 RECA1 과발현 계통(#4 및 #D)이 결과의 재현성을 시험하기 위한 이들 시험에 사용되었다. 무엇보다도, PR1이 임의의 SA 처리없이 RECA1 과발현 식물에서 유도되었고, recA1 돌연변이에서의 PR1의 발현은 지연되었으며, SA 처리 후 WT에 비해 더 낮았다(도 5). recA1 돌연변이 및 RECA1 과발현 계통에서의 WT과는 차별적인 PR1 전사체의 축적은 엽록체 RECA1가 생물적 스트레스에 노출시 식물에서 SA 수준을 조절할 수 있겠다는 생각을 뒷받침한다. 이러한 점을 시험하기 위해, SA 수준을 recA1 돌연변이, WT 및 RECA1 과발현 식물 사이에서 비교했다. 예상한 바와 같이, SA 수준에서의 현저한 차이가 이들 식물에서 발견되었다. RECA1 과발현 식물은 WT에 비해 현저히 더 높은 수준의 SA를 나타냈고, recA1 돌연변이는 WT에 비해 상당히 더 낮은 SA 함량을 나타냈다(도 6). 이들 결과들은 RECA1가 애기장대에서 PR1 발현뿐만 아니라 내재적인 전체 SA 수준을 조절한다는 것을 나타낸다.

실시예 5. recA1 돌연변이체 및 RECA1 과발현 식물체에서의 토마토반점세균병( Pseudomonas syringae pv . tomato DC3000 )에 대한 병원성 조사

병원체 공격에 의한 식물 방어에 대해 RECA1의 생물학적 유효성을 시험하기 위해, 병원체 접종 및 질병 평가 실험을 WT, recA1 돌연변이 및 RECA1 과발현 식물을 이용해 수행했다. 애기장대 식물을 22℃에서 장일 조건(16시간 명, 8 시간 암 주기) 하에 생장 챔버 내 토양에서 생장시키고, 4 내지 5주령 식물들을 토마토 병원체 세균(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000); Pst DC3000)을 이용한 접종에 이용했다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 질병 징후는 병원체 접종 후 3일째(DAI)에 WT 식물에 비해 recA1 돌연변이 식물에서 현저하게 발생했다. 반면에, RECA1 과발현 식물에서의 질환 징후는 WT에 비해 지연되었다. recA1 돌연변이, WT 및 RECA1 과발현 식물에서 관찰된 차별적인 질환 징후는 집락 형성 단위(CFU) 및 안토시아닌 및 클로로필 함량의 측정에 의해 확인했다. 2 DAI일 때, recA1 돌연변이에서의 Pst DC3000의 생장은 WT보다 약 4.8배 더 높은 수준이었고, RECA1 과발현 식물에서의 병원체 생장은 WT에서보다 약 15.5배 더 낮은 수준이었다(도 8).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 RECA1(Recombinase A 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 RECA1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 병원균에 대한 면역능력을 증진시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 RECA1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 RECA1 유전자의 과발현은 식물의 PAD4(Phytoalexin deficient 4), EDS1(Enhanced disease susceptibility 1), NDR1(Non-race specific disease resistance protein 1), PR1(Pathogenesis-related gene 1), PR5(Pathogenesis-related gene 5), PBS3(GH3.12/avrPphB susceptible 3) 또는 ICS1(Isochorismate synthase 1) 유전자의 발현을 증가시켜 식물의 면역 능력을 증진시키는 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 RECA1(Recombinase A 1) 단백질을을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 RECA1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제4항의 방법에 의해 제조된 병원균에 대한 면역능력이 증진된 형질전환 식물체.
제6항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
제6항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래의 RECA1(Recombinase A 1) 단백질을을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 병원균에 대한 면역능력 증진용 조성물.