KR100792169B1

KR100792169B1 - 전사인자 ＡｔＭＹＢ４４의 유전자 전이를 통한 광엽화, 개화지연 및 환경스트레스 저항성이 강화된 식물체

Info

Publication number: KR100792169B1
Application number: KR1020060006407A
Authority: KR
Inventors: 정종주; 최양도; 정춘균; 구연종; 서준성
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2008-01-07
Also published as: KR20070076918A

Abstract

본 발명은 애기장대에서 분리한 전사인자 AtMYB44의 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 전이함으로써 제조된 형질전환 식물체에 관한 것이다. 상기 전사인자 단백질은 식물호르몬 앱사이식산(abscisic acid; ABA)에 의하여 활성화 되어, 식물의 생장 발달과정을 조절하거나 저수분, 고염, 저온 등 외부 환경스트레스에 대하여 저항성을 부여하는 유전자들의 발현을 유도한다. 그러므로 상기 신규 유전자를 식물체에 도입하여 과다 발현시킴으로써 개화지연 및 광엽화 등 식물의 발달과정이 조절되거나 가뭄, 염해, 냉해 등 각종 환경스트레스에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 얻을 수 있다.

전사인자, 앱사이식산, 식물 생장조절, 광엽화, 개화지연, 환경스트레스 저항성 식물

Description

전사인자 ＡｔＭＹＢ４４의 유전자 전이를 통한 광엽화, 개화지연 및 환경스트레스 저항성이 강화된 식물체{Plants enhanced by the development of wide-leafed, late-flowering and environmental stress-resistant by transforming the transcription factor gene AtMYB44}

도 1 은 애기장대 전사인자 AtMYB44 단백질의 1차원 구조를 아미노산 서열에 따라 유추된 기능별 부위 (functional domains)를 나타낸 것이고,

도 2 는 JA 및 ABA 처리, 염분, 포도당 등에 의해 AtMYB44 유전자의 발현이 유도되고 있음을 나타내는 노던 블럿 실험의 결과이며,

도 3 의 위 그림은 애기장대 AtMYB44 유전자를 식물 형질전환용 발현벡터 pBI111L(pBl121에서 GUS를 제거한 벡터)에 재조합한 pCaAtMYB44 DNA의 구조(P_35S : 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터)를 나타낸 것이고, 아래 그림은 형질전환 후 가나마이신 저항성을 보이는 22개 라인을 선발하여 노던 블럿 실험으로 AtMYB44의 과발현을 확인한 결과이며,

도 4 는 형질전환된 애기장대에 AtMYB44 유전자가 올바르게 삽입되었는지 여부를 확인하기 위하여 게놈 서던 블럿을 실시한 결과이고,

레인 Col-0 : 야생형 애기장대

레인 #10, 14, 17, 18, 21 : 형질전환 애기장대

NPTII : 가나마이신 저항성 유전자를 탐침으로 사용한 경우

AtMYB44 : AtMYB44 유전자 부위를 탐침으로 사용한 경우

도 5 는 형질전환된 애기장대가 성장 및 개화 등의 발달과정이 변화되었음을 나타내는 사진이며,

Col-0, WT : 야생형 애기장대

#17, 18, 21 : 형질전환 애기장대 (35S::AtMYB44)

Atmyb44 : AtMYB44 불활성체

도 6 은 형질전환 및 비형질전환 애기장대에 수분공급을 중단하고 7일 후 식물체의 저수분 스트레스에 대한 저항성을 조사한 결과를 보여주는 사진이며,

WT : 야생형 애기장대

#17, 18, 21 : 형질전환 애기장대 (35S::AtMYB44)

Atmyb44 : AtMYB44 불활성체

도 7 은 형질전환 및 비형질전환 애기장대에 100 mM NaCl의 염분을 공급한 3일 후 다시 200 mM NaCl의 염분을 공급하고 4일 후 식물체의 염해에 대한 저항성을 조사한 결과를 보여주는 사진이며,

WT : 야생형 애기장대

#17, 18, 21 : 형질전환 애기장대 (35S::AtMYB44)

Atmyb44 : AtMYB44 불활성체

도 8 은 형질전환 및 비형질전환 애기장대를 영하 5°C에서 24 시간 방치한 후 4°C의 저온실로 옮겨 다시 24시간 방치하였다. 이후 22°C 온실로 다시 옮겨 5 일간 성장시킨 후 식물체의 냉해에 대한 저항성을 조사한 결과를 보여주는 사진이다.

WT : 야생형 애기장대

#18, 21 : 형질전환 애기장대 (35S::AtMYB44)

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 분리한 전사인자 AtMYB44 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 전이하여 제조한 형질전환 식물체(transgenic plant)에 관한 것이다. 보다 상세하게는 환경저항성 식물호르몬 앱사이식산(abscisic acid; ABA)에 의하여 활성화 되는 AtMYB44 전사인자의 유전자를 식물체에 도입하여 과다 발현시킴으로써 개화지연 및 광엽화 등 식물의 발달과정이 조절되거나, 가뭄, 염해, 냉해 등 각종 환경스트레스에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

ABA는 다양한 식물에 널리 존재하는 생장조절물질로서, 종자 및 식물체의 다양한 발달과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한 ABA는 저수분, 고염분, 저온 등의 조건 하에서 식물이 저항성 반응을 갖도록 관련 유전자를 활성화 시키는데 필 요한 세포생리를 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Xiong et al., Plant Cell 2000:S165-S183). 따라서 ABA는 가뭄, 염해, 냉해 등 다양한 환경스트레스에 대한 저항성 반응을 매개하는 식물호르몬으로 인식되고 있다.

식물이 가뭄, 냉해, 염해 등 환경스트레스를 받게 되면, ABA가 대량으로 생합성 되어 체내에 집적된다. ABA는 관련된 전사인자들을 활성화하고, 이 활성화된 전사인자들이 각 유전자의 프로모터 부위에 결합함으로써 발현이 유도된다. ABA의 작용으로 발현이 유도되는 유전자들 중에는 다양한 환경스트레스에 대한 반응 또는 저항성 유전자들이 포함된다. 환경스트레스 관련 유전자들의 대표적인 예로서, RD29A , RD22 , COR47, KIN1 등이 알려져 있다(Shinozaki et al., Curr. Opin. Plant Biol. 2003, 6:410-417).

유전자 프로모터 상의 환경스트레스 관련 전사인자 결합 부위로서 ABA반응 요소(ABA-responsive element, ABRE)와 탈수반응 요소(dehydration-responsive element, DRE/CRT) 등이 알려져 있으며, 여기에 결합하는 전사인자들로서 ABF/AREB, DREB/CBF 군(family) 등으로 표기되는 많은 전사인자들이 알려져 있다. ABF/AREB 전사인자들은 분자구조 상 염기성 루이신 지퍼(basic leucine zipper, bZIP) 전사인자 군에 속하고, DREB/CBF 전사인자들은 EREBP/AP2 군에 속한다. 그러나 RD22 등 일부 환경스트레스 저항성 유전자들은 그 프로모터에 DRE/CRT 요소가 없고, 대신 MYC 전사인자 RD22BP1과 MYB 전사인자 AtMYB2가 결합하여 상승적으로 전사를 촉진하는 것으로 알려졌다(Shinozaki et al., Curr. Opin. Plant Biol. 2003, 6:410-417). 이밖에도 징크 핑거(Zn finger), ABI3/VP1 군 등 많은 종류의 전사인자가 ABA가 유도하는 환경스트레스 저항성 유전자의 발현에 관여하는 것으로 알려져 있다.

저온 및 가뭄 등 환경스트레스에 저항성 반응을 주도하는 유전자들의 발현을 강화할 목적으로, 위에 서술한 전사인자들을 작물에 전이하여 저항성을 강화하고자 하는 유전공학적 연구가 많이 진행되어 왔다. 일반적으로 연구모델 식물인 애기장대에서 환경스트레스 반응 전사인자의 유전자를 탐색한 후, 이 유전자를 직접 또는 다른 작물에서 같은 기능을 하는 유전자(orthologs)를 찾아 다양한 작물에서 과발현 시킨 예가 많다. 대부분 가뭄 및 냉해 등 환경스트레스에 대한 저항성을 증진시키는데 성공적이었다. 예를 들어 CBF/DREB1 전사인자를 과발현하는 식물체들이 냉해, 염해 및 가뭄 등에 대한 향상된 저항성을 보였다. 애기장대의 CBF 유전자를 유채에 넣어 냉해 및 가뭄에 대한 저항성을 향상시킨 예도 보고되었다(Zhang et al., Plant Physiol. 2004, 135: 615-621). CBF의 이종간동일유전자 (ortholog)인 벼 OsDREB1의 유전자를 과발현하는 애기장대도 냉해, 염해 및 가뭄 등에 대한 향상된 저항성을 보였다. 그러나 형질전환된 작물에 있어, 저항성이 크게 증진되지 않거나, 변색, 생장장애 등의 문제점이 관찰되었다(Liu et al., Plant Cell 1998, 10: 1391-1406).

이에 본 발명자들은 ABA가 애기장대의 유전자 발현에 미치는 영향을 연구하던 중, 이 식물호르몬에 의하여 신속히 발현되는 AtMYB44 유전자를 탐색하고 이 유전자로부터 생산되는 AtMYB44 단백질의 특성을 규명하였으며, 상기 유전자를 전이하여 과발현시킨 형질전환 식물체가 광엽화 및 개화지연 등 발달과정의 조절 가능 성을 보였으며, 저수분, 고염, 저온 등에 대한 저항성에 관련하는 다수의 유전자 발현을 촉진하여 결과적으로 가뭄, 냉해, 염해 등 다양한 환경스트레스에 대해 뚜렷이 향상된 저항성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 식물호르몬 앱사이식산(abscisic acid; ABA)에 의하여 활성화되는 AtMYB44가 식물의 생장 발달과정을 조절하거나 저수분, 고염, 저온 등 외부 환경스트레스에 대하여 저항성을 부여하는 유전자들의 발현을 유도하는 기능을 한다는 사실을 발견하고, 애기장대에서 분리한 전사인자 AtMYB44의 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 식물체에 도입하여 과다 발현시킴으로써 개화지연 및 광엽화 등 식물의 발달과정을 조절하거나 가뭄, 염해, 냉해 등 각종 환경스트레스에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 벡터 pCaAtMYB44를 이용하여 애기장대 유래의 스트레스 저항성과 발달과정에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자인 AtMYB44가 과발현되어 개화지연 및 광엽 발달과정을 조절하고, 식물체의 환경스트레스, 가뭄, 염해, 냉해에 대한 저항성이 증가된 특징을 갖는 조직배양에 의해 무성번식되는 형질전환 채소작물류를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 채소작물류는 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 조직배양에 의해 무성번식되는 형질전환 채소작물류를 제공하는 것이다.

삭제

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 애기장대 유래의 스트레스 저항성과 발달과정에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자 AtMYB44를 암호화하는 DNA 및 AtMYB44 단백질, AtMYB44 유전자를 pBI111L에 재조합하여 작성한 식물 유전자 발현용 바이너리 벡터 pCaAtMYB44, 벡터 pCaAtMYB44로 형질전환시켜서 AtMYB44가 과발현되는 형질전환식물체의 제조방법, AtMYB44가 과발현되어 개화지연 및 광엽 발달과정을 조절하고, 식물체의 환경스트레스, 가뭄, 염해, 냉해에 대한 저항성이 증가된 특성을 갖는 형질전환 식물체를 특징으로 한다.

본 발명은 벡터 pCaAtMYB44를 이용하여 애기장대 유래의 스트레스 저항성과 발달과정에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자인 AtMYB44가 과발현되어 개화지연 및 광엽 발달과정을 조절하고, 식물체의 환경스트레스, 가뭄, 염해, 냉해에 대한 저항성이 증가된 특징을 갖는 조직배양에 의해 무성번식되는 형질전환 채소작물류를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 식물의 애기장대 유래의 스트레스 저항성과 발달과정에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자인 AtMYB44가 과발현되어 개화지연 및 광엽 발달과정을 조절하고, 식물체의 환경스트레스, 가뭄, 염해, 냉해에 대한 저항성이 증가된 특징을 갖는 식물체로는 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류가 포함한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

1) 애기장대에서 분리한 AtMYB44 유전자 cDNA를 식물 형질전환용 발현벡터에 재조합하고 이를 식물에 전이함으로써,

2) 식물체의 전체에서 AtMYB44 단백질을 과다 생산하는 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한 것이다.

3) 이를 통해 개화지연 및 광엽화 발달과정을 조절하고, 식물체의 환경스트레스 즉, 가뭄, 염해, 냉해에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공한 것이다.

4) 또한 본 발명은 상기 식물 형질전환 방법을 이용하여 생산된 형질전환 식물체를 제공한 것이다.

본 발명에서 “전사인자”는 유전자의 프로모터 부위에 작용하여 그 유전자가 mRNA로 전사 되도록 하는 단백질을 의미하는 일반 명칭으로 사용된다. 또한 “AtMYB44”는 상기 “전사인자”의 하나로서 애기장대에 존재하는 단백질을 나타내며, 상기 효소 단백질을 암호화하는 유전자는 “AtMYB44 유전자”로 표시하였다.

이하 본 발명을 식물체 중 애기장대를 예로 들어 상세히 설명한다.

먼저 다양한 식물호르몬에 대한 AtMYB44 유전자의 발현 활성화 양상을 관찰 하였는데, 이 유전자는 주로 ABA, 자스몬산, 그리고 에틸렌 등을 처리하였을 때 발현되었다(도 2). 따라서 이 유전자의 발현은 다양한 외부 스트레스에 대한 반응 또는 발달과정을 조절하는 호르몬 농도 변화에 매우 민감하게 반응하는 것으로 판단되었다. 특히 ABA 및 자스몬산을 처리하여 시간 별로 분석한 결과 30분 이내에 높은 mRNA 집적량을 나타내었다. 따라서 AtMYB44는 ABA 및 자스몬산에 대한 초기반응 유전자로서 발현반응성이 매우 높다는 사실을 알 수 있었다.

ABA는 가뭄, 염해, 냉해 등 환경스트레스에 대하여 식물에 저항성 반응을 유도하는 생장조절 물질이며, 자스몬산은 병원균 및 해충에 대한 저항성 반응을 유도하는 생장조절 물질로 잘 알려져 있다(Finkelstein et al., Plant Cell. 2002: S15-S45). 자스몬산은 이에 더하여 발아, 성장, 개화, 결실 등 식물의 발달 및 생식 과정에 관여하는 역할을 한다(Creelman and Mullet et al., Annu. Rev, Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997, 48:355-381). 그러므로 AtMYB44는 다양한 환경스트레스에 대한 저항성과 발달과정에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자의 역할을 할 것으로 추론하였다.

AtMYB44 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대를 만들기 위하여, 유전자의 항시발현을 유도하는 CaMV35S 프로모터에 AtMYB44 유전자를 융합하였다(도 3). 이 AtMYB44 발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 C58C1( Agrobacterium tumefaciens C58C1)에 전이하고, 전이 DNA를 집적(integration)하고 있는 것으로 선별된 아그로박테리움을 애기장대에 감염시켰다. 항생제 저항성 식물체 선발 실험과 노던 블롯 (Northern blot)분석 결과를 기준으로 AtMYB44 유전자를 항시 과발현 하고 있는 것으로 확인된 형질전환 식물체를 확보하였다. 선발된 식물체의 DNA를 추출하여 목적유전자가 올바르게 삽입되어 있는지를 확인하고 삽입 개수(copy number)를 측정하였다(도 4).

AtMYB44 과발현체는 야생형(wild type) 대조구에 비해 성장 초기에는 전체적으로 왜소증을 보였으며, 개화시기가 10일 정도 느렸다(도 5). 야생형이 개화할 때까지는 과발현체의 크기가 매우 작지만 개화 이후에는 과발현체의 영양생장이 매우 활발하여 식물크기가 야생형보다 더 커지고 개화가 늦어지는 것을 관찰하였다. 그리고 잎이 옆으로 확대되는 광엽화 현상이 관찰되었다.

ABA는 한발, 염분 및 냉해에 대하여 식물체에 저항성을 부여하는 생장조절 물질로 알려져 있으므로 AtMYB44 과발현체의 환경스트레스 저항성을 조사하였다.

한발 저항성 실험에서는 야생형 대조구, AtMYB44 과발현 애기장대, 그리고 불활성화 변이체를 함께 4 주간 성장시킨 후, 수분공급을 중단하고 7 일 후 생장상태를 관찰하였다. 결과 야생형대조구에 비해 과발현체는 한발에 대한 저항성이 뚜렷하게 향상되었음을 보였으며 반대로 불활성체는 저항성이 증진되지 않았다(도 6).

내염성 실험에서는 토양에 수분을 공급하면서 NaCl의 농도를 4일 간 100 mM, 3일간 200 mM로 유지하도록 하였다. 그 결과 야생형대조구에 비해 과발현체는 향상된 저항성을 보였으며 반대로 불활성체는 저항성이 증진되지 않았다(도 7).

내냉성 실험에서는 식물체를 영하 5°C에서 24 시간 방치한 후 4°C의 저온실로 옮겨 다시 24시간 방치하였다. 이후 22°C 온실로 다시 옮겨 5 일간 성장시켰 다. 그 결과 야생형대조구에 비해 과발현체는 냉온 처리에 대한 저항성이 크게 향상되어 있음을 관찰하였다. 이에 반하여 불활성체(knockout)는 저항성이 증진되지 않았다(도 8).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 애기장대 AtMYB44 유전자의 분자생물학적 특성 연구

본 발명에 이용한 유전자인 AtMYB44를 탐색하고 이의 분자생물학적 기능을 연구한 경위를 상세히 설명한다.

AtMYB44 유전자는 나타낸 바와 같이 918개의 염기로 구성되어 있으며, 이 유전자가 암호화하는 AtMYB44 전사인자는 305개의 아미노산 서열을 가지며, 분자량은 33.3 kDa이다 (서열목록1,2).

AtMYB44 전사인자는 R2R3-MYB 과(family) 중 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix, HLH) 상과(superfamily)로 분류할 수 있다. AtMYB44 단백질의 아미노산 염기서열을 상세히 분석하여 보면, 아미노(N) 말단에 R2 및 R3로 명명된 DNA 결합부위가 있고 카복시(C) 말단에는 이 상과(superfamily) 전사인자들에 보존되어 있는 아미노산 서열들 (TGLYMSPGSP과 GEFMAVVQEMIKAEVRSYM), 그리고 ATP/GTP-바인딩 사이트 모티브 A(binding site motif A)인 P-루프(P-loop)가 존재한다(도 1). 이 상과(superfamily)에 속하는 전사인자들은 식물에서 다양한 작용을 하는데 특히 이차대사의 조절, 세포형태 형성의 조절, 환경스트레스의 신호전달 과정, 세포주기(cell cycle) 조절, 그리고 TMV와 보트리티스(Botrytis)같은 병원균에 대한 병 저항성반응에 관여하는 것으로 보고된 바 있다.

정보 검색을 통하여 AtMYB44 프로모터 염기서열 상의 시스-액팅 엘리먼트(cis-acting element)를 분석하여 본 결과, ABA, 한발, 자스몬산, 에틸렌, 살리실산 및 상처 등에 반응하는 다수의 요소(element)들이 존재하는 것으로 나타났다. 이에 따라 다양한 식물호르몬에 대한 AtMYB44 유전자의 발현 활성화 양상을 노던 블롯 분석을 통해 관찰하였는데, 이 유전자는 주로 ABA, 자스몬산, 그리고 에틸렌 등을 처리하였을 때 발현되었다(도 2). 그리고 옥신, 지베렐린, 사이토키닌 및 브라시노스테로이드를 처리한 경우에도 발현이 다소 증가하였다. 그러나 시험한 식물호르몬 중 살리신산에 의해서는 그 발현이 유도되지 않았다. 따라서 이 유전자의 발현은 다양한 외부 스트레스 호르몬 또는 발달과정 호르몬 농도 변화에 매우 민감하게 반응하는 것으로 판단되었다.

특히 외부에서 100 μM ABA를 처리하여 시간 별로 분석한 결과 30분 이내에 높은 mRNA 집적량을 나타내었고 2시간 후에는 급격한 감소를 보였다(도 2). 그리고 같은 농도의 자스몬산에 의해서도 처리 후 10분 이내에 그 발현이 유도되어 30분 후 시점에서 발현이 최고점에 이르며 이 후 점차 감소되었다. 따라서 AtMYB44는 ABA 및 자스몬산에 대한 초기반응 유전자로서 발현반응성이 매우 높다는 사실을 알 수 있었다.

ABA는 가뭄, 염해, 냉해 등 환경스트레스에 대하여 식물에 저항성 반응을 유도하는 생장조절 물질이며, 자스몬산은 병원균 및 해충에 대한 저항성 반응을 유도하는 생장조절 물질로 잘 알려져 있다. 자스몬산은 이에 더하여 발아, 성장, 개화, 결실 등 식물의 발달 및 생식 과정에 관여하는 역할은 한다. ABA와 자스몬산은 상호 역행작용(anatagonistic interaction)이 있음이 잘 알려져 있다. 또한 자스몬산은 상기한 식물반응에서 에틸렌과는 상호 상승작용(synergistic interaction)이 있다는 사실도 잘 증명되어 있다. 그러므로 AtMYB44는 다양한 환경스트레스에 대한 저항성과 발달과정에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자의 역할을 할 것으로 추측할 수 있다.

미국 국립생물정보센터(National Center for Biological Information; NCBI)에서 제공하는 데이터베이스(database)인 BLAST 프로그램을 이용하여 분석한 결과, AtMYB44의 아미노산 서열이 당류(sugar)에 민감하게 반응하는 감자의 MYB 전사인자 하나와 매우 높은 유사성을 보였다. 이에 따라 애기장대에 다양한 당류를 처리하여 AtMYB44 유전자의 발현 양상을 살펴보았다(도 2). AtMYB44 유전자는 6% 수크로즈(sucrose) 처리 시 30분부터 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 200 mM의 글루코오즈(glucose), 프락토즈(fructose), 만노즈(mannose) 및 갈락토오즈(galactose)에도 그 발현이 유도되는 것을 관찰하였다. 그리고 염분(200 mM NaCl)에 의해서도 발현량이 증가하였다. 따라서 이 유전자는 당류에 의한 삼투압이나 염분에 의한 세포 외 스트레스에 대한 반응에 관여할 것으로 추측되었다.

<실시예 2> AtMYB44 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환 실험

AtMYB44 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대를 만들기 위하여, 유전자의 항시발현을 유도하는 CaMV35S 프로모터에 AtMYB44 유전자를 융합하였다(도 3). 이 벡터에는 항생제 가나마이신에 대한 저항성 유전자 NPTII가 포함되어 있어 성공적으로 유전자가 전이된 미생물을 선별하는데 이용할 수 있도록 되어 있다. 또한 식물 유전체에 삽입되는 T-DNA 부분의 경계를 나타내는 유전자 염기서열인 LB와 RB 사이에 항생제 가나마이신에 대한 저항성을 부여할 수 있는 NPTII 유전자가 함께 삽입되어 있다. 이 DNA 구조물의 이름을 pCaAtMYB44로 명명하였다. pCaAtMYB44의 구조는 도 3과 같다.

이 DNA 구조물을 아그로박테리움 투메파시엔스 C58C1( Agrobacterium tumefaciens C58C1)에 전이하고, 가나마이신, 리팜피신, 젠타마이신이 함유된 배지에서 아그로박테리움(Agrobacterium)을 선발하였다. 꽃대침지법(floral dip transformation)에 따라, 이 균주 배양액에 애기장대의 꽃대를 3분간 담근 후 거의 100% 상대습도 상태의 밀폐된 용기에 비스듬하게 뉘여서 24시간 동안 생장상에서 키운 후 개봉하여 식물을 세워서 키웠다. 이들 식물체에서 얻은 종자를 가나마이신이 함유된 배지에서 발아시켜, 총 22개의 가나마이신 저항성 식물체를 선발하였으며, 이로부터 종자를 받아 가나마이신 배지에서 발아 선별한 후 저항성 형질전환체를 토양에 이식하여 제 2 세대 종자를 얻었다. 이를 다시 선별하여 카나마이신 감수성 개체가 나오지 않는 제 2 세대 종자를 대상으로 실험을 하였다. 먼저 AtMYB44 유전자 DNA를 탐침으로 하여 노던 블롯 분석을 시행한 결과 이 유전자를 항시 과발 현하고 있는 것으로 확인된 6 개체를 확보하였다 (도 3).

이들 형질전환 애기장대에 삽입된 목적유전자의 개수와 위치다양성을 확인하기 위해 게놈 서던 블롯 분석을 실시하였다(도 4). 그 결과, 비형질전환체에서는 약 15 - 20 kbp 길이 정도의 원래 애기장대에 존재하던 1 개의 유전자가 확인되었으며, 그 결과로서, 10번, 21번 라인은 한 개, 14번, 17번 라인은 2 개, 18번 라인은 3 개의 T-DNA가 식물 염색체 DNA에 삽입되었고 각 라인 별로 삽입위치가 서로 다름을 확인하였다.

한편으로, AtMYB44 유전자에 대한 발현 불활성화(knockout) 변이 애기장대(SALK_039074)를 미국 SALK 연구소(미국 San Diego)가 제작하여 보유하고 있음을 확인하고 이의 종자를 동 연구소로부터 획득하였다. 이 불활성화(knockout) 라인의 AtMYB44 유전자 상에는 R3 DNA 결합부위(R3 DNA binding domain)에 T-DNA가 삽입된 것으로 분석되었다. 이 불활성화 변이체는 외관 및 성장에 있어 야생형과 크게 다른 성질을 보이지 않았다.

<실시예 3> AtMYB44 유전자 발현량 변화에 따른 형질전환 애기장대의 표현형 관찰

AtMYB44 과발현체는 야생형대조구에 비해 전체적으로 왜소증을 보였다. 그리고 과발현체는 야생형에 비해 개화시기가 10일 정도 느렸다(도 5). 야생형대조구에 비하여 개화 이전에는 과발현체의 크기가 매우 작지만 개화 이후에는 과발현체의 영양생장이 매우 활발하여 식물크기가 야생형보다 더 커지고 개화가 늦어지는 것이 관찰되었다.

<실시예 4> AtMYB44 유전자 발현량 변화에 따른 형질전환 애기장대의 환경스트레스 저항성 실험

이상 서술한 바와 같이 AtMYB44의 발현이 ABA 및 염분 처리에 의해 유도된다는 사실과 이 유전자를 과발현하는 식물체의 개화가 늦어진다는 점으로 미루어 볼 때, AtMYB44는 ABA에 의존하여 (ABA-dependent) 작용이 활성화되는 전사인자임을 알 수 있었다. ABA는 한발, 염분 및 냉해에 대하여 식물체에 저항성을 부여하는 생장조절 물질로 알려져 있으므로 AtMYB44 과발현체의 환경스트레스 저항성을 조사하였다.

한발 저항성 실험에서는 야생형대조구, AtMYB44 과발현 애기장대, 그리고 불활성화 변이체를 함께 4 주간 성장시킨 후, 수분공급을 중단하고 7 일 후 생장상태를 관찰하였다. 결과 야생형대조구에 비해 과발현체는 한발에 대한 저항성이 뚜렷하게 향상되었음을 보였으며 반대로 불활성체는 저항성이 증진되지 않았다(도 6).

내냉성 실험에서는 식물체를 영하 5°C에서 24 시간 방치한 후 4°C의 저온실로 옮겨 다시 24 시간 방치하였다. 이후 22°C 온실로 다시 옮겨 5 일간 성장시켰다. 그 결과 야생형대조구에 비해 과발현체는 냉온 처리에 대한 저항성이 크게 향상되어 있음을 관찰하였다. 이에 반하여 불활성체(knockout)는 저항성이 증진되 지 않았다(도 8).

이상의 실시 예를 통하여 명백하게 나타난 바와 같이, 본 발명의 애기장대 AtMYB44 단백질은 다른 유전자의 발현을 조절하는 전사인자로서, 이의 유전자를 포함하는 식물형질전환용 발현벡터에 조합하여 전이함으로써 일반적인 성장 특성에는 영향을 미치지 않으면서 효과적으로 식물체의 개화시기를 조절할 수 있는 식물체를 얻을 수 있다. 아울러 저온, 수분 부족, 높은 염도 등 각종 스트레스에 대한 저항성이 높은 식물체를 얻을 수 있다. 따라서 경제 작물 등의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명을 통해 이 전사인자에 의해 발현이 조절되는 식물 저항성 메카니즘을 밝힘으로써 새로운 환경스트레스 저항성 유전자 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다.

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벡터 pCaAtMYB44를 이용하여 애기장대 유래의 스트레스 저항성과 발달과정에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자인 AtMYB44가 과발현되어 개화지연 및 광엽 발달과정을 조절하고, 식물체의 환경스트레스, 가뭄, 염해, 냉해에 대한 저항성이 증가된 특징을 갖는 조직배양에 의해 무성번식되는 형질전환 채소작물류.
제5항에 있어서, 상기 채소작물류는 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 조직배양에 의해 무성번식되는 형질전환 채소작물류.