KR101354035B1

KR101354035B1 - 식물체의 한발 스트레스 저항성을 증가시키는 ＯｓｂＨＬＨ148 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101354035B1
Application number: KR1020110030378A
Authority: KR
Inventors: 서주석; 정종주; 송상익; 최양도; 이종섭; 김주곤
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2014-01-23
Also published as: KR20120111715A

Abstract

본 발명은 벼에서 분리한 전사인자 OsbHLH148 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 전이함으로써 제조된 형질전환 식물체에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 벼 유래의 전사인자 OsbHLH148(Oryza sativa basic helix-loop-helix 148) 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 이용한 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법, 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

식물체의 한발 스트레스 저항성을 증가시키는 ＯｓｂＨＬＨ148 유전자 및 이의 용도{OsbHLH148 gene enhancing drought stress tolerance of plant and uses thereof}

본 발명은 벼(rice, Oryza sativa)에서 분리한 전사인자 OsbHLH148 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 전이하여 제조한 형질전환 식물체(transgenic plant)에 관한 것이다. 보다 상세하게는 환경저항성 식물호르몬 앱사이식산(abscisic acid; ABA)에 의하여 활성화되는 OsbHLH148 전사인자의 유전자를 식물체에 도입하여 과다 발현시킴으로써 한발(가뭄, 저수분, drought) 등 각종 환경 스트레스에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

bHLH (basic/helix-loop-helix) 단백질들은 DNA 프로모터에 결합하여 해당 유전자(gene)의 발현을 유도하는 일군의 전사인자(transcription factor)이다. 벼 유전체(genome)에서 167개의 bHLH 유전자들이 발견되었다(Li et al., Plant Physiol. 2006, 141:1167-1184).

ABA는 다양한 식물에 널리 존재하는 생장조절물질로서, 한발, 고염분, 저온 등의 조건 하에서 식물이 저항성 반응을 갖도록 관련 유전자의 발현을 활성화 시키는 역할을 한다(Xiong et al., Plant Cell 2000:S165-S183). 식물이 한발, 냉해, 염해 등 환경 스트레스를 받게 되면, ABA가 대량으로 생합성 되어 체내에 집적된다. ABA는 관련된 전사인자들을 활성화하고, 이 활성화된 전사인자들이 저항성 유전자의 프로모터 부위에 결합함으로써 그 발현을 유도한다.

한발 등 환경 스트레스에 저항성 반응을 주도하는 유전자들의 발현을 강화할 목적으로, ABA 관련 전사인자들을 작물에 전이하여 저항성을 강화하고자 하는 유전공학적 연구가 많이 진행되어 왔다. 예를 들어, CBF/DREB1 전사인자를 과발현하는 식물체들이 냉해, 염해 및 한발 등에 대한 향상된 저항성을 보였다. 애기장대의 CBF 유전자를 유채에 넣어 냉해 및 한발에 대한 저항성을 향상시킨 예도 보고되었다(Zhang et al., Plant Physiol. 2004, 135: 615-621). CBF의 이종간 동일유전자 (ortholog)인 벼 OsDREB1의 유전자를 과발현하는 애기장대도 냉해, 염해 및 한발 등에 대한 향상된 저항성을 보였다. 최근에는 애기장대 전사인자 유전자 AtMYB44를 전이함으로서 냉해, 염해 및 한발 등 각종 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상되는 것이 보고되었다(Jung et al., Plant Physiol. 2008, 146: 623-635). 그러나 형질전환된 작물에 있어, 저항성이 크게 증진되지 않거나, 변색, 생장장애 등의 문제점이 관찰되었다(Liu et al., Plant Cell 1998, 10: 1391-1406).

한국특허등록 제10-0742193호에는 신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자 및 이를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0571131호에는 식물의 전사인자를 코딩하는 유전자가 개시되어 있으나, 본 발명의 전사인자와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 ABA가 벼의 유전자 발현에 미치는 영향을 연구하던 중, 이 식물호르몬에 의하여 발현되는 OsbHLH148 유전자를 탐색하고, 상기 유전자를 전이하여 과발현시킨 형질전환 식물체가 생장발육에는 문제가 없이 한발 등 환경 스트레스에 대해 뚜렷이 향상된 저항성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 전사인자 OsbHLH148(Oryza sativa basic helix-loop-helix 148) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용한 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 벼 OsbHLH148 단백질은 다른 유전자의 발현을 조절하는 전사인자로서, 이의 유전자를 포함하는 식물형질전환용 발현벡터에 조합하여 전이함으로써 일반적인 성장 특성에는 영향을 미치지 않으면서 효과적으로 한발 등 각종 스트레스에 대한 저항성이 높은 식물체를 얻을 수 있다. 따라서, 경제작물 등의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명을 통해 이 전사인자에 의해 발현이 조절되는 식물 저항성 메카니즘을 밝힘으로써 새로운 환경 스트레스 저항성 유전자 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 OsbHLH148 유전자가 벼에서 환경 스트레스 저항성 호르몬 ABA에 의하여 발현이 유도되고 있음을 나타내는 노던 블럿 실험의 결과이다.
도 2는 벼 OsbHLH148 유전자를 식물 형질전환용 발현벡터 pBI111L (pBl121에서 GUS를 제거한 벡터)에 재조합한 DNA의 구조(P_35S : 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터)를 나타낸 것이다.
도 3은 상기 재조합 pCaOsbHLH148 DNA를 애기장대에 전이한 후 가나마이신 저항성을 보이는 9개 라인을 선발하여 노던 블럿 실험으로 OsbHLH148의 상시발현을 확인한 결과이다.
도 4는 형질전환된 애기장대에 OsbHLH148 유전자가 올바르게 삽입되었는지 여부를 확인하기 위하여 OsbHLH148 유전자 부위를 탐침으로 사용한 게놈 서던 블럿을 실시한 결과이다.
레인 WT : 야생형 애기장대 (Col-0)
레인 #2~#7, #9 : 형질전환 애기장대 라인
도 5는 OsbHLH148 유전자를 과발현하는 형질전환된 애기장대의 ABA 감수성(sensitivity)을 측정하기 위하여 3 μM ABA를 함유한 배지에서 배양한 결과이다.
WT : 야생형 애기장대
T-3, T-5 : 형질전환 애기장대 (35S:: OsbHLH148)
도 6은 형질전환 및 비형질전환 애기장대의 잎을 자연건조하면서 관찰한 결과로서, 위(A) 그림은 수분유출에 따른 무게변화를 측정한 것으로서 형질전환 식물체의 보습성이 향상되었음을 나타내는 그림이며, 아래(B)는 이 상태에서 120분 경과 후의 식물 상태를 보이는 사진이다.
WT : 야생형 애기장대
T-3, T-5 : 형질전환 애기장대 (35S:: OsbHLH148)
도 7은 4주 성장한 형질전환 및 비형질전환 애기장대에 수분공급을 중단하고 7일 후 식물체의 저수분 스트레스에 대한 저항성을 조사한 결과를 보여주는 사진이다.
WT : 야생형 애기장대
T-3, T-5 : 형질전환 애기장대 (35S:: OsbHLH148)
도 8은 OsbHLH148 유전자로 형질전환된 벼에 대한 genomic 서던 블럿 분석 결과(상단) 및 벼 형질전환용 재조합 벡터(하단)이다.
도 9는 OsbHLH148 유전자로 형질전환된 벼에 대한 노던 블럿 분석 결과이다.
레인 WT : 야생형 벼
레인 1~2, 6~11 : 형질전환 벼 라인
도 10은 환경 스트레스 처리 시간에 따른 OsbHLH148 유전자의 발현 결과이다.
도 11은 OsbHLH148 유전자로 형질전환된 벼에 대한 한발 저항성 실험 결과이다.
WT : 야생형 벼
T-2, T-9, T-11 : 형질전환 벼 라인
도 12는 OsbHLH148 유전자로 형질전환된 벼에 대한 Fv/Fm 값 측정 결과이다.
WT : 야생형 벼
T-2, T-9, T-11 : 형질전환 벼 라인

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 전사인자 OsbHLH148(Oryza sativa basic helix-loop-helix 148) 단백질을 제공한다.

본 발명에서 "전사인자"는 유전자의 프로모터 부위에 작용하여 그 유전자가 mRNA로 전사되도록 하는 단백질을 의미하는 일반 명칭으로 사용된다. 또한 "OsbHLH148"은 상기 "전사인자"의 하나로서 벼에 존재하는 단백질을 나타내며, 상기 효소 단백질을 암호화하는 유전자는 "OsbHLH148 유전자"로 표시하였다.

본 발명에 따른 OsbHLH148 단백질의 범위는 벼(Oryza sativa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 OsbHLH148 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 OsbHLH148 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 OsbHLH148 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 도 2에 기재된 pCaOsbHLH148 벡터 또는 도 8에 기재된 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 OsbHLH148 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환되어 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 환경 스트레스는 한발, 염해 또는 냉해 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 한발 스트레스이다. 상기 형질전환 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.

본 발명은 또한, 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체로부터 얻은 종자를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 OsbHLH148 유전자를 포함하는, 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 OsbHLH148 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 벼 유래의 OsbHLH148 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 벼 OsbHLH148 유전자의 분자생물학적 특성 연구

본 발명에 이용한 벼 유전자인 OsbHLH148를 탐색하고 이의 분자생물학적 기능을 연구한 경위를 상세히 설명한다.

OsbHLH148 cDNA는 야생형 벼(품종: 낙동)에서 중합효소반응(PCR, polymerase chain reaction)을 시행하여 증폭함으로 획득하였다. 벼에 200 μM ABA 또는 100 μM 메칠자스모네이트 (methyl jasmonate, MeJA)를 분무하여 1 시간 처리한 후, 총 RNA를 페놀/SDS/LiCl 방법(Carpenter and Simon, 1998, Methods Mol. Biol. 82, 85-89)으로 추출하였다. 이 RNA 시료를 Invitrogen사에서 구입한 역전사효소(reverse transcriptase) SuperscriptIII와 18 염기쌍(base pair)의 oligo d(T)를 이용하여 반응시킴으로써 cDNA를 얻었다. cDNA의 양을 증폭할 목적으로 정방향 프라이머로서 5'-ATGCAAATGGAGTCG-3'(서열번호 3), 역방향 프라이머로서 5'-TCAAAACACATTTTG-3'(서열번호 4)를 사용하고, Promega사의 pfu DNA 중합효소(polymerase)를 이용하여 PCR 증폭반응을 수행하였다.

증폭된 cDNA를 젤에서 추출하여 Enzynomics사의 pTOP blunt V2 벡터에 blunt end 라이게이션하여 서브클로닝을 하였다. 얻어진 전장(full length) OsbHLH148 cDNA의 염기서열을 분석하고, 벼 유전자 데이타베이스의 해당 유전자(Os03g0741100)의 염기서열(acession number: AK071734) 및 단백질(LOC_Os03g53020)의 아미노산 서열과 일치함을 확인하였다.

OsbHLH148 유전자(cDNA)는 나타낸 바와 같이 900개의 염기(종료코돈 포함)로 구성되어 있으며(서열번호 1), 이 유전자가 암호화하는 OsbHLH148 전사인자는 299개의 아미노산 서열을 가지고 있다(서열번호 2). OsbHLH148 전사인자는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(basic helix-loop-helix, bHLH) 구조를 가진 DNA 결합단백질(binding protein)이다.

데이터베이스(database) 검색을 통하여 OsbHLH148 프로모터 염기서열 상의 시스-액팅 엘리먼트(cis-acting element)를 분석하여 본 결과, ABA, 한발, 자스몬산, 에틸렌, 살리실산 및 상처 등에 반응하는 다수의 요소(element)들이 존재하는 것으로 나타났다. 이에 따라 다양한 식물호르몬에 대한 OsbHLH148 유전자의 발현 활성화 양상을 노던 블럿 분석을 통해 관찰하였다. ABA를 Hoagland 배지에 최종 농도가 200 μM 되도록 처리하여 2주 생장한 벼의 뿌리를 담구어 흡수되도록 하였다. OsbHLH148 유전자는 ABA를 1시간 처리했을 때 최대 발현에 도달하여 3시간까지 유지 하였다(도 1). 따라서 이 유전자의 발현은 다양한 외부 스트레스에 매우 민감하게 반응하는 것으로 판단되었다.

이 유전자는 병저항성 유도 호르몬인 살리실산(salicylic acid) 처리에 의해서는 그 발현이 유도되지 않았다. ABA의 스트레스에 대한 대조구(control) 유전자로 OsJAmyb과 OsAOC 유전자의 발현을 함께 관찰하였다. rRNA는 이 전기영동 실험에서 동량의 RNA를 비교하였음을 증명하기 위하여 각 레인별로 그 양을 관찰한 것이다.

실시예 2: OsbHLH148 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환 실험

OsbHLH148 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대를 제조하기 위하여, 유전자의 항시 발현을 유도하는 CaMV35S 프로모터에 OsbHLH148 유전자를 융합하였다(도 2). 이 벡터에는 식물 유전체에 삽입되는 T-DNA 부분의 경계를 나타내는 유전자 염기서열인 LB와 RB 사이에 항생제 가나마이신에 대한 저항성 유전자 NPTII가 포함되어 있어 성공적으로 유전자가 전이된 식물체를 선별하는데 이용할 수 있도록 되어 있다. 이 DNA 구조물(construct)의 이름을 pCaOsbHLH148로 명명하였다. pCaOsbHLH148의 구조는 도 2와 같다.

이 DNA 구조물을 아그로박테리움 투머파시엔스 C58C1( Agrobacterium tumefaciens C58C1)에 전이하고, 가나마이신, 리팜피신, 젠타마이신이 함유된 배지에서 도입 DNA를 함유하고 있는 아그로박테리움을 선발하였다. 꽃대침지법(floral dip transformation)에 따라, 이 균주 배양액에 애기장대의 꽃대를 3분간 담근 후 거의 100% 상대습도 상태의 밀폐된 용기에 비스듬하게 뉘여서 24시간 동안 생장상에서 키운 후 개봉하여 식물을 세워서 키웠다. 이들 식물체에서 얻은 종자를 가나마이신이 함유된 배지에서 발아시켜 가나마이신 저항성 식물체를 선발하였으며, 이로부터 종자를 받아 다시 가나마이신 배지에서 발아 선별한 후 저항성 형질전환체를 토양에 이식하여 제 2 세대 종자를 얻었다. 이를 다시 선별하여 카나마이신 감수성 개체가 나오지 않는 제 3 세대 종자를 대상으로 실험을 하였다. 먼저 OsbHLH148 유전자 DNA를 탐침으로 하여 노던 블럿 분석을 시행한 결과 이 유전자를 항시 과발현하고 있는 것으로 확인된 9 개체를 확보하였다 (도 3).

이들 형질전환 애기장대에 삽입된 목적유전자의 개수와 위치다양성을 확인하기 위해 게놈 서던 블럿 분석을 실시하였다(도 4). 이 유전자는 벼에서 분리한 것으로 원래 애기장대에 존재하지 않으므로 비형질전환체에서 검출되지 않았으며, 3번, 5번, 라인은 한 개의 T-DNA가 식물 염색체 DNA에 삽입되었고 각 라인별로 삽입위치가 서로 다름을 확인하였다.

실시예 3: OsbHLH148 유전자 발현량 변화에 따른 형질전환 애기장대의 표현형 관찰

벼에서 OsbHLH148의 발현이 ABA 처리에 의해 유도된다는 점으로 미루어 볼 때, OsbHLH148은 ABA에 의존하여(ABA-dependent) 작용이 활성화되는 전사인자임을 알 수 있었다. OsbHLH148 유전자의 과발현체가 환경 스트레스 관련 식물 호르몬인 ABA에 어떻게 반응하는지 확인하기 위해 3 μM ABA를 포함한 MS 배지에서 발아율을 관찰하였다. ABA를 포함하지 않은 배지에서는 야생형 애기장대 (WT, Col-0)와 OsbHLH148 유전자의 과발현체의 발아 및 생장에 차이가 없었으나, 3 μM ABA를 포함한 배지에서는 OsbHLH148 유전자의 과발현체가 ABA에 대하여 감수성이 높은(hypersensitve) 것으로 확인되었다(도 5). 이는 OsbHLH148 유전자의 과발현체가 환경 스트레스에 저항성을 보일 수 있음을 의미한다.

실시예 4: OsbHLH148 유전자 발현량 변화에 따른 형질전환 애기장대의 환경 스트레스 저항성 실험

먼저 OsbHLH148 유전자의 과발현체의 수분 손실되는 정도를 야생형 애기장대와 비교하였다. 4주 키운 식물체를 뿌리를 제외한 부분을 23℃에서 자연 건조 시키면서 무게를 측정하였다. OsbHLH148 유전자의 과발현체가 야생형 애기장대에 비해 수분 손실이 적은 것으로 나타났다(도 6). 이 결과를 재확인하기 위해 4주 키운 식물체를 온도가 23℃이고 습도가 30%인 식물 생장상에서 건조시켰다. 동일한 부피의 물을 흠뻑 준 후 건조시킨지 10일이 지났을 때 야생형 애기장대는 시들었지만 OsbHLH148 유전자의 과발현체는 저항성을 나타내었다(도 7). 이를 분명히 하기 위해 건조시킨 지 10일이 지난 후 동일한 부피의 물을 주고 3일이 지난 후를 관찰하였더니 야생형 애기장대는 죽었지만 OsbHLH148 유전자의 과발현체는 살아있었다.

실시예 5: OsbHLH148 유전자를 과발현하는 벼 형질전환 실험

OsbHLH148 유전자의 기능을 분석하기 위해서 OsbHLH148 유전자가 과다 발현되는 형질전환 벼를 개발하였다. 먼저, 유전자의 항시 발현을 유도하는 OsCc1 프로모터에 OsbHLH148 유전자를 융합하였다(도 8). 이 벡터에는 식물 유전체에 삽입되는 T-DNA 부분의 경계를 나타내는 유전자 염기서열인 LB와 RB 사이에 형질전환 벼의 선별을 위해 제초제인 바스타 (basta) 에 대한 저항성을 부여하는 BAR 유전자가 포함되어 있어 성공적으로 유전자가 전이된 식물체를 선별하는데 이용할 수 있도록 되어 있다. 이 DNA 구조물을 아그로박테리움 투머파시엔스 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404) 에 전이하고, 테트라사이클린과 스펙티노마이신이 함유된 배지에서 도입 DNA를 함유하고 있는 아그로박테리움을 선발하였다. 이 균주 배양액을 야생형 벼 (Oryza sativa L. cv. Nakdong) 의 캘러스 (callus) 에 처리하여 세포탁심과 포스피노트리신을 포함한 배지에서 분화시켰다. 분화 과정에서 뿌리 및 잎이 발달한 형질전환 벼를 온실에서 키워 제 1세대 형질전환 종자를 얻었다. 제 1세대 종자를 논 토양에서 키운 후 바스타 처리를 통해 형질전환 벼를 선별하고, 등숙기를 거쳐 제 2세대 종자를 얻었다. 같은 과정을 반복하여 바스타 감수성 개체가 나오지 않는 제 3 세대 종자를 대상으로 실험을 하였다.

실시예 6: OsbHLH148 유전자를 과발현하는 형질전환 벼의 선발

2주 동안 온실의 논 토양에서 키운 제 3세대의 형질전환 벼의 게놈 DNA를 추출하여 EcoRI 제한 효소를 처리한 후 MAR 유전자를 탐침으로 하여 서던 블럿(Southern blot)을 실시한 결과 2, 8, 11번 형질전환 벼에 1 copy, 1, 9, 10번 형질전환 벼에 2 copy의 OsbHLH148 유전자가 각각 삽입된 것을 확인하였다 (도 8). 이들 형질전환 벼에서 OsbHLH148 유전자의 발현 정도를 노던 블럿(Northern blot)을 이용하여 확인한 결과 2, 9번 형질전환 벼에서 발현이 가장 높았고, 11번 형질전환 벼에서 상대적으로 중간 정도의 발현을 보였으며, 1, 8, 10번 형질전환 벼에서 가장 낮게 발현 되었다 (도 9). 위 결과를 바탕으로 2, 9, 11번 형질전환 벼를 이용하여 향후 실험을 진행하였다.

실시예 7: OsbHLH148 유전자의 환경 스트레스에 대한 발현 양상

온실에서 2 주 동안 키운 야생형 벼에 다양한 환경 스트레스를 처리하여 OsbHLH148 유전자의 발현 양상을 조사하였다 (도 10). 한발 스트레스의 경우, 23℃에서 자연 건조시켜 각 시간별로 처리한 실험군을 얻은 결과 1시간 후 가장 높은 발현을 나타내었다. 염해 스트레스의 경우, 소금물에 벼의 뿌리를 침지시켜 시간별로 처리한 실험군을 얻은 결과 1시간 후 가장 높은 발현을 나타내었다. 냉해 스트레스의 경우 4℃의 식물 생장상에서 24시간 동안 빛을 조사한 후 각 시간별로 처리한 실험군을 얻은 결과 12시간 후 가장 높은 발현을 나타내었다. 그리고 상처 (wounding) 스트레스의 경우, 전체 잎 면적의 4분의 1에 해당하는 잎의 끝 부분을 짓이겨 시간별로 처리한 실험군을 얻은 결과 1시간 후 가장 높은 발현을 나타내었다. 벼에서OsbHLH148 유전자가 환경스트레스에 빠르게 발현이 유도되고 애기장대 형질전환체의 한발 스트레스 저항성에 대한 결과로 보아 OsbHLH148 유전자를 과발현 벼가 한발 스트레스에 저항성을 보일 수 있음을 의미한다.

실시예 8: OsbHLH148 유전자로 형질전환된 벼의 한발 저항성 실험

OsbHLH148 유전자 과다 발현 벼가 환경 스트레스에 저항성을 보이는지 확인하기 위해 한발 저항성 실험을 수행하였다. 4 주 동안 온실에서 키운 형질전환 벼와 야생형 벼를 4일 동안 물을 주지 않음으로써 가뭄 조건을 준 결과, OsbHLH148 형질전환 벼가 야생형 벼보다 저항성을 나타내었고 물을 다시 주어 회복되는 정도를 10일 후에 확인하였더니 야생형 벼는 대부분 말라 죽은 반면에 OsbHLH148 유전자 형질전환 벼는 다시 회복되었다 (도 11).

그리고 OsbHLH148 유전자 형질전환 벼의 한발 저항성 표현형을 뒷받침하기 위해 엽록소 함량(Fv/Fm ; Fv, variable chlorophyll fluorescence, Fm, maximum chlorophyll fluorescence)을 조사하여 PSII의 광화학 효율을 측정하였다. 그 결과, OsbHLH148 유전자로 형질전환된 벼는 야생형 벼보다 Fv/Fm 값이 32-48 % 더 높았다 (도 12).

서열목록 전자파일 첨부

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서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 전사인자 OsbHLH148(Oryza sativa basic helix-loop-helix 148) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 OsbHLH148 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 한발 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 전사인자 OsbHLH148(Oryza sativa basic helix-loop-helix 148) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 한발 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
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제8항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 전사인자 OsbHLH148(Oryza sativa basic helix-loop-helix 148) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물의 한발 스트레스에 대한 저항성을 증가시키기 위한 조성물.