KR101402602B1 - 벼 유래 OsCYP18-2 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼 유래의 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsCYP18-2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, OsCYP18 -2 유전자가 고농도의 염 또는 건조 스트레스 내성 기작에서의 중요한 기능이 증명됨에 따라 상기 유전자가 벼의 염 또는 건조 스트레스에 대한 저항성을 높이는데 유용할 것으로 기대된다.

Description

벼 유래 OsCYP18-2 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법{Method for producing transgenic plant with increased resistance to environmental stresses using OsCYP18-2 gene}
본 발명은 벼 유래 OsCYP18 -2 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsCYP18 -2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법, 상기 벼 유래의 OsCYP18-2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsCYP18 -2 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.
식물의 병 저항성 반응 또는 환경적 스트레스에 대한 내성을 가지는 식물의 방어관련 기작 연구는 지금까지 알려져 있지 않은 생체 내 기작을 규명하는 과학 기술적 가치를 지닌다. 또한 식물방어관련 유전자의 정보는 작물의 분자적 유전육종의 직접적 재료로서 제공될 수 있을 뿐 아니라 전통적 유전육종에도 사용될 수 있는 장점을 지니고 있다.
환경친화적 식량생산의 측면에서 병 방어 관련 다양한 유전자, 또는 이들 형질을 이용한 작물 육종은 경제적으로 중요한 병원체, 잡초 및 환경적 스트레스에 의한 손실을 최소화함으로써 식량생산비용을 줄일 수 있으며, 고품질의 식량을 제공하여 농산물의 경쟁력 회복에 기여함과 동시에 신품종의 개발과 연관된 다양한 산업의 활성화에 기여한다.
환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서 수분 스트레스, 저온 스트레스, 염 스트레스 및 산화스트레스 등이 있다. 특히 수분 스트레스는 저온, 탈수 및 고염도와 같은 외부환경에 의해 유발되며, 식물의 생장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중의 하나이다.
한국등록특허 제0861717호에는 'AtCPL5 유전자와 AtCPL5 유전자가 과발현되는 형질전환 식물체'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0742194호에서는 '환경 스트레스 저항성 조절 유전자를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 벼 유래 OsCYP18 -2 유전자를 이용한 환경 스트레스 내성 식물체의 제조방법 및 이의 용도에 관해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 벼 OsCYP18-2 유전자가 식물 호르몬인 앱시스산과 메틸자스몬산 또는 고온, 저온, 과산화수소, 건조 및 염해와 같은 여러 환경 스트레스에 반응하여 발현이 변화함을 정량적 RT-PCR로 확인하였다. 여러 환경 스트레스 중 건조 스트레스와 염 스트레스에 대한 OsCYP18 -2 유전자의 기능을 분석하기 위해 OsCYP18-2 과발현 형질전환체 애기장대와 벼를 제작하였다. 식물체의 표현형 분석을 통해 애기장대와 벼에서 건조 스트레스와 염 스트레스 처리시 OsCYP18 -2 과발현체의 강한 내성을 확인하였으며 또한 생존율과 생체량 측정과 같은 생리학적 분석을 통해서도 건조 스트레스와 염 스트레스에 대한 내성을 확인하였다. OsCYP18 -2 유전자의 과발현이 식물체의 환경 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 것을 증명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsCYP18 -2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벼 유래의 OsCYP18-2 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 벼 유래 OsCYP18 -2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 유전자는 PPIase(peptidyl prolyl isomerase) 활성을 가지고 있으며 여러 환경 스트레스에 의해 유전자 발현이 증가하는 것이 확인되었다. 35S 프로모터를 이용하여 OsCYP18 -2 유전자 과발현 형질전환 식물체 애기장대와 벼를 제작하였다. OsCYP18-2 과발현 애기장대와 벼 형질전환 식물체를 이용하여 OsCYP18 -2 유전자가 식물 호르몬인 앱시스산과 메틸자스몬산 또는 과산화수소, 건조 및 염해와 같은 환경 스트레스에 반응하였고, 형질전환 식물체가 건조 및 염 스트레스에 대한 내성이 증진됐음을 입증하였다. 본 발명을 통해서 OsCYP18 -2 유전자가 식물의 건조 및 염해와 같은 환경 스트레스 내성 기작에 관여하는 유전자임을 알 수 있으며, 이를 유용작물에 도입하여 환경 스트레스 내성 작물 개발에 유용한 유전자로서 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
도 1은 여러 가지 스트레스에 반응하는 벼 OsCYP18 -2 유전자의 발현 변화를 반정량적 RT-PCR과 정량적 RT-PCR로 분석한 결과이다. A) 벼의 발달시기 및 조직별 OsCYP18 -2 유전자 발현 분석. 1주, 2주, 6주, 벼 종자 발아 후 1주, 2주 및 6주 된 식물체; En, 내배유(endosperm); Ro, 뿌리(root); Sh, 껍질(sheath); St, 줄기(stem); Le, 잎(leaf). B) 여러 스트레스 처리 시간별 OsCYP18 -2 유전자 발현 분석. ABA(abisisic acid), 앱시스산; Heat, 고온; H2O2, 과산화수소; MeJA, 메틸자스몬산(Metyl jasmonic acid); Cold, 저온; MV, 메틸비올로겐(metyl viologen). C 및 D) 고농도 염 또는 건조 스트레스 처리 후, 시간에 따른 OsCYP18 -2 유전자 발현 분석. 스트레스 처리에 대한 마커 유전자로 OsDREB2A를 사용하였다. 정량적 RT-PCR은 3번의 반복실험에 대한 표준오차 값으로 계산하였으며, OsACT1 유전자 발현값으로 보정하여 cDNA 값을 정량화하였다.
도 2는 프로테아제 결합된 펩티드 분석 방법(protease-coupled peptide assay)을 통한 OsCYP18-2 단백질의 PPIase 활성도 측정 결과를 나타내는 도면이다. A) 위쪽 그림. OsCYP18-2의 N-말단에 히스티딘 태그(Hig tag)가 융합된 pET28a 재조합 플라스미드를 대장균에 형질전환 후, IPTG를 처리하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 니켈-NTA 아가로즈 컬럼(Nickel-NTA agarose column)을 이용하여 OsCYP18-2 재조합 단백질을 분리 정제한 결과이다. 아래쪽 그림. 히스티딘 항체를 이용하여 OsCYP18-2 재조합 단백질의 발현과 분리 정제를 확인한 면역 블롯 결과이다. 비유도(No induction), IPTG를 첨가하지 않아 재조합 단백질의 발현이 유도되지 않은 대장균으로부터 수거한 단백질 샘플; 유도(Induction), 재조합 단백질의 발현 유도를 위해 IPTG를 첨가한 대장균으로부터 수거한 단백질 샘플; 가용성 분획(soluble fraction); 불용성 분획(insoluble fraction); 정제된 분획(purified fraction). B) 정제된 OsCYP18-2 단백질의 농도별 시간에 따른 PPIase 활성도 측정 결과이다. PPIase 활성도는 분광광도계 흡광도 390nm에서 측정하였다.
도 3은 OsCYP18 -2 유전자의 과발현 형질전환체 제작을 위한 재조합 유전자와 과발현 식물 형질전환체에서의 재조합 유전자 발현 정도를 RT-PCR 분석을 통해 확인한 결과이다. A) pCAMBIA1300 벡터의 T-DNA 영역에서 35S 프로모터에 의한 OsCYP18-2 오픈리딩프레임(open reading frame) (1-164 aa) 유전자를 재조합한 도식이다. LB, T-DNA 왼쪽 경계(T-DNA left border); 35S-P, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터; hptII. 하이그로마이신 내성 유전자; T-NOS, 노팔린 합성효소 종결자(nopaline synthase terminator); RB, T-DNA 오른쪽 경계(T-DNA right border). B) 애기장대에 OsCYP18 -2 과발현 재조합 유전자 형질전환후 생산된 T3 세대 형질전환체에서 OsCYP18 -2와 AtCYP18 -2 유전자 발현 분석 결과이다. AtACT2 유전자 발현값으로 보정하여 CYP18 -2 mRNA 발현 정도를 정량화하였다. At, OsCYP18 -2 유전자 과발현 애기장대 형질전환체; WT, 야생형(Col-0); V1, pCAMBIA1300 벡터 대조구 형질전환체; OE1-OE3, 독립적 OsCYP18 -2 과발현 애기장대 형질전환체. C) 벼에 OsCYP18-2 과발현 재조합 유전자 형질전환 후 생산된 T3 세대 형질전환체에서의 OsCYP18-2 유전자 발현정도를 분석한 결과이다. OsACT1 유전자 발현값으로 보정하여 OsCYP18 -2 mRNA 발현정도를 정량화하였다. WT, 야생형(동진); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP18 -2 과발현 벼 형질전환체.
도 4는 OsCYP18 -2 유전자가 과발현된 애기장대와 벼 형질전환체의 건조 스트레스에 대한 내성을 나타내는 도면이다. A) 3주된 애기장대 식물체를 8일간 건조 스트레스를 준 뒤 재수화하여 5일간 회복시킨 후의 표현형에 대한 결과이다. 건조 전(Before drought), 3주된 애기장대 식물체의 건조 스트레스 주기 전 사진; 8일 동안 건조(Drought for 8days), 3주된 애기장대 식물체에 8일간 건조 스트레스를 준 사진; 5일 동안 재수화(Rewater for 5 days), 8일간 건조 스트레스를 준 후 재수화하여 5일간 회복시킨 후 사진. B 및 C) A 그림의 건조 스트레스 내성 표현형 정량화 분석을 위한 애기장대 식물체의 B) 생존률 측정 그래프 및 C) 지상부의 생체량 측정 그래프이다. 각 독립 라인에 대해 30개체의 식물체를 사용하였으며 3반복에 대한 표준 편차 값으로 계산되었다. D) 건조 스트레스 조건에서 애기장대 식물체의 기공 폐쇄(stomatal closure) 측정 그래프이다. 각 라인에 대해 3개체의 식물체 잎에서 각 100~150개의 기공세포를 관찰하여 계산되었다. E) 건조 스트레스 유도 시 애기장대 식물체의 시간에 따른 잎의 생체량 측정 그래프이다. WT, 야생형(Col-0); V1, pCAMBIA1300 벡터 대조구 형질전환체; OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP18-2 과발현 애기장대 형질전환체. F) OsCYP18 -2 유전자 과발현된 벼 형질전환체의 건조 스트레스 내성 표현형에 대한 결과이다. 건조 전(Before drought), 3주된 벼 식물체에 건조 스트레스 처리 전 사진; 3일 동안 건조(Drought for 3 days), 3주된 벼 식물체에 3일 동안 건조 스트레스 처리한 사진; 2일 동안 재수화(Rewater for 2 days), 3일간 건조 스트레스 처리 후 재수화하여 2일간 회복시킨 후 사진; 7일 동안 재수화(Rewater for 7days), 3일간 건조 스트레스 처리 후 재수화하여 7일간 회복시킨 후 사진. G 및 H) 건조 스트레스 내성 표현형 정량화 분석을 위한 벼 식물체의 G) 생존율 측정 그래프 및 H) 지상부 생체량 측정 그래프이다. WT, 야생형(동진); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP18 -2 과발현 벼 형질전환체. 각 라인에 대해 30개체의 식물체를 사용하였으며 3반복에 대한 표준 편차 값으로 계산되었다. *는 p<0.1를 나타내고 **는 p<0.05를 나타내며, t-테스트에 의한 P value 값을 의미한다.
도 5는 OsCYP18 -2 유전자가 과발현된 애기장대와 벼 형질전환체의 고농도 염 스트레스에 대한 내성을 나타내는 결과이다. A) 애기장대 유식물체의 0, 50 또는 100mM NaCl이 함유된 1/2 MS 아가(agar) 배지에서 발아 후 7일 뒤의 표현형에 대한 결과이다. B) 3주된 애기장대 식물체에 14일간 고농도 염 스트레스를 처리한 표현형에 대한 결과이다. 처리 전(Before treatment), 3주된 애기장대 식물체의 염해 스트레스 처리 전 사진; 14일 동안 150mM NaCl, 3주된 애기장대 식물체에 14일간 150mM NaCl을 처리한 사진. C 및 D) A 그림에 대한 염해 스트레스 내성 정량화 분석을 위한 애기장대 유식물체의 C) 생체량 측정 그래프 및 D) 뿌리길이 측정 그래프이다. E) B 그림에 대한 염 스트레스 내성 정량화 분석을 위한 식물체 지상부의 생체량 측정 그래프이다. WT, 야생형(Col-0); V1, pCAMBIA1300 벡터 대조구 형질전환체; OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP18-2 과발현 애기장대 형질전환체. F) OsCYP18-2 유전자가 과발현된 벼 유식물체의 고농도 염 스트레스 내성 표현형에 대한 결과이다. 형질전환 식물체 선별을 위해 하이그로마이신(50㎎/ℓ) 함유된 1/2 MS 배지에서 3일간 발아 후 150mM NaCl이 함유된 1/2 MS 배지로 옮겨 7일 후의 표현형을 관찰한 결과이다. G 및 H) F 그림에 대한 염 스트레스 내성 정량화 분석을 위한 벼 유식물체의 G) 지상부 길이 측정 그래프 및 H) 생체량 측정 그래프이다. WT, 야생형(동진); OE1-OE3, 3개의 독립 라인 OsCYP18 -2 과발현 벼 형질전환체. 각 라인에 대해 30개체의 식물체를 사용하였으며 3반복에 대한 표준 편차 값으로 계산되었다. *는 p<0.1를 나타내고 **는 p<0.05를 나타내며, t-테스트에 의한 P value 값을 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsCYP18 -2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsCYP18-2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 OsCYP18-2 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 활성을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 OsCYP18-2 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 OsCYP18-2 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 OsCYP18 -2 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
OsCYP18 -2 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 식물호르몬의 일종인 앱시스산 및 메틸자스몬산, 고온 스트레스, 저온 스트레스, 염 및 건조 스트레스일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 염 및 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
벼 유래의 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 OsCYP18-2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 식물호르몬의 일종인 앱시스산 및 메틸자스몬산, 고온 스트레스, 저온 스트레스, 염 및 건조 스트레스일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 염 및 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 염 및 건조 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다.
상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 애기장대 또는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsCYP18-2 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsCYP18-2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 염 및 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 벼의 발달시기와 조직에 따른 OsCYP18 -2 유전자 발현 및 다양한 스트레스 처리에 반응하는 OsCYP18 -2 유전자의 발현특성
벼의 발달시기별 그리고 조직별 OsCYP18 -2 유전자의 발현 차이를 확인하기 위하여 1주, 2주 및 6주 된 벼 식물체로부터 배유, 뿌리, 신초, 줄기 및 잎 조직으로 나누어 RNA를 추출하였다. MMLV 역전사 효소(Invitrogen, 미국)를 이용해 추출한 RNA 2㎍으로부터 cDNA를 합성하였으며, 이를 정량적 RT-PCR 분석에 사용하였다. OsCYP18 -2 유전자의 발현을 확인하기 위한 특이적 프라이머로 정방향(5'-ATG TGG GGC AGC GCC GAC GGC GGC ACG-3'; 서열번호 3)과 역방향(5'-TCA ATC TTT GAC CAC AGT CCG CAG GA-3'; 서열번호 4), 발현량 보정을 위한 OsActin1 프라이머는 정방향(5'-CAT GCT ATC CCT CGT CTC GAC CT-3'; 서열번호 5) 및 역방향(5'-CGC ACT TCA TGA TGG AGT TGT AT-3'; 서열번호 6)을 각각 사용하였다. OsCYP18 -2 유전자는 모든 조직에서 발현되었으며, 특히 1주 된 식물체에서는 배유에서 발현이 가장 높은 것을 확인하였다. 2주와 6주 된 식물체에서는 다른 조직에 비해 줄기 조직에서 발현이 낮았으며, 6주 된 식물체에서는 잎 조직에서의 발현이 다른 조직에 비해 3배 이상 높은 것을 확인하였다(도 1A). 다양한 스트레스 처리에 의한 OsCYP18 -2 유전자 발현변화를 분석하기 위해 종자 발아 후 7일 된 벼 유식물체에 100μM ABA, 42℃ 고온, 4℃ 저온, 10mM H2O2, 10μM 메틸비올로겐, 10μM 메틸자스몬산, 200mM NaCl 및 건조 스트레스를 처리하여 시간대 별로 RNA를 추출하였다. MMLV 역전사 효소(Invitrogen, 미국)를 이용해 추출한 RNA 2㎍으로부터 cDNA를 합성하였으며, 이를 정략적 RT-PCR 분석에 사용하였다. OsCYP18 -2 유전자의 발현을 확인하기 위한 특이적 프라이머로 정방향(5'-ATG TGG GGC AGC GCC GAC GGC GGC ACG-3'; 서열번호 3)과 역방향(5'-TCA ATC TTT GAC CAC AGT CCG CAG GA-3'; 서열번호 4), 발현량 보정을 위한 OsActin1 프라이머는 정방향(5'-CAT GCT ATC CCT CGT CTC GAC CT-3'; 서열번호 5) 및 역방향(5'-CGC ACT TCA TGA TGG AGT TGT AT-3'; 서열번호 6)을 각기 사용하였다. OsCYP18 -2 유전자 발현은 ABA와 건조 스트레스 처리시 가장 강하게 증가하였으며 ABA 처리시 24시간째 13배 이상 증가하고, 건조 스트레스 처리시 24시간째 8배 이상 증가하였다. 고온 스트레스, 고농도 염 스트레스 및 메틸자스몬산 처리에 의해서도 약 6배 정도 발현이 증가하였다가 점차 줄어드는 것을 확인하였다. 그 외에 H2O2 처리시에는 24시간까지 3배 정도 발현이 점차 증가하였으며, 메틸비올로겐 처리시에는 처리 후 3시간까지는 발현이 2배 증가하였다가 이후 12시간까지 감소 후 24시간째 다시 증가하는 경향을 나타내었다(도 1B, 1C 및 1D). 유전자 발현 분석을 통하여 OsCYP18 -2 유전자는 식물체 대부분의 조직에서 발현되고 있으며, 다양한 스트레스에 의하여 유전자 발현이 유도 조절되는 특성이 있음을 확인하였다.
실시예 2: OsCYP18 -2 단백질의 PPIase 활성 확인
벼 이뮤노필린 유전자 분류군에 속하는 OsCYP18 -2 유전자는 164개의 아미노산으로 구성되어 있으며 PPIase 활성을 갖는 주요 아미노산 잔기가 잘 보존되어 있다(Ahn et al., 2010 BMC Plant Biology, 10: 253). 이러한 보고로부터 OsCYP18 -2 유전자는 PPIase 활성을 보일 것으로 예측되었다. OsCYP18-2 단백질의 PPIase 활성을 확인하기 위하여 프로테아제 결합된 펩티드 분석 방법(protease-coupled peptide assay)으로 측정하였다. pET28a 벡터에 OsCYP18-2 ORF(1-164aa) 부분을 삽입하여 OsCYP18-2의 N-말단에 히스티딘(His)이 융합된 재조합 플라스미드를 대장균에 형질전환시켰다. IPTG를 첨가하여 OsCYP18-2 단백질의 발현을 유도한 후 니켈-NTA 아가로즈 컬럼(Nickel-NTA agarose column)을 사용해 OsCYP18-2 단백질을 정제 및 획득하였고 OsCYP18-2 단백질은 대부분 불수용성 분획에서 수거되는 특성을 확인하였다(도 2A). OsCYP18-2 단백질의 PPIase 활성은 펩타이드 기질과 시스(cis)-에서 트랜스(trans)-로 전환된 펩타이드 기질을 잘라내는 키모트립신(chymotypsin)과 정제된 OsCYP18-2 단백질을 농도별로 반응시킨 뒤 흡광도 390nm에서 반응 시간에 따라 측정되었다. 50nM, 100nM 및 200nM로 단백질의 농도가 증가함에 따라 PPIase 활성이 빠르게 증가하였으며, 100nM OsCYP18-2 단백질과 1μM 시클로스포린 A(CsA, 시클로필린 결합 화합물)을 먼저 반응시킨 후 PPIase 활성을 측정한 결과 OsCYP18-2 단백질 무처리 대조구(blank)와 같은 흡광도 값을 보였다(도 2B). OsCYP18-2 단백질이 CsA와 결합하는 경우 OsCYP18-2 PPIase가 비활성화됨을 보여주었고, 이를 통해 OsCYP18-2 단백질이 PPIase 활성을 가지고 있으며 시클로스포린 A에 의해 OsCYP18-2 단백질의 PPIase 활성이 저해되는 것을 확인하였다.
실시예 3: OsCYP18 -2 유전자 과발현 형질전환체 생산
35S 프로모터를 이용한 OsCYP18 -2의 과발현 형질전환체 생산을 위해 pCAMBIA1300 벡터에 OsCYP18 -2 특이적 프라이머 정방향(5'-ACT AGT ATG TGG GGC AGC GCC GAC GGC GGC ACG-3'; 서열번호 7)과 역방향(5'-GGT ACC TCA ATC TTT GAC CAC AGT CCG CAG GA-3'; 서열번호 8)을 사용하여 pCAMBIA1300-OsCYP18-2 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 3A). 35S-OsCYP18-2 유전자가 애기장대와 벼의 게놈내에 삽입되도록 형질전환시킨 후, 하이그로마이신 항생제를 이용해 OsCYP18 -2 유전자 과발현 형질전환체 T3 세대를 선발하였다. 애기장대 식물체에서 삽입된 외래 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해 3개의 독립적 과발현체(OE1, OE2, OE3)와 대조구로 사용한 pCAMBIA1300에 35S 프로모터가 삽입된 형질전환체(V1) 그리고 Col-0 야생종(WT, wild type) 식물체로부터 총 RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 후 RT-PCR 분석한 결과, 3개 독립 라인의 형질전환체가 모두 35S 프로모터에 의한 강한 OsCYP18-2 유전자 발현이 되고 있음을 확인하였다. 또한 애기장대에서 OsCYP18 -2 유전자의 상동유전자인 AtCYP18 -2 유전자의 발현 수준을 AtCYP18 -2 유전자 특이적 프라이머 정방향(5'-ATG TCG GCA AGA CCT GAA GGA-3'; 서열번호 9)과 역방향(5'-GGA TCG ATC ACT TTG GTC CT-3'; 서열번호 10)을 사용하여 RT-PCR 분석한 결과 3개 독립 라인들의 형질전환체 모두 대조구와 유사한 발현을 보이는 것을 확인하였다. RT-PCR의 cDNA 정량화를 위해 애기장대 액틴2 유전자의 프라이머 정방향(5'-GGA AGG　ATC TGT ACG GTA AC-3'; 서열번호 11)과 역방향(5'-CAT AAC TGG GCT GCT TGG AGC C-3'; 서열번호 12)을 사용하였다(도 3B). 벼 식물체에서 삽입된 외래 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해 3개의 독립적 과발현체(OE1, OE2, OE3)와 대조구인 동진 일반벼(WT, 야생형) 식물체로부터 총 RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 후 RT-PCR 분석한 결과, 3개 독립 라인들의 형질전환체가 모두 대조구에 비해 강하게 OsCYP18-2 유전자 발현이 되고 있음을 확인하였다. RT-PCR의 cDNA 정량화를 위해 벼 액틴1 유전자의 프라이머 정방향(5'-CAT GCT ATC CCT CGT CTC GAC CT-3'; 서열번호 5)과 역방향(5'-CGC ACT TCA TGA TGG AGT TGT AT-3'; 서열번호 6)을 사용하였다(도 3C). 따라서 애기장대와 벼에서 생산한 각 3개의 독립라인들 형질전환체를 OsCYP18 -2 유전자 기능분석을 위한 재료로 사용하고자 한다.
실시예 4: OsCYP18 -2 과발현체를 이용한 건조 스트레스 내성 확인
OsCYP18 -2 유전자 발현 분석 결과 건조 스트레스 시 발현이 강하게 증가하였다. 따라서 OsCYP18 -2 과발현 형질전환체를 이용하여 건조 스트레스에 대한 내성을 분석하였다. 토양 조건에서 3주 자란 애기장대 식물체를 대상으로 8일간 건조 스트레스를 유도한 뒤 5일간 재수화하여 표현형을 관찰하였다. 정상조건에서 3주간 자란 과발현체는 대조구와 비슷한 표현형을 나타내었으나 8일간 건조 스트레스 처리시 대조구는 잎의 시들음과 마름 현상이 강하게 나타났으며 과발현체는 대조구에 비해 약하게 나타나는 것을 확인하였다. 5일간 재수화를 통해 회복시킨 후에는 대조구는 대부분의 식물체들이 생존하지 못하는 표현형을 나타내는 반면, 과발현 식물체들은 대부분 재수화에 의해 회복되어 정상적인 표현형을 나타내었다(도 4A). 재수화 후 대조구와 과발현체의 생존율을 비교한 결과 대조구는 약 10% 내외의 생존율을 보였으며 과발현체의 경우 60~80%의 높은 생존율을 나타내었다(도 4B). 또한 정상조건과 건조 스트레스 시 식물체의 지상부 생체량을 비교한 결과 정상조건에서는 대조구와 과발현체 간의 차이가 없었으며 건조 스트레스-재수화한 경우 과발현체의 생체량이 대조구에 비해 3배 이상 증가한 것을 확인하였다(도 4C). 건조 스트레스시 반응하는 기공세포의 상태를 확인하기 위해 3주된 식물체의 지상부를 분리하여 실험실 조건에서 건조시킨 후 식물체의 수분함유량이 약 75%일 때 현미경을 이용해 잎의 기공세포를 관찰하였다. 기공세포의 세로/가로 길이 비율로 기공 개폐 정도를 나타내었다. 3개의 과발현체 모두 대조구에 비해 기공세포의 세로/가로 길이 비율이 높은 것으로 보아 대조구보다 과발현체에서 기공이 많이 닫혀있는 것을 알 수 있었다(도 4D). 기공개폐의 차이에 의한 식물체의 수분 손실 정도를 측정하기 위하여 3주된 식물체의 지상부를 분리하여 실험실 조건에서 건조 스트레스를 유도한 후 시간에 따라 생체량을 비교 측정하였다. 토양에서 식물체의 지상부를 분리한 직후의 생체량을 기준으로 하여 상대적인 생체량 변화를 조사하였다. 건조 스트레스 후 1시간째부터 24시간까지 과발현체와 대조구의 상대적인 생체량 차이가 점차적으로 증가하여 30시간째에서는 과발현체가 대조구에 비해 약 10% 정도 생체량이 덜 감소하였으며 이 결과를 통해 과발현체가 대조구에 비해 건조시간에 따른 수분손실이 적은 것을 알 수 있었다(도 4E).
3주 키운 벼 식물체를 대상으로 3일간 건조 스트레스를 유도한 뒤 7일간 재수화하여 표현형을 관찰하였다. 정상조건에서 3주간 자란 과발현체는 대조구와 비슷한 표현형을 나타내었다. 건조 스트레스 처리시 3일간은 과발현체와 대조구에서 잎의 시들음, 마름과 꺾임 현상이 비슷하게 나타났지만 재수화 후 과발현체가 대조구보다 회복을 잘 하는 건조 스트레스 내성 표현형을 나타내었다(도 4F). 3일간 건조 스트레스 유도 후 7일간 재수화하여 회복한 식물체의 생존율을 비교한 결과 대조구의 생존율은 약 60%인 반면 과발현체의 생존율은 85~95%로 대조구에 비해 25% 이상 더 높은 생존율을 나타내었으며(도 4G), 또한 재수화 후 식물체의 지상부 생체량 측정 결과 과발현체의 생체량이 대조구보다 40~60% 증가한 것을 확인하였다(도 4H). 이 결과로부터 OsCYP18 -2 유전자가 과발현된 애기장대와 벼 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성을 입증하였다.
실시예 5: OsCYP18 -2 과발현체를 이용한 염 스트레스 내성 확인
OsCYP18 -2 과발현 형질전환체를 이용하여 염해 스트레스에 대한 내성을 분석하였다. 애기장대 유식물체를 대상으로 0, 50 또는 100 mM NaCl이 함유된 1/2 MS 배지에서 발아한 후 7일 째의 표현형을 관찰하였다. 염이 함유되지 않은 정상 조건에서는 과발현체와 대조구의 생장에 차이가 없는 반면 50 또는 100mM NaCl이 함유된 배지에서 자란 경우 과발현체가 대조구에 비해 전체적인 생장에서 내성을 갖는 표현형을 나타내었다(도 5A). 염 스트레스 처리에 의한 애기장대 유식물체의 생체량과 뿌리길이 측정 결과 50mM 농도에서 과발현체의 뿌리길이가 약간 증가하였으며, 100mM 농도에서는 과발현체에서 생체량과 뿌리길이 모두 대조구에 비해 뚜렷한 증가를 나타내었다(도 5C 및 5D). 3주 키운 애기장대 식물체를 대상으로 150mM NaCl을 14일간 처리한 결과 염해 스트레스 처리 전에는 과발현체와 대조구의 성장에 차이가 없었으나 고농도의 염 스트레스 처리 시 잎이 마르는 현상과 함께 엽록체가 파괴되어 백화현상이 대조구에서 더 심각하게 나타났으며 과발현체는 대조구에 비해 녹색의 정상적인 잎들이 더 많은 염해 스트레스 내성 표현형을 나타내었다(도 5B). 염해 스트레스 처리 후 과발현체와 대조구 식물체의 지상부 생체량을 측정하여 비교한 결과 과발현체가 대조구에 비해 약 1.5배 생체량이 증가함을 확인하였다(도 5E).
벼에서 OsCYP18-2 과발현 형질전환체의 염해 스트레스 내성 표현형을 분석하기 위하여 2일된 벼 유식물체에 150mM NaCl을 7일 동안 처리하였다. 대조구는 1/2 MS 배지에서 2일간 발아시키고 과발현체는 하이그로마이신이 함유된 1/2 MS 배지에서 2일간 발아시켜 선별한 후, 고농도 염이 함유된 배지로 옮긴 뒤 7일째의 표현형을 관찰하였다. 정상조건에서 자란 경우 과발현체와 대조구의 생장에 차이가 없었으며, 고농도의 염 처리 시 대조구에서는 식물체 생장이 크게 저하되는 표현형을 나타내었고 과발현체에서도 정상조건보다 생장이 저해되었지만 대조구에 비해 식물체의 지상부가 더 잘 자라는 염 스트레스 내성 표현형을 나타내었다(도 5F). 염 스트레스 처리 후 과발현체와 대조구 식물체의 지상부 길이와 생체량을 측정한 결과 과발현체의 지상부 길이와 생체량이 대조구에 비해 약 20% 이상 증가한 것을 확인하였다(도 5G 및 5H). 이 결과로부터 OsCYP18 -2 유전자가 과발현된 애기장대와 벼 식물체의 염해 스트레스에 대한 내성을 입증하였다.
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Claims (9)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsCYP18-2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 염 또는 건조 스트레스 내성을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsCYP18-2 유전자를 과발현하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 염 또는 건조 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제4항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 염 또는 건조 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체.
  8. 제7항에 따른 식물체의 종자.
  9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsCYP18-2(Oryza sativa cyclosporin A-binding protein) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 염 또는 건조 스트레스 내성 증가용 조성물.
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BMC Plant Biology 2010, 10:253 *

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