KR101664206B1 - 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsWOX13 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래 OsWOX13(Oryza sativa WUSCHEL-related homeobox) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법, 상기 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

Description

식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsWOX13 유전자 및 이의 용도{OsWOX13 gene from rice for increasing environmental stress resistance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 가뭄 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsWOX13 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래 OsWOX13(Oryza sativa WUSCHEL-related homeobox) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법, 상기 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

식물을 비롯한 대부분의 생물은 병균, 해충, 바이러스 등의 생물학적 스트레스뿐만 아니라 지구 환경의 악화에 따라 발생하는 고온, 염해, 건조, 공해, 병원균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 과다한 UV 노출 및 삼투성 충격(osmotic shock)과 같은 각종 환경 스트레스를 받게 된다. 그중에서도 높은 염 농도는 독성의 Na+ 이온 축적, 삼투스트레스, 산화스트레스의 원인이 되어 작물의 생산성 감소, 성장저해를 유발한다. 세포 내 이온과 물 항상성(homeostasis)의 급격한 변화를 초래하여 심할 경우 식물이 죽게 된다. 수분 부족으로 인한 건조 스트레스 또한 작물의 생산성을 감소시키는 주된 요인이 된다.

식물은 이러한 환경 스트레스를 극복하면서 진화하여 왔는데, 특히 염도, 가뭄, 온도 스트레스 하에서 화학성분들을 축적하는 것으로 알려져 있다. 외부에 삼투압 변화가 생기면 세포는 이에 반응하여 글라이신베타인(glycinebetain, GB) 등과 같은 화합성 용질(compatible solute)이라고 하는 대사산물(osmolytes-sucrose, fructose, glycerol, methylated inositol, trehalose, DMSP, proline, ectoine 등)을 축적하는데, osmolytes의 축적은 정상적인 대사를 방해하지 않으며, 세포 내의 삼투압을 낮춤으로써 삼투압을 조정하여(osmotic adjustment), 외부의 삼투압 스트레스에 대한 저항성을 갖게 한다. 이들은 친수성이 있기 때문에 단백질, 단백질 결합체, 혹은 세포막 등에 결합하고 있는 물과 치환할 수가 있어서 내삼투압제(osmoprotectant)로 작용할 뿐만 아니라, 저분자 샤페론처럼 비효소적(non-enzymatic)으로 작용한다. 화합성 용질이 세포 내에 대량으로 축적되면 효소의 열역학적인 안정성을 증가시켜, 염 이온이 효소활성을 저해하는 것을 막아주고, 광합성Ⅱ계에서 작용하는 산소발생효소(oxygen-evolving enzyme) 등과 같은 효소복합체들이 해리되는 것을 막아주는 역할도 한다.

또한, 식물은 이러한 염 및 수분 스트레스에 대한 방어 기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자 하는 경향이 있다. 지금까지 염 및 수분 스트레스에 관여하는 다수의 유전자들이 분리되었다.

한국공개특허 제1281072호에서는 'ＯｓＦＫＢＰ１６－３ 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0695072호에는 '비생물성 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 스트레스 유도성 OsAsr1 유전자 및 단백질'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsWOX13 유전자 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 유래 OsWOX13 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여 OsWOX13 유전자가 과발현되는 벼 형질전환 식물체를 제작하였고, 상기 OsWOX13 과발현 형질전환 벼 식물체가 염 또는 가뭄 스트레스 처리 시 야생형 식물체에 비해 염 또는 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 OsWOX13(Oryza sativa WUSCHEL-related homeobox) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 벼 유래 OsWOX13(Oryza sativa WUSCHEL-related homeobox) 단백질을 코딩하는 유전자가 과발현되는 식물체는 염 및 가뭄 스트레스 조건에서 야생형에 비해 스트레스 내성이 증가된다. 따라서, 본 발명의 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자는 염 또는 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있으므로, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 형질전환된 rab21::OsWOX13 식물체의 제조를 나타낸다. a는 벼 형질전환을 위한 벡터 지도를 나타낸다. 화살표는 sqRT-PCR에 사용된 프라이머의 위치를 나타낸다. b는 2주된 유묘 잎에서 스트레스 비처리 및 건조 처리 3시간째 OsWOX13의 발현을 나타낸다.
도 2는 비생물적 스트레스 내성이 증가된 형질전환 벼 식물체의 유묘를 나타낸다. 비생물적 스트레스는 4주된 유묘(a)를 대상으로 처리되었고, 샘플은 형질전환 식물체 및 비형질전환 식물체 사이에서 외관상 차이가 있는 것을 수집하였다. b는 400mM NaCl을 3시간 처리한 식물체를, c는 건조 처리를 4시간 수행한 식물체를 나타낸다.
도 3은 비생물적 스트레스 조건하에서 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 4는 비생물적 스트레스 및 re-watering process 동안의 식물의 외관을 나타낸다.
상기 도 1 내지 4의 IM은 비형질전환체를 나타내고, rab21::OsWOX13은 OsWOX13 형질전환체를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 OsWOX13(Oryza sativa WUSCHEL-related homeobox) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시켜 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 가뭄(건조), 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염 또는 가뭄 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 OsWOX13 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, OsWOX13 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 OsWOX13 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 OsWOX13 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.

본 발명의 OsWOX13 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래 OsWOX13 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시켜 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 OsWOX13 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 염 또는 가뭄 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개 될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성, 바람직하게는 염 또는 가뭄 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.

또한, 본 발명은 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하기 위한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자의 용도를 제공한다. 상기 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 식물체의 염 또는 가뭄 스트레스 내성을 증가시키는데 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 벡터 구축 및 벼로의 형질전환

과발현 벡터의 구축을 위해, OsWOX13의 cDNA를 바이너리 벡터(pSB11 벡터로부터 유도함, 상세한 구성 요소들은 도 1a 참고)에 Gateway technique(Invitrogene)에 의해 삽입했다. OsWOX13의 발현은 건조 특이적 프로모터(constitutive promoter)인 Rab21에 의해 구동되었다. 이어서, 구축물을 트리페어런탈 메이팅(triparental mating)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) LBA 4404로 도입하고, 선행 기술(Jang et al ., 1999, Mol . Breed. 5: 453-461)에 기재된 바와 같이 성숙 종자(Oriza sativa L. cv. Nakdong)로부터 배 발달 캘러스로 형질도입했다.

2. 반정량역전사효소 중합효소연쇄반응( semi - quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction , sqRT - PCR )을 이용한 DNA 증폭

총 RNA를 TriReagent (Molecular Research Center, Inc., USA)를 이용하여 제조사의 권장 방법에 따라 추출하였다. 5㎍의 총 RNA를 이용하여 RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, USA)을 이용하여 First-strand cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 2배로 희석하여 사용하였다. 유전자 특이적인 프라이머는 Primer Designer 4 software (Sci-ed. Software, NC, USA) 또는 Primer-BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov) 프로그램을 이용하여 디자인하였다. PCR 반응은 총 볼륨 20㎕에 맞추어서 1㎕ cDNA 주형 DNA, 0.25 pM 유전자 특이적인 프라이머와 10㎕의 2x PCR master mix (GeneAll Biotechnology Co., ltd, South Korea)을 넣어서 준비하였다. PCR 반응은 초기 94℃에서 2분 동안 가열하고 이어서 다음의 반응, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 주기로 25-35회를 진행하였다. 반응액의 9.5㎕를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 유비퀴틴을 대조구로 하여 각 밴드의 세기를 MultiGauge v2.3 software (Fujifilm, Japan)로 정량하였다. 모든 실험에 대해서 2번의 생물학적인 반복과 한번의 기술적 반복을 실시하였다.

3. 외부 도입유전자의 검출

형질전환체의 T1 종자를 선발시료 포스피노트리신(phosphinotricin)을 4 mg/ℓ의 농도로 넣은 MS0 (Murashige and Skoog 1962 Physiologia Plantarum 15:473-497) 아가 배지에서 2일 동안 암배양 후 2일 동안 빛이 있는 조건에서 발아시켰다. 발아된 식물체는 온실로 옮겨져 화분에서 길러졌다. 14일 된 벼 잎에서 게놈 DNA를 뽑아서 삽입된 유전자의 수와 삽입 위치는 T-DNA 주변부의 염기서열로 결정하였다. 도입된 유전자가 발현하는지를 살펴보기 위해서 2주 된 어린 벼를 공기 중에서 3시간 동안 말린 후 위의 방법과 같이 총 RNA를 추출하였다.

4. 환경 스트레스 하에서의 벼 생장 관찰

벼 종자는 5x5x6 cm 크기의 화분에 12개를 심고 온실에서 16시간의 빛과 8시간의 어둠 사이클로 키워졌다. 환경 스트레스에 대해서 알아보기 위하여 4주 된 식물체가 토양에서 뽑혀서 처리되었다. 염에 대한 처리를 위해서 이 식물체는 400 mM NaCl 용액에 넣었다. 건조에 대한 처리를 위해서는 물을 모두 제거한 후에 식물체를 50㎖ 캡튜브에 넣은 후에 종이로 덮었다. 너무 빠른 수분 손실을 막기 위하여 4 ㎖의 물이 각 튜브에 가해졌다. 그 후에 식물체가 공기 중에서 마르도록 진행하였다. 형질전환체와 대조구인 비형질전환체 벼 잎이 마르는 정도가 차이가 있을 때 실험에 사용되었다. 염해와 건조 스트레스에 대해서 각각 3시간, 4시간 정도 소요되었다.

생존율의 관찰은 4주 동안 키운 식물체를 염해를 위해서는 400 mM NaCl 용액을 처리한 후에 실시하였다. 건조 스트레스는 공기 중에 놓아둠으로써 관찰하였다. 실험이 시작된 후 염해는 3일 후에 건조 스트레스는 1일 후에 식물체를 정상 토양으로 옮겨 7일 동안 관찰하면서 생존 개체수를 측정하였다.

실시예 1. OsWOX13 , OsDREB1A 및 OsDREB1F 는 정상조건에서는 상관관계가 없다.

단백질 결합실험을 통해서 OsWOX13의 결합부위가 ATTGATTG일 가능성을 제기하였다. 건조 스트레스에 대해서 반응하는 두 전사인자 OsDREB1A와 OsDREB1F는 각 유전자의 2kb 프로모터 내에 이들 엘리먼트를 가지고 있다. 그러나 정상 상태에서 자란 벼에서는 이들 유전자와 OsWOX13간에 아무런 상관관계가 없는 것으로 확인되었다(데이터 미제시).

실시예 2. OsWOX13 형질전환체의 생성

벼의 rab21은 건조 스트레스나 ABA에 의해서 유도되는 것이 알려져서 이 프로모터를 이용하여 형질전환체가 생성되었다(Reddy et al. 2002, Genome 45:204-211). 30 라인의 형질전환체가 생성되어 그 중 25 라인이 임실가능하였다. T-DNA 측면 염기서열을 분석함으로써 도입유전자의 카피(copy) 숫자와 삽입위치가 결정되었다. 이들 라인 중에서 1 카피를 가진 다섯 개의 형질전환체가 얻어졌다(표 1). 이들 라인들에 대해서 벡터 특이적인 프라이머(도 1의 F-attB2 프라이머 세트, 5'-AATCAGATAGGCCGCTTCAC-3'(서열번호 3) 및 5'-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'(서열번호 4))를 이용하여 반정량 PCR을 실시하였다. 도 1b에서와 같이 다섯개 형질전환체에서 벡터 특이적인 유전자가 발현되었다. rab21 유전자는 비스트레스 조건에서 적게 발현되었으나 건조 스트레스에서 과량으로 유도되었다. 따라서, OsWOX13 역시 건조 스트레스에 의해서 유도되었으며 그 유도량이 외부벡터에 의한 발현양과 거의 상관관계를 유지하는 것을 알 수 있다.

OsWOX13 유전자 발현용 재조합 벡터의 벼 염색체로의 삽입 자리

Transgenic line	Chromosome	Site	type	Gene _ id	Description
1	1	23540160	Intergenic	Os01t0570800-01 upstream 6.887kb	IQ calmodulin-binding region domain containing protein.
3	2	29577032	Intergenic	Os02t0698800-01 upstream 5.803kb	WRKY transcription factor 66.
8	6	25925830	Intergenic	Os06t0622800-01 upstream 2.074kb	Armadillo-type fold domain containing protein.
13	11	26066958	3'Downstream	Os11t0614800-00 downstream 0.128kb	Similar to Cyclin-dependent kinase inhibitor 7.
30	2	306901	Intergenic	Os02t0105750-00 upstream 2.599kb	Similar to 40S ribosomal protein S14.

실시예 3. 형질전환체가 환경 스트레스에 대해서 더 좋은 효능을 보였다.

발아 후 4주된 어린 벼에 대해서 야생형 일미와 형질전환 과발현체(W13)에 대해서 염해와 건조 스트레스를 처리하였다. 식물체가 400 mM NaCl 용액에 3시간 노출되었을 때 늙은 잎은 시들기 시작하고 어린 잎들은 말리기 시작하였다. 야생형 일미는 완전히 마른 반면에 W13 잎들은 여전히 열려 있었다(도 2b). 야생형 일미에 비해서 형질전환체는 좀더 정상적인 성장 반응을 보였다. 반정량 PCR을 하였을 때 OsWOX13의 발현양이 형질전환체에서 현저히 높았다(도 3).

건조 스트레스에 대해서도 염해와 비슷한 경향을 보였다(도 2c). 스트레스 시작 후 야생형 일미는 4 시간만에 벼잎이 완전히 마른 반면 W13 잎들은 여전히 정상적인 모습을 보였다. 반정량 PCR에서도 이들의 외부 도입 벡터에 의한 유전자 발현이 이루어지고 있었다(도 3의 오른쪽 패널).

벼잎 말림 후에 시들음 현상이 이루어진다. 일단 시들게 되면 이 현상을 다시 역전시키는 것은 매우 어렵다. 따라서 잎의 마름 현상을 줄이게 되면 시들음을 지연시킬 수 있으며 식물의 생존율을 높혀 준다. 형질전환체에서 스트레스 처리 후에 정상으로 돌아오는 생존율이 어느 정도 빠르게 진행되는지 조사하였다. 이를 위해서 4주 된 어린 벼를 한발에 하루 처리하였다. 이 조건에서 일미의 모든 잎들이 완전히 말리고 시들었으나 W13 형질전환체는 같은 조건에서도 몇몇 잎이 말리지 않고 시들지도 않았다(도 4, 건조(air dry)). 다시 2일간 물을 주면서 회복을 관찰하였다. 야생형 일미의 경우 완전히 시들어 버렸으나 W13 잎의 경우 다시 회복이 되었다. 형질전환체의 회복이 야생형 일미에 비해서 매우 빨랐으며 7일간 물을 주면서 회복을 관찰한 결과 야생형 일미는 50%가 회복한 반면, 형질전환체는 80%가 회복되었다(표 2, 건조처리).

4주 된 벼에 대해서 염해 처리를 실시하였다. 3일간의 처리에 의해서 야생형 일미는 잎 끝에서 밑부부까지 완전히 말렸으나 W13의 반이상은 그대로 유지되었다 (도 4, NaCl). 이후 담수 조건으로 6일 동안 옮겨졌으며 이때 W13은 회복된 반면 야생형 일미는 그렇지 못하였다. 12일 후에는 야생형 일미는 24개 중에서 4개 (16.7%)만이 W13은 25-41.7%가 각각 회복되었다(표 2, 염).

건조 및 염 스트레스 조건에서 형질전환 식물체의 생존률

처리		rab21 :: OsWOX13
	IM	1-1-1	8-4-1	30-5-1
건조( Drought )	54.2	83.3	91.7	83.3
염( Salt )	16.7	33.3	41.7	25.0

실시예 4. OsWOX13 의 과발현에 의해서 OsDREB1A 및 OsDREB1F 의 발현이 유도되었다.

이전 실험으로 OsWOX13의 잠정적 결합부위는 ATTGATTG 모티프이다. OsDREB1A는 이 모티프를 -1561에 OsDREB1F는 -1660 부위에 가지고 있다. 따라서 이들 전사인자는 OsWOX13의 잠정적 타깃이 될 수 있다. 이들이 OsWOX13의 과발현 벼에서 유도되는지 살펴보았다. 스트레스가 가해지지 않은 조건에서는 OsDREB1A와 OsDREB1F가 많이 발현되지 않았다. 하지만 염해와 스트레스가 가해졌을 때 OsDREB1A는 모든 형질전환체에서 발현이 증가했다. 한발 스트레스에 대해서는 1, 8 번 라인에서 발현이 유도되었다. 이에 비해서 OsDREB1F는 염해와 한발 스트레스에 대해서 모두 발현이 유도되었다. 그러므로 형질전환체의 염해와 한발에 대한 저항력의 증가는 OsWOX13의 OsDREB1A와 OsDREB1F에 대한 조절과 연관이 높을 가능성을 제시한다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation <120> OsWOX13 gene from rice for increasing environmental stress resistance of plant and uses thereof <130> PN15104 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1769 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gcccaatact gctcctacaa agacactgcc acattccttc tccttcctcc tgcatactgt 60 ctctctctct ctctctatct gatcagctgt tccgcttcct cctcttcttc tctcccccaa 120 ccccgtagcc ctcccaccca tcgagccagg cggcggcgcg acggccggtg gctaaggcgg 180 cggccggtgc caaaatctcg agcaatcgcg tcgcgccgtc tggccggctt gcgacatcgc 240 tcgcccgaga gcgtcgtcgt cttcgagctt gtgccgcgcg gcgccgtcgc cgcgtggtcc 300 gagggccccg tgccaccgcg tgcagagggc agaggcccat cgcctcctcc tcgagccacc 360 gcgctgccgt gtgccgtccc ccttgtcgtc ctcgagcccc tgcgtcgccg ccggccgccg 420 gggctcctcc tcctcgtcct cctcgtcatc gacgccccaa tcggcaccgc ctcctggtcg 480 ttaaaaccat cctcgggcct ttcgccaatt ggaaggcgcc atcttttccg cattctttcc 540 atccggattc cggccgctgt tgctgtctgg cggaatatct gtttcgccag attttcttgc 600 gtttcgattt ctttttatta ttttcctgag agagagagag agagagagag agagagagag 660 agagagagag agagagagag ggttccttcc atttcgctgc tgcgccaaag aacacaactt 720 tcccaattcc ttttcgcctc cctgtagagg catggagtgg gacaaggcca aggcgtcctc 780 cggcgaggcg gtggacgaca ggggcggagg ggaaggaggg ctcgggtacg tgaaggtgat 840 gacggacgag cagatggagg tgctccggaa gcagatctcc atctacgcca ccatctgcga 900 gcagctcgtc gagatgcacc gcgccctcac cgcgcagcag gactccattg caggaatgag 960 gcttggtaat ctgtactgtg atcctctaat ggttcccgga ggtcacaaga tcacagcaag 1020 gcagcgatgg acaccaaccc caatgcagtt gcagattctt gagaacatct ttgaccaagg 1080 caatggaaca ccaagcaagc aaaagataaa ggacataaca gcagagctct cacagcatgg 1140 ccagatctca gagacaaatg tctataactg gttccagaac aggcgggcac gatcgaaacg 1200 gaagcaagct gctttaccaa ataataatgc agaatctgaa gctgaagcgg atgaggagtc 1260 cccaactgac aaaaaaccca aatcagatag gccgcttcac cagaacatag ccatgagaga 1320 tcacaatagc gaaaggatct cggagatgca ccactttgac acggagcatg agcaaatccg 1380 tcgtatgatg tatgcatcca atgacagtag ctcgcgatcg tcaggcagtt tgggccagat 1440 gtccttctac gacaatgtta tgtcaaatcc aagaatcgat catttccttg gtaaggtgga 1500 gagccccggg agcttccccc acatgcgatc cggtgaaagc tttgatatgt attgatgacg 1560 cggcaattct ggattctggt tactagaaaa ttggagtttc ttcgattgtg aagatcattg 1620 agttggagat tagacaatgc ttgttgatga tactatgggc atgttggcaa gtggcatggt 1680 ttgccagatt ttgactaaac caaatgttgc ttcttgacta tgtacaatcc tctatagctt 1740 caatgagcag ttttccctat gttgtcctc 1769 <210> 2 <211> 267 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Glu Trp Asp Lys Ala Lys Ala Ser Ser Gly Glu Ala Val Asp Asp 1 5 10 15 Arg Gly Gly Gly Glu Gly Gly Leu Gly Tyr Val Lys Val Met Thr Asp 20 25 30 Glu Gln Met Glu Val Leu Arg Lys Gln Ile Ser Ile Tyr Ala Thr Ile 35 40 45 Cys Glu Gln Leu Val Glu Met His Arg Ala Leu Thr Ala Gln Gln Asp 50 55 60 Ser Ile Ala Gly Met Arg Leu Gly Asn Leu Tyr Cys Asp Pro Leu Met 65 70 75 80 Val Pro Gly Gly His Lys Ile Thr Ala Arg Gln Arg Trp Thr Pro Thr 85 90 95 Pro Met Gln Leu Gln Ile Leu Glu Asn Ile Phe Asp Gln Gly Asn Gly 100 105 110 Thr Pro Ser Lys Gln Lys Ile Lys Asp Ile Thr Ala Glu Leu Ser Gln 115 120 125 His Gly Gln Ile Ser Glu Thr Asn Val Tyr Asn Trp Phe Gln Asn Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Lys Arg Lys Gln Ala Ala Leu Pro Asn Asn Asn Ala 145 150 155 160 Glu Ser Glu Ala Glu Ala Asp Glu Glu Ser Pro Thr Asp Lys Lys Pro 165 170 175 Lys Ser Asp Arg Pro Leu His Gln Asn Ile Ala Met Arg Asp His Asn 180 185 190 Ser Glu Arg Ile Ser Glu Met His His Phe Asp Thr Glu His Glu Gln 195 200 205 Ile Arg Arg Met Met Tyr Ala Ser Asn Asp Ser Ser Ser Arg Ser Ser 210 215 220 Gly Ser Leu Gly Gln Met Ser Phe Tyr Asp Asn Val Met Ser Asn Pro 225 230 235 240 Arg Ile Asp His Phe Leu Gly Lys Val Glu Ser Pro Gly Ser Phe Pro 245 250 255 His Met Arg Ser Gly Glu Ser Phe Asp Met Tyr 260 265 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aatcagatag gccgcttcac 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 accactttgt acaagaaagc tgggt 25

Claims (13)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsWOX13(Oryza sativa WUSCHEL-related homeobox) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 염 또는 가뭄 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsWOX13(Oryza sativa WUSCHEL-related homeobox) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 삭제
8. 제5항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 염 또는 가뭄 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제5항의 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체.
10. 제9항에 있어서, 상기 식물체는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 것을 특징으로 하는 식물체.
11. 제9항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
12. 제9항에 따른 형질전환 식물체의 형질전환된 종자.
13. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래 OsWOX13 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물.

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