CN116640780B - 西番莲PeWOX-67基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种西番莲PeWOX‑67基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeWOX‑67基因，在干旱、高温等胁迫下西番莲中PeWOX‑67基因转录水平上调，研究显示该基因能够显著提高酵母干旱胁迫下的生存能力，增加植物主根长度、减少植物根毛等，而且还能够提高植物的抗旱性。本发明为提高酵母抗逆性、改变植物根系和提高植物抗逆性等方面的研究提供新的候选基因。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种西番莲PeWOX-67基因及其应用。
背景技术
西番莲是一种多年生常绿攀缘木本藤蔓植物，是一种芳香可口的水果，被誉为“果汁之王”。又称百香果、巴西果、藤桃、心莲、西菊、枝莲、酸茄花、钟表草。它的天然原汁色泽艳丽，具有独特浓郁的芳香风味和丰富的营养。西番莲果实不仅营养价值高，还有防病健身的功效。据测定，西番莲汁含有60多种挥发性化合物，可溶性固物含量高达10-14％，有机酸、氨基酸种维生素和矿物质元素含量均十分丰富，它作原料，可加工成果汁、果露、果酱、果冻等产品，具有美容养颜、清暑开胃、消除疲劳、提神醒酒、消炎祛斑、降脂降压、防止动脉硬化等功效。由于西番莲的应用越来越广泛，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示西番莲基因表达和调控的机理。因此，对西番莲中重要性状基因定位、克隆、功能等，对于西番莲的综合开发利用具有重要的意义。
西番莲是浅根植物，水平根达4-5 m，在种植过程中整个生育期必须有充足的水分供应。在生长前期需要大量的水分满足树体的萌芽和抽梢的消耗，在开花座采、果实膨大的时候更需要较多水分。干旱对西番莲植株生长有抑制作用。一般在年降雨量1500-2000mm且分布均匀的条件下，生长良好。但年降雨量不宜少于1000mm。因此，提高百香果对干旱胁迫的抗性，减少对水资源的过度依赖，是实现百香果产业持续健康发展的关键因素，也是百香果产业发展亟待解决的关键问题。因此，通过挖掘具有抗逆功能的西番莲基因，进一步验证其在提高西番莲抗干旱及其他非生物胁迫上的调控功能，为研究百香果的抗性机制并利用其进行遗传改良提供了良好的基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种西番莲PeWOX-67基因及其应用。
本发明的第一个方面是提供一种西番莲PeWOX-67基因，其ORF序列核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述西番莲PeWOX-67基因编码的蛋白质。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeWOX-67基因编码区的重组载体。
其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采pMD 19-T载体、pCAMBIA1304表达载体和pYES 2表达载体，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
优选地，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，西番莲PeWOX-67基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。
优选地，所述重组载体的原始载体为pYES 2表达载体，西番莲PeWOX-67基因编码区位于pYES 2表达载体的HinIII和BamHI两限制性内切酶位点之间。
本发明的第四个方面是提供含有第一个方面所述西番莲PeWOX-67基因编码区的宿主菌。
本发明的第五个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeWOX-67基因编码区的表达盒。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高酵母抗干旱能力中的应用。
优选地，所述酵母为酿酒酵母，比如INVSc 1菌株等。
本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在增加植物主根长度、和/或减少植物根毛中的应用。
在本发明一个具体的实施方式中，所述植物为拟南芥。
本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高植物抗旱性中的应用。
在本发明一个具体的实施方式中，所述植物为拟南芥。
本发明的第九个方面是提供一种引物对，所述引物对为ATGACGGGTGATTATCCGTTT和TCAGACAAAGGACCAGTTGATGA，或者所述引物对为TGCCATGGATGACGGGTGATTATCCGTTT和CGGACTAGTGACAAAGGACCAGTTGATGAACA，或者所述引物对为CAAGCTTATGACGGGTGATTATCCGTTT和CGGGATCCGACAAAGGACCAGTTGATGAACA。
本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeWOX-67基因，在干旱、高温等胁迫下西番莲中PeWOX-67基因转录水平上调，研究显示该基因能够显著提高酵母干旱胁迫下的生存能力，增加植物主根长度、减少植物根毛等，而且还能够提高植物的抗旱性。本发明为提高酵母抗逆性、改变植物根系和提高植物抗逆性等方面的研究提供新的候选基因。
附图说明
图1为PeWOX-67在不同胁迫下紫果西番莲叶片的差异表达分析。
图2为PeWOX-67在紫果西番莲不同果实成熟阶段的差异表达分析。
图3为PeWOX-67在紫果西番莲不同部位差异表达分析。
图4为在干旱胁迫下西番莲PeWOX-67基因对酵母的影响。
图5为转PeWOX-67基因的拟南芥在MS培养基上培养5天后主根情况。
图6为转PeWOX-67基因的拟南芥在MS培养基上培养5天后根毛情况。
图7为转PeWOX-67基因的拟南芥在干旱胁迫下的生长情况和生理指标测量结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：西番莲PeWOX-67基因的克隆
采用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术，从紫果西番莲品种中扩增得到PeWOX-67全长cDNA。具体操作如下：
1、提取紫果西番莲幼苗中的总RNA，反转录得到cDNA第一链。
2、以cDNA第一链为模板，以ATGACGGGTGATTATCCGTTT和TCAGACAAAGGACCAGTTGATGA为引物，通过PCR扩增反应获得西番莲PeWOX-67基因的cDNA序列。
反应体系为：模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。
PCR扩增程序为：94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。
3、回收扩增产物，并克隆至pMD 19-T载体（Promega，麦迪逊，WI，USA）中（pMD 19-T-PeWOX-67载体），并在ABI PRISM 310遗传分析仪（PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上测序。测序结果表明，克隆获得西番莲PeWOX-67基因，其ORF序列核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2：西番莲PeWOX-67基因的表达分析
将商品名为“台农”的紫果西番莲（Passiflora edulis）的健康西番莲幼苗在培养箱（30 ℃，200μmol·m-2·s-1光强，12小时光照/12小时黑暗循环，70%相对湿度）生长至约1m的高度，并具有8-10片功能性叶片。 将植物用于各种非生物胁迫处理：
①干旱胁迫：将植株进行干旱处理，当土壤水分为50%和10%时分别取样；
②盐处理：用300mM的盐溶液处理3天和10天分别取样；
③低温处理：将植株置于0℃除了20和48小时分别取样；
④高温处理：将植株置于45℃ 2，4和24小时分别取样。
利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测PeWOX-67基因在不同非生物胁迫下叶片中西番莲PeWOX-67基因的表达情况。结果如图1所示，PeWOX-67均能受到各种非生物胁迫的诱导表达，其中在干旱以及低温处理时被高度诱导表达。
对正常生长条件下对于成熟期间的西番莲果实取样，选择三个果实成熟阶段的果实（T1，收获前两周，果皮是绿色的；T2，采收时果皮红紫色，无皱缩；T3，在30 °C下收获后一周，果皮已经收缩）。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测果实成熟3个阶段，西番莲PeWOX-67基因的表达情况，结果如图2所示，该基因在果实成熟三个时期的表达差异不大。
对正常生长条件下已经开花结果的西番莲的不同组织（叶、根、茎、果实）取样。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测PeWOX-67基因在不同组织（叶、根、茎、果实）中的表达。结果如图3所示，该基因在根和茎中表达最高，其次是果，在叶片中的表达量最低。
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）操作如下：将组织和叶冷冻，并使用植物RNA分离试剂盒以三个生物学重复提取总RNA。 在Light 96（Roche）上使用SYBR ® Premix Ex Taq™（TaKaRa，Japan，Tokyo）化学进行qRT-PCR分析。 使用2−∆∆CT方法计算相对表达水平。引物为F:TGAATCGGTGGTGACGAGTGGTC, R:CAGGCTTCATACCAGGCATTTGG，PCR反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。PCR反应程序如下：94℃变性4 min，94℃变性30秒，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min，共35个循环。
实施例3：重组载体的构建
以pMD19-T-PeWOX-67质粒为模板，以引物TGCCATGGATGACGGGTGATTATCCGTTT（划线为NcoI酶切位点）和CGGACTAGTGACAAAGGACCAGTTGATGAACA（划线为SpeI酶切位点），进行PCR扩增。反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经NcoIHinIII和SpeIBamHI双酶切后连接至经相同酶切后的pCAMBIA1304表达载体，得到pCAMBIA 1304-PeWOX-67载体。
以pMD19-T-PeWOX-67载体为模板，以引物CAAGCTTATGACGGGTGATTATCCGTTT（划线为HinIII酶切位点）和CGGGATCCGACAAAGGACCAGTTGATGAACA（划线为BamHI酶切位点），进行PCR扩增。反应体系为模板1ul，5'端引物1ul，3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经HinIII和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的pYES 2表达载体，得到pYES 2-PeWOX-67载体。
实施例4：PeWOX-67在酵母中的功能互补
将pYES 2-PeWOX-67和pYES 2载体（对照）分别转染到INVSc 1菌株（酿酒酵母）中。为了进行酵母互补测定，将酵母液在SD-Ura液体培养基中在30 ° C下培养，并分别在18%PEG中处理（0、12、24、36、48、60 h）。实验重复了三次。
将pYES 2-PeWOX-67和pYES 2空载体（对照）转化到INVSCl中用于干旱胁迫实验，结果如图4所示（图4中1×、10×、100×、1000×分别代表将菌液稀释1倍，10倍，100倍，1000倍）。结果表明，随着处理时间的增加，空载体和转基因酵母的生长越来越受到限制。在18%PEG中处理60 h，只有转化酵母能生长。这表明PeWOX-67在干旱胁迫下发挥了一定的作用。
实施例5：对转基因系的根系的影响
将pCAMBIA 1304-PeWOX-67转化农杆菌，然后将转化后的农杆菌用在28 °C下在分别含有Kan和Rif抗生素的YEB培养基中振荡，并添加到拟南芥转基因浸润溶液（1/2 MS，50g/L）中至0 D 600=0.8-1.0。使用花序浸渍转化拟南芥，我们获得了三个独立的PeWOX-67转基因拟南芥系，命名为L1、L2和L3。将野生型（WT)和获得的3个转基因拟南芥分别播种在MS培养基中，5天后分别测量各株系的根长和根毛数量，结果如图5-6所示。
结果表明，转基因株系的主根长度均长于野生型（图5），而根毛数量少于野生型株系（图6），经统计数据表明，转基因植株的主根平均长度约为野生型植株的1.5倍，而转基因植株的平均根毛数量约为野生型的0.48倍。
实施例6：转基因系和WT的干旱胁迫处理
将实施例5获得的转基因拟南芥生长4周后，在培养箱中在23 °C下无水处理12天并恢复6天，观察拟南芥的生长情况，并对植物进行生理指标测量。结果如图7所示。将生长4周的转基因和野生型植物（WT）在没有水的情况下处理12天并恢复6天，转基因植物比野生型植物生长更强壮。在经受干旱胁迫和复水后对植物进行生理指标测量，在正常生长条件下，WT和转基因植物的MDA（丙二醛）和PRO（脯氨酸）含量没有显著差异，而干旱胁迫和复水处理后，转基因植株的MDA含量显著低于野生型，而PRO含量显著高于野生型（图7）。 结果表明，PeWOX-67可以提高植物的抗旱性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种西番莲PeWOX-67基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述西番莲PeWOX-67基因编码的蛋白质。
3.含有权利要求1所述西番莲PeWOX-67基因编码区的重组载体或宿主菌。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，西番莲PeWOX-67基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。
5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pYES2表达载体，西番莲PeWOX-67基因编码区位于pYES2表达载体的HinIII和BamHI两限制性内切酶位点之间。
6.如权利要求1所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体在提高酵母抗干旱能力中的应用。
7.如权利要求1所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体在增加植物主根长度和/或减少植物根毛中的应用，所述植物为拟南芥。
8.如权利要求1所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体在提高植物抗旱性中的应用，所述植物为拟南芥。
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