CN116926086B - 西番莲PeARF-1基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种西番莲PeARF‑1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeARF‑1基因，在干旱、低温等胁迫下西番莲中PeARF‑1基因转录水平上调，说明该基因能够提高植物的抗旱性和抗寒性等，研究显示该基因还能够显著提高酵母干旱、低温胁迫下的生存能力，增加植物叶片厚度、使植物叶片卷缩、叶片变窄（叶片长度基本不变，宽度减小）等。本发明为提高酵母抗逆性、改变植物叶片和提高植物抗逆性等方面的研究提供新的候选基因。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种西番莲PeARF-1基因及其应用。
背景技术
西番莲是一种多年生常绿攀缘木本藤蔓植物，是一种芳香可口的水果，被誉为“果汁之王”。又称百香果、巴西果、藤桃、百香果、心莲、西菊、枝莲、酸茄花、钟表草。它的天然原汁色泽艳丽，具有独特浓郁的芳香风味和丰富的营养。西番莲果实不仅营养价值高，还有防病健身的功效。据测定，西番莲汁含有60多种挥发性化合物，可溶性固物含量高达10-14％，有机酸、氨基酸种维生素和矿物质元素含量均十分丰富，它作原料，可加工成果汁、果露、果酱、果冻等产品，具有美容养颜、清暑开胃、消除疲劳、提神醒酒、消炎祛斑、降脂降压、防止动脉硬化等功效。由于西番莲的应用越来越广泛，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示西番莲基因表达和调控的机理。因此，对西番莲中重要性状基因定位、克隆、功能等，对于西番莲的综合开发利用具有重要的意义。
西番莲是浅根植物，水平根达4-5 m，在种植过程中整个生育期必须有充足的水分供应。在生长前期需要大量的水分满足树体的萌芽和抽梢的消耗，在开花座采、果实膨大的时候更需要较多水分。干旱对西番莲植株生长有抑制作用。一般在年降雨量1500-2000mm且分布均匀的条件下，生长良好。但年降雨量不宜少于1000mm。土壤干旱是全球性的自然灾害，严重制约着农业生产的持续性发展。干旱会严重影响百香果植株的正常生长、开花、导致果实变皱，植株枯死。高盐胁迫对西番莲的正常生长发育也危害极大，土壤盐分过多使植物根际土壤溶液渗透势降低，造成其吸收水分困难，使植物处于生理干旱状态。西番莲是喜温、喜光的植物，一般在热带、亚热带地区栽培，其最佳生长环境温度约为20-30℃，年平均气温18℃以上的地区最为适宜种植，最冷月平均气温在8 ℃以上，在广西、贵州、福建、云南等部分种植区域，常遇冻害问题，影响面积大概占国内种植面积的30%以上。低温严重制约着百香果的生长发育，会使组织细胞中的水分结冰霜冻，使其收到损伤或死亡，轻则叶片受伤、落叶落果，重则茎杆冻裂、根部受损，全株死亡。紫果品种能经受-3℃的低温，仅是秋梢幼嫩组织表现出轻微冻害。但如果长时间让其处于0℃以下的低气温环境中，其树冠也容易被冻枯致死，对持续低温忍耐力较强于黄金百香果。黄金百香果在15℃以下时生长缓慢，低于10℃基本停止生长，6℃以下嫩芽出现较微寒害，4℃时叶片和藤蔓嫩梢干枯。非生物胁迫严重影响西番莲的正常生长，是西番莲产业中急需解决的关键问题。因此，通过挖掘具有抗逆功能的西番莲基因，进一步验证其在提高西番莲抗干旱等非生物胁迫上的调控功能，为研究百香果的抗性机制并利用其进行遗传改良提供了良好的基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种西番莲PeARF-1基因及其应用。
本发明的第一个方面是提供一种西番莲PeARF-1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述西番莲PeARF-1基因编码的蛋白质。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeARF-1基因编码区的重组载体。
其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采pMD 19-T载体、pCAMBIA1304表达载体和pYES 2表达载体，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
优选地，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，西番莲PeARF-1基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。
优选地，所述重组载体的原始载体为pYES 2表达载体，西番莲PeARF-1基因编码区位于pYES 2表达载体的HinIII和BamHI两限制性内切酶位点之间。
本发明的第四个方面是提供含有第一个方面所述西番莲PeARF-1基因编码区的宿主菌。
本发明的第五个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeARF-1基因编码区的表达盒。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeARF-1基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高酵母抗旱性、和/或抗寒性中的应用。
优选地，所述酵母为酿酒酵母，比如INVSc 1菌株等。
本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeARF-1基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在增加植物叶片厚度、和/或使植物叶片卷缩、和/或使叶片变窄（叶片长度基本不变，宽度减小）中的应用。
在本发明一个具体的实施方式中，所述植物为拟南芥。
本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeARF-1基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高植物抗旱性、和/或抗寒性中的应用。
本发明的第九个方面是提供一种引物对，所述引物对为ATGGCTTCTCCAGAGATGTCGAACAAG和TCAAAAATTGACCGGGCTGGAA；或者所述引物对为AGGTCATTCCATCCATTCCGGCT和CACGATCTCCTTTACGGGGAA；或者所述引物对为TGCCATGGATGGCTTCTCCAGAGATGTCGAACAAG和CGGACTAGTAAAATTGACCGGGCTGGAA；或者所述引物对为CAAGCTTATGGCTTCTCCAGAGATGTCGAACAAG和CGGGATCCAAAATTGACCGGGCTGGAA。
本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeARF-1基因，在干旱、低温等胁迫下西番莲中PeARF-1基因转录水平上调，说明该基因能够提高植物的抗旱性和抗寒性等，研究显示该基因还能够显著提高酵母干旱、低温胁迫下的生存能力，增加植物叶片厚度、使植物叶片卷缩、叶片变窄（叶片长度基本不变，宽度减小）等。本发明为提高酵母抗逆性、改变植物叶片和提高植物抗逆性等方面的研究提供新的候选基因。
附图说明
图1为PeARF-1基因在不同非生物胁迫下的表达情况。
图2为PeARF-1基因在三个果实成熟时期的qRT-PCR结果。
图3为非生物胁迫下转PeARF-1基因酵母中的生长情况。
图4为转PeARF-1转基因拟南芥的叶片表型（A、B）以及叶片长和宽（C）。
图5为转PeARF-1基因的拟南芥在干旱胁迫下的生长情况和生理指标测量结果。
图6为转PeARF-1基因的拟南芥在低温胁迫下的生长情况和生理指标测量结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：西番莲PeARF-1基因的克隆
提取紫果西番莲幼苗中的总RNA，反转录得到cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，以ATGGCTTCTCCAGAGATGTCGAACAAG和TCAAAAATTGACCGGGCTGGAA为引物，进行PCR扩增反应。
反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。
PCR扩增程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。
回收扩增产物，并克隆至pMD 19-T载体（Promega，麦迪逊，WI，USA）中（pMD 19-T-PeARF-1载体），并在ABI PRISM 310遗传分析仪（PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上测序。测序结果表明，克隆获得西番莲PeARF-1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2：西番莲PeARF-1基因的表达分析
1、西番莲PeARF-1基因在不同非生物胁迫下的表达分析
将商品名为“台农”的紫果西番莲（Passiflora edulis）的健康西番莲幼苗在培养箱（30 ℃，200μmol·m-2·s-1光强，12小时光照/12小时黑暗循环，70%相对湿度）生长至约1m的高度，并具有8-10片功能性叶片。 将植物用于各种非生物胁迫处理：
①干旱胁迫：将植株进行干旱处理，当土壤水分为50%和10%时分别取样；
②盐处理：用300mM的盐溶液处理3天和10天分别取样；
③低温处理：将植株置于0℃除了20和48小时分别取样；
④高温处理：将植株置于45℃ 2、4和24小时分别取样。
将西番莲进行干旱、高温、低温、高盐胁迫下处理并取样进行转录组测序分析，利用转录组数据研究 PeARF-1在四种非生物胁迫下的表达谱（图1），结果表明，PeARF-1在干旱以及低温处理时被高度诱导表达。说明该基因与西番莲抗旱性和抗寒性相关，可以用于提高西番莲的抗旱性和抗寒性等。
2、西番莲PeARF-1基因在果实成熟过程中的表达分析
对正常生长条件下成熟期间的西番莲果实取样，选择三个果实成熟阶段的果实（T1，收获前两周，果皮是绿色的；T2，采收时果皮红紫色，无皱缩；T3，在30 °C下收获后一周，果皮已经收缩）。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测果实成熟3个阶段，西番莲PeARF-1基因的表达情况，结果如图2所示，该基因与果实成熟呈正相关，该基因在T3 期达到最高表达量。
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）操作如下：将组织和叶冷冻，并使用植物RNA分离试剂盒以三个生物学重复提取总RNA。 在Light 96（Roche）上使用SYBR ® Premix Ex Taq™（TaKaRa，Japan，Tokyo）化学进行qRT-PCR分析。 使用2−∆∆CT方法计算相对表达水平。引物为F:AGGTCATTCCATCCATTCCGGCT, R:CACGATCTCCTTTACGGGGAA，PCR反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。PCR反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min，共35个循环。
实施例3：重组载体的构建
以pMD19-T-PeARF-1质粒为模板，以引物TGCCATGGATGGCTTCTCCAGAGATGTCGAACAAG（划线为NcoI酶切位点）和CGGACTAGTAAAATTGACCGGGCTGGAA（划线为SpeI酶切位点），进行PCR扩增。反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经NcoI和SpeI双酶切后连接至经相同酶切后的pCAMBIA1304表达载体，得到pCAMBIA 1304-PeARF-1载体。
以pMD19-T-PeARF-1载体为模板，以引物CAAGCTTATGGCTTCTCCAGAGATGTCGAACAAG（划线为HinIII酶切位点）和CGGGATCCAAAATTGACCGGGCTGGAA（划线为BamHI酶切位点），进行PCR扩增。反应体系为模板1ul，5'端引物1ul，3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经HinIII和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的pYES 2表达载体，得到pYES 2-PeARF-1载体。
实施例4：PeARF-1在酵母中的功能互补
将pYES 2-PeARF-1和pYES 2载体（对照）分别转染到INVSc 1菌株（酿酒酵母）中。为了进行酵母互补测定，将酵母液在SD-Ura液体培养基中在30 ° C下培养，再进行各种非生物胁迫实验：
①干旱胁迫：在18%PEG中处理0、12、24、36、48、60 小时，实验重复三次；
②盐处理： 在5 mol/L Nacl溶液中处理0、12、24、36、48小时，实验重复三次；
③低温处理：在-20℃处理0、12、24、36、48、60 小时，实验重复三次；
④高温处理：分别在30℃, 40℃, 50℃, 55℃, 60℃温度下各处理2小时，实验重复三次。
将pYES 2-PeARF-1和pYES 2空载体（对照）转化到INVSCl中进行干旱、低温、高温和高盐胁迫，结果如图3所示（图3中1×、10×、100×、1000×分别代表将菌液稀释1倍，10倍，100倍，1000倍）。结果显示，转PeARF-1 基因的酵母在干旱胁迫下的 60h时生长势明显强于对照组。 当在低温胁迫下处理24h，36h，48h，60h时，转PeARF-1酵母在低温下的生长势明显强于对照组，而在高温和高盐胁迫下，转基因酵母和对照组的长势无太大区别，这一结果表明，PeARF-1能提高转基因酵母的抗旱和抗寒性。
实施例5：对转基因植株的影响
将pCAMBIA 1304-PeARF-1转化农杆菌，然后将转化后的农杆菌用在28 °C下在分别含有Kan和Rif抗生素的YEB培养基中振荡，并添加到拟南芥转基因浸润溶液（1/2 MS，50g/L）中至0 D 600=0.8-1.0。使用花序浸渍转化拟南芥，我们获得了PeARF-1转基因拟南芥系。将野生型和获得的转基因拟南芥分别播种在蛭石中，35天后观察转基因拟南芥的生长情况，结果如图4所示。从表型上看，野生型的叶片面积较大叶片相对较薄，转基因植株的叶片卷缩，叶片厚度较大。对野生型和转基因植株的相同部位叶片的长和宽长度进行测量，结果表明，野生型和转基因植株叶片的长度相差不大，而转基因叶片的宽度明显小于野生型植株。
实施例6：转基因系和WT的胁迫处理
干旱胁迫：将在MS培养基上生长2天的野生型植株和转基因植株转移至添加了300mM 甘露醇的MS培养基中模拟干旱处理，观察拟南芥的生长情况，并对植物进行生理指标测量。结果如图5所示，当生长至6天时，在对照组（没有进行干旱胁迫处理正常生长）中，野生型和转基因植株的根长差异不大，当干旱处理后，转基因植株表现出了更好的生长势，其主根长度要长于野生型，对各植株进行丙二醛含量的测定，当植物遭受逆境下胁迫时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。在本研究结果中，当植株正常生长时，野生型和转基因植株中的丙二醛含量差异不大，当植株遭受到干旱胁迫时，野生型和转基因植株的丙二醛含量均上升，与对照组相比，野生型中的丙二醛含量增加得更多且高于转基因植株，因此，当受到干旱胁迫时转基因植株能够降低植株的膜脂过氧化程度，从而提高植株的抗旱性。
低温胁迫：将在MS培养基上23℃条件下生长2天的野生型植株和转基因植株转移至4℃进行低温处理，观察拟南芥的生长情况，并对植物进行生理指标测量。结果如图6所示，当生长至6天时，在对照组（没有进行低温胁迫处理正常生长）中，野生型和转基因植株的根长差异不大，当低温处理后，野生型植株明显被抑制生长，而转基因植株表现出了更好的生长势，其主根长度要长于野生型，对各植株进行丙二醛含量的测定，当植物遭受逆境下胁迫时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。在本研究结果中，当植株正常生长时，野生型和转基因植株中的丙二醛含量差异不大，当植株遭受到低温胁迫时，野生型和转基因植株的丙二醛含量均上升，与对照组相比，野生型中的丙二醛含量增加得更多且高于转基因植株，因此，当受到低温胁迫时转基因植株能够降低植株的膜脂过氧化程度，从而提高植株的抗寒性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种西番莲PeARF-1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述西番莲PeARF-1基因编码的蛋白质。
3.含有权利要求1所述西番莲PeARF-1基因的编码区的重组载体或宿主菌或表达盒。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，所述西番莲PeARF-1基因的编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。
5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pYES 2表达载体，所述西番莲PeARF-1基因的编码区位于pYES 2表达载体的HinIII和BamHI两限制性内切酶位点之间。
6.如权利要求1所述的西番莲PeARF-1基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒、或者如权利要求4所述的重组载体在提高酵母抗旱性和/或抗寒性中的应用。
7.如权利要求1所述的西番莲PeARF-1基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒、或者如权利要求4所述的重组载体在增加植物叶片厚度、使植物叶片卷缩和/或使叶片变窄中的应用，所述植物是拟南芥。
8.如权利要求1所述的西番莲PeARF-1基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒、或者如权利要求4所述的重组载体在提高植物抗旱性和/或抗寒性中的应用，所述植物是拟南芥。
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