CN110106187A

CN110106187A - 一种橡胶树的arf基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN110106187A
Application number: CN201910451819.2A
Authority: CN
Inventors: 李言; 田维敏
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN110106187B

Abstract

本发明提供了一种橡胶树的ARF基因，其为橡胶树生长抑制因子HbARF2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了该HbARF2基因编码的蛋白质及其应用。本发明首次从橡胶树中克隆得到HbARF2基因，该基因为一类转录基因，通过转基因植物验证HbARF2基因能降低茎秆的生长发育，表明该基因对橡胶树茎秆等起着重要的调控作用，而巴西橡胶树作为天然橡胶的主要来源，有6‑8年的非生产生长期，因此研究HbARF2的分子机制，通过基因敲除，进行遗传改良，促进橡胶树的生长，有助于缩短橡胶树的非生产生长期，提高橡胶树的经济效益，同时也为其它目标育种设定提供良好的基础。

Description

一种橡胶树的ARF基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种橡胶树的ARF基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

生长素响应因子(auxin response factor,ARF)是一类能发挥激活或抑制作用的转录因子,能够特异结合生长素初期响应基因启动子中的AuxRE上。通过对生长素合成的调控，影响植物各个阶段的生长发育。ARF激活或抑制靶基因的表达取决于功能结构域与DNA相互作用中间区域的氨基酸序列。ARF蛋白由3个部分组成:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain,DBD)、中间区域(middle region,MR)和C端结构域(Phox and Bem1domain，PB1)。DBD直接参与了与AuxRE的结合；MR为非保守区,激活或抑制靶基因的功能。ARF的C端结构域与Aux/IAA蛋白的III、IV结构域很类似,ARF和Aux/IAA可通过该区域形成二聚体。ARF基因家族存在于很多植物体内，最早是在拟南芥中发现ARF基因，目前已知有23个ARF成员。ARF家族成员在不同植物中数目不同。如水稻、柑橘、番茄、葡萄、和蒺藜苜蓿中分别包含25个、19个、21个、19个和24个ARF家族成员，其数目略有差别。但是，在大豆、玉米、毛果杨、香蕉和棉花中分别包含51个、36个、39个、47个和35个家族成员，数目相对较多，也有数目较少，如黄瓜、巨桉和番木瓜中的ARF成员数量分别为15个、17个和11个。

ARF在植物生长发育、根系的生长发育、子叶发育、叶片衰老、花发育与果实成熟等过程中发挥着重要的调控作用。研究发现番茄SlARF2基因参与调控番茄花器官的衰老和侧根的形成。拟南芥AtARF2,7,19参与调控根的生长发育，AtARF10,16调控根冠的生长发育；AtARF11促进侧根的形成,在激素信号转导途径中发挥关键作用，AtARF7与MYB77互作，促进生长素相应基因的转录来调控根系的生长；AtARF8与bHLH转录因子相互作用，在花瓣发育的早期和后期调控细胞分裂和细胞扩大。芒果(Mangifera indica)中,MiARF2在不定根和根原基的启动与发育过程中起作用。研究表明桃PpARF1～4,6～9,12,14,18可能参与于根的生长发育过程。铁皮石斛DnARF2a在茎中表达积累高。PoptrARF2.1,2.2,3.1,3.4,6.2,6.3在杨树的韧皮部和木质部的丰度较高，可能参与调控韧皮部、木质部的生长发育。在拟南芥等草本植物中研究表明ARF2对根系和花的生长发育有调控作用。在木本植物中通过表达分析推测对韧皮部和木质部的调控作用。而我们通过转基因植物验证HbARF2基因能降低茎秆的生长发育。巴西橡胶树作为天然橡胶的主要来源，有6-8年的非生产生长期。因此研究HbARF2的分子机制，通过遗传改良有助于缩短橡胶树的非生产生长期，提高橡胶树的经济效益。目前，该基因在橡胶树中还尚未报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种从橡胶树中获得的橡胶树生长抑制因子HbARF2基因，以及该基因编码蛋白质与应用。

本发明的第一个方面是提供一种橡胶树的ARF基因，其为橡胶树生长抑制因子HbARF2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的橡胶树生长抑制因子HbARF2基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的橡胶树HbARF2基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从橡胶树树皮中提取总RNA；

(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

(3)设计HbARF2基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，HbARF2基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；

(4)PCR产物连接载体，转化，测序，获得HbARF2基因片段。

本发明的第四个方面是提供一种表达载体，其含有本发明第一个方面所述的橡胶树HbARF2基因。

其中，所述表达载体中的原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pCAMBIA1302载体，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pCAMBIA1302载体，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的ORF经Spe1单酶切后连接到经相同酶切后的表达载体pCAMBIA1302中。

本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的橡胶树HbARF2基因、或者本发明第四个方面所述的表达载体在降低植物茎秆的生长发育中的应用。

本发明的第六个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。

本发明的第七个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示。

本发明的第八个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示。

本发明的第九个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示。

本发明的有益效果：

本发明首次从橡胶树中克隆得到HbARF2基因，该基因为一类转录基因，在植物生长发育和信号转导中起着重要的、不可或缺的作用，通过转基因植物验证HbARF2基因能降低茎秆的生长发育，表明该基因对橡胶树茎秆等起着重要的调控作用，而巴西橡胶树作为天然橡胶的主要来源，有6-8年的非生产生长期，因此研究HbARF2的分子机制，通过基因敲除，进行遗传改良，促进橡胶树的生长，有助于缩短橡胶树的非生产生长期，提高橡胶树的经济效益，同时也为其它目标育种设定提供良好的基础。

附图说明

图1为HbARF2基因的系统进化树分析图。

图2为HbARF2基因在开割和未开割橡胶树热研8-79和热垦525中的表达分析结果。

图3为HbARF2基因对转基因烟草生长的影响，其中，WT为正常烟草，pCAMBIA1302为转化pCAMBIA1302载体烟草，35S::HbARF2为转HbARF2基因烟草

图4为HbARF2基因在6种橡胶树不同杂交组合后代中的表达模式。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

1、橡胶树HbARF2基因的克隆与分析

利用RT-PCR技术从巴西橡胶树品种热研8-79的树皮中克隆获得橡胶树转录因子HbARF2基因，具体实施方案如下：

参照天根RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的操作说明提取橡胶树树皮总RNA。根据Ferments公司试剂盒的操作步骤合成cDNA第一链。依据本实验室转录组数据库，获得注释为ARF的Unigene，借助NCBI数据库搜索比对，初步鉴定为完整的基因序列。以cDNA第一链为模板，以HbARF2-F：ATGGATTCTTCGGAGATTTCAATA和HbARF2-R:CTAACAATTTTCAGTACCATGCGC为引物，通过PCR扩增反应获得转录因子HbARF2基因的cDNA序列，扩增体系:Pyrobest DNA Polymerase(5U·μL^-1)0.5μL，10×Pyrobest Buffer II 5μL，dNTP Mixture(2.5mmol·L^-1)4μL，HbARF2-F(10μmol·L^-1)2.5μL，HbARF2-R(10μmol·L^-1)2.5μL，cDNA模版1μL，灭菌水补足50μL。扩增程序为:95℃预变性3min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min，共32个循环；72℃延伸10min。0.2％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收纯化目的条带，克隆到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆送Invitrogen公司进行测序。利用BLAST检索GenBank数据库进行同源性分析，结果表明克隆了ARF家族基因中的一个完整的阅读框(SEQ ID NO:1所示核苷酸序列)。利用MEGA5.10软件进行多重比对分析并构建系统发育树。结果表明所克隆的ARF基因与拟南芥的AtARF2的同源性较高，于是命名橡胶树的ARF基因为HbARF2(图1)。

2、橡胶树不同组织中HbARF2基因表达分析

在生产中，我们发现开割前的橡胶树热研8-79和热垦525生长都很快，开割后橡胶树热研8-79的生长速度大幅度降低，而热垦525的生长速度也下调，但幅度较小。于是，以开割前后的橡胶树热研8-79和热垦525为材料，对橡胶树转录因子HbARF2基因的表达丰度进行分析。HbARF2基因荧光定量引物序列为：

HbARF2-Q-F：AAAAGGTAGAAAAGTAGTAATGGTTGA，和

HbARF2-Q-R：TTACCCTTTATTGAAATCTCCGAA。

内参基因ACTIN7a(Gene Bank登录号：HQ260674)的引物序列为：

ACTIN7a-F:GGCACTTTGGTACTCAAGTC，和

ACTIN7a-R:GAAGCATCCCAATCACTCTC。

使用BioRad公司的CFX-384荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR,反应程序：95℃预变性30s，94℃5s,60℃20s,72℃20s,进行45个循环，扩增结束后绘制熔解曲线，从50℃逐渐升温至95℃，升温速度0.2℃/s，全过程检测荧光信号。分别检测开割和未开割橡胶树热研8-79和热垦525的韧皮部、形成层和木质部的表达情况。结果表明相对于未开割橡胶树，HbARF2基因在开割1年后的热研8-79的韧皮部、形成层和木质部中的表达极显著上调，上调幅度较大；HbARF2基因在开割1年后的热垦525形成层部的表达极显著上调，上调幅度小于热研8-79，而在韧皮部和木质部没有显著性差异(图2)。开割后，HbARF2基因在热研8-79韧皮部、形成层和木质部中的表达量极显著高于热垦525(图2)。

3、HbARF2基因过表达转基因烟草

已测序验证的质粒为模板，以HbARF2-TR-F：GGACTAGTATGGATTCTTCGGAGATTTC(下划线为Spe1酶切位点)和HbARF2-TR-R：GGACTAGTACAATTTTCAGTACCATGCG(下划线为Spe1酶切位点)为引物，扩增HbARF2基因的ORF，扩增产物经Spe1单酶切后连接到经相同酶切后的表达载体pCAMBIA1302中，通过测序鉴定目的基因的完整性和连接的正确性，利用热激发将带有HbARF2基因ORF的质粒转化到GV3101菌株。通过农杆菌介导法，侵染本生烟烟草的叶盘，将HbARF2基因转化到组培形成的幼苗中进行过表达，对转基因阳性植株进行鉴定，对含有目的基因的T3代阳性植株进行筛选及生长分析，结果表明过表达HbARF2基因的转基因烟草生长受到抑制。生长60天时，相对于对照(WT和pCANBIA1302)，转基因植株矮小，茎秆纤细(图3)。

4、HbARF2基因在橡胶树不同杂交组合后代中的表达

从热垦509和热研87-4-26(RK509×RY87-4-26)、热研88-13和野生种质02(RY88-13×WG02)、热垦7-82和热垦523(RK7-82×RK523)、热研88-13和野生种质127(RY88-13×WG127)、热垦7-82和热垦628(RK7-82×RK628)、热研7-33-97和野生种质127(RY7-33-97×WG127)6个杂交组合中分别选择5株生长慢的后代(SG1-5)和5株生长快的后代(FG1-5)为材料，通过荧光定量鉴定HbARF2基因在不同杂交组合后代中的表达模式，结果表明在6个杂交组合中，HbARF2基因在生长快的植株中的表达量显著低于生长慢的的植株(图4)。该表达分析的结果与转基因烟草的结果一致，表明HbARF2在橡胶树的生长中起抑制作用。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 一种橡胶树的ARF基因及其编码蛋白与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2574

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atggattctt cggagatttc aataaagggt aacggtggaa acgtaagagg agacagcttc 60

tcttcgggtt atagcgaacc caacgaccca aggaacgcca tggaaggaca gaaaagccat 120

tctactcgta ctgtctctgc aagagacgcc gaaacggcac tttacacgga gctttggcat 180

gcctgtgccg gccccttggt caccgttcct cgtgaaggag agcgcgtttt ctacttccct 240

cagggacaca tcgaacaggt ggcggcgtcc acaaatcagg tggcggacca gcagatgcca 300

gtttatgatc ttccatctaa gatcttgtgt accgtgatca acgtccagtt gaaggctgag 360

ccagatacag atgaggtatt tgcgcaagtg actttgcttc ctgaacccaa ccaagatgag 420

agtgcagtgg acaaggagcc tcccttacct cctcctccac ggtttcatgt gcattcattt 480

tgtaaaacct taactgcctc agatacaagt acccatggtg ggttttctgt tcttcgtcga 540

catgcagatg aatgtctgcc acctctggat atgtcaaggc aacctccaac acaggaattg 600

gttgccaagg atttgcatgg aaatgaatgg cgttttaggc atatctttcg gggtcaaccg 660

cggaggcact tgcttcaaag tggatggagt gtatttgtta gctcaaaaag gcttgttgct 720

ggtgatgcgt ttatattttt aaggggcgag aatggggaac ttcgagttgg tgttagacgt 780

gcaatgagac agcagggtaa tgttccatca tctgtcatat ccagtgtcag catgcatctg 840

ggtgtgcttg ctactgcatg gcatgccatc tctacgggaa ccatgttcac tgtttattat 900

aagccaagga caagcccagc tgagttcatt gttccagttg atcgatacat ggagtctgtc 960

aagaacaact attccattgg aatgaggttt aaaatgagat ttgaaggaga agaagctcct 1020

gagcaaagat ttaccggtac aattgttgga attgaagatg ctgatcccaa aaggtggcga 1080

gaatccaaat ggagatgcct gaaggtgaga tgggatgaaa cctccactat gcctcgccca 1140

gagagagttt caccatggag catagaacct gcactggctc ctcccgcatt gaatcccctt 1200

cctgtgccca ggcccaaaag gcctcgatct catatggtgc cttcatcccc agactcctct 1260

gttcttacca gagaaggttc atccaaagta actgtagacc ctccaacacc aagtggatat 1320

gccagggtct tgcaaggtca agaattctcg accttgagag gcaattttgc agagagcaat 1380

gaatctaaca ctgctgaaaa atctctaatg tggccatctt ccatagatga agagaagatt 1440

gatgtgatat ctgcttcgag aaggcatgga tcagagagtt ggatgacctc tgggaggcag 1500

gagccaacct acacagattt gttatcaggc tttgggacac gtgctgattc ctcccatgga 1560

tttggtgtac cctttgttga tcaaactgca gcagccgcta gcagagaact tgcattagat 1620

caggaaggca agattaactc gcttgccagt ccatggtcct tgatgtcatc tggtctttcc 1680

ctcaggttat cagagtctaa tatgaaggct cctgtagaag gtcgtgatat gccttttcaa 1740

gcacgaggaa atatcagatg cagtgcgttt aatgagtatc caatgcttaa tggtcataga 1800

gttgagcaat cgcatggaaa ctggttgatg cctcccccac caccatctca ttttcataat 1860

aacgctcatg caagagagag agtttcaaaa cctattttgg tacaagaaca tgagactgtc 1920

acatccacgg atggaaagtg taagctgttt ggcattccct tgtttagtaa tcctgttaca 1980

ccggaaccag cagcttcaca taggaacacg gtcaatgagc ccattagtac acatcctcag 2040

agtcagcagc ttcgtgtaat ggaatgtgat caaaggtcag aacaatccaa gggttctaaa 2100

ctggctgatg ataatgagca tgagaaacaa gtccaagctg gtgccctgca tacgagggac 2160

aatcagggca aagttcaaaa cgtttccact aggagttgta ccaaggttca caagcagggc 2220

attgcacttg gaaggtctgt tgatcttacc aaattcaaca actatgatga gttgattgct 2280

gaattggatc ggttgtttga atttgatggt gaattaatgg ctcccaaaaa gaattggctg 2340

attgtgtata cagatgatga gggcgatatg atgcttgttg gagatgatcc ctggcaggaa 2400

tttgttggca tggttcgcaa gatttttatc tatacaagag aggaggtaca aaagatgaat 2460

ccagggacct taaattcaaa gggtgatgag aatttgttgg atgtggaggg cgtagatgca 2520

aaagaagtga aatgcctacc tcttcctcca gcgcatggta ctgaaaattg ttag 2574

<210> 2

<211> 857

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met Asp Ser Ser Glu Ile Ser Ile Lys Gly Asn Gly Gly Asn Val Arg

1 5 10 15

Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Ser Glu Pro Asn Asp Pro Arg Asn

20 25 30

Ala Met Glu Gly Gln Lys Ser His Ser Thr Arg Thr Val Ser Ala Arg

35 40 45

Asp Ala Glu Thr Ala Leu Tyr Thr Glu Leu Trp His Ala Cys Ala Gly

50 55 60

Pro Leu Val Thr Val Pro Arg Glu Gly Glu Arg Val Phe Tyr Phe Pro

65 70 75 80

Gln Gly His Ile Glu Gln Val Ala Ala Ser Thr Asn Gln Val Ala Asp

85 90 95

Gln Gln Met Pro Val Tyr Asp Leu Pro Ser Lys Ile Leu Cys Thr Val

100 105 110

Ile Asn Val Gln Leu Lys Ala Glu Pro Asp Thr Asp Glu Val Phe Ala

115 120 125

Gln Val Thr Leu Leu Pro Glu Pro Asn Gln Asp Glu Ser Ala Val Asp

130 135 140

Lys Glu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Arg Phe His Val His Ser Phe

145 150 155 160

Cys Lys Thr Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe Ser

165 170 175

Val Leu Arg Arg His Ala Asp Glu Cys Leu Pro Pro Leu Asp Met Ser

180 185 190

Arg Gln Pro Pro Thr Gln Glu Leu Val Ala Lys Asp Leu His Gly Asn

195 200 205

Glu Trp Arg Phe Arg His Ile Phe Arg Gly Gln Pro Arg Arg His Leu

210 215 220

Leu Gln Ser Gly Trp Ser Val Phe Val Ser Ser Lys Arg Leu Val Ala

225 230 235 240

Gly Asp Ala Phe Ile Phe Leu Arg Gly Glu Asn Gly Glu Leu Arg Val

245 250 255

Gly Val Arg Arg Ala Met Arg Gln Gln Gly Asn Val Pro Ser Ser Val

260 265 270

Ile Ser Ser Val Ser Met His Leu Gly Val Leu Ala Thr Ala Trp His

275 280 285

Ala Ile Ser Thr Gly Thr Met Phe Thr Val Tyr Tyr Lys Pro Arg Thr

290 295 300

Ser Pro Ala Glu Phe Ile Val Pro Val Asp Arg Tyr Met Glu Ser Val

305 310 315 320

Lys Asn Asn Tyr Ser Ile Gly Met Arg Phe Lys Met Arg Phe Glu Gly

325 330 335

Glu Glu Ala Pro Glu Gln Arg Phe Thr Gly Thr Ile Val Gly Ile Glu

340 345 350

Asp Ala Asp Pro Lys Arg Trp Arg Glu Ser Lys Trp Arg Cys Leu Lys

355 360 365

Val Arg Trp Asp Glu Thr Ser Thr Met Pro Arg Pro Glu Arg Val Ser

370 375 380

Pro Trp Ser Ile Glu Pro Ala Leu Ala Pro Pro Ala Leu Asn Pro Leu

385 390 395 400

Pro Val Pro Arg Pro Lys Arg Pro Arg Ser His Met Val Pro Ser Ser

405 410 415

Pro Asp Ser Ser Val Leu Thr Arg Glu Gly Ser Ser Lys Val Thr Val

420 425 430

Asp Pro Pro Thr Pro Ser Gly Tyr Ala Arg Val Leu Gln Gly Gln Glu

435 440 445

Phe Ser Thr Leu Arg Gly Asn Phe Ala Glu Ser Asn Glu Ser Asn Thr

450 455 460

Ala Glu Lys Ser Leu Met Trp Pro Ser Ser Ile Asp Glu Glu Lys Ile

465 470 475 480

Asp Val Ile Ser Ala Ser Arg Arg His Gly Ser Glu Ser Trp Met Thr

485 490 495

Ser Gly Arg Gln Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Leu Leu Ser Gly Phe Gly

500 505 510

Thr Arg Ala Asp Ser Ser His Gly Phe Gly Val Pro Phe Val Asp Gln

515 520 525

Thr Ala Ala Ala Ala Ser Arg Glu Leu Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys

530 535 540

Ile Asn Ser Leu Ala Ser Pro Trp Ser Leu Met Ser Ser Gly Leu Ser

545 550 555 560

Leu Arg Leu Ser Glu Ser Asn Met Lys Ala Pro Val Glu Gly Arg Asp

565 570 575

Met Pro Phe Gln Ala Arg Gly Asn Ile Arg Cys Ser Ala Phe Asn Glu

580 585 590

Tyr Pro Met Leu Asn Gly His Arg Val Glu Gln Ser His Gly Asn Trp

595 600 605

Leu Met Pro Pro Pro Pro Pro Ser His Phe His Asn Asn Ala His Ala

610 615 620

Arg Glu Arg Val Ser Lys Pro Ile Leu Val Gln Glu His Glu Thr Val

625 630 635 640

Thr Ser Thr Asp Gly Lys Cys Lys Leu Phe Gly Ile Pro Leu Phe Ser

645 650 655

Asn Pro Val Thr Pro Glu Pro Ala Ala Ser His Arg Asn Thr Val Asn

660 665 670

Glu Pro Ile Ser Thr His Pro Gln Ser Gln Gln Leu Arg Val Met Glu

675 680 685

Cys Asp Gln Arg Ser Glu Gln Ser Lys Gly Ser Lys Leu Ala Asp Asp

690 695 700

Asn Glu His Glu Lys Gln Val Gln Ala Gly Ala Leu His Thr Arg Asp

705 710 715 720

Asn Gln Gly Lys Val Gln Asn Val Ser Thr Arg Ser Cys Thr Lys Val

725 730 735

His Lys Gln Gly Ile Ala Leu Gly Arg Ser Val Asp Leu Thr Lys Phe

740 745 750

Asn Asn Tyr Asp Glu Leu Ile Ala Glu Leu Asp Arg Leu Phe Glu Phe

755 760 765

Asp Gly Glu Leu Met Ala Pro Lys Lys Asn Trp Leu Ile Val Tyr Thr

770 775 780

Asp Asp Glu Gly Asp Met Met Leu Val Gly Asp Asp Pro Trp Gln Glu

785 790 795 800

Phe Val Gly Met Val Arg Lys Ile Phe Ile Tyr Thr Arg Glu Glu Val

805 810 815

Gln Lys Met Asn Pro Gly Thr Leu Asn Ser Lys Gly Asp Glu Asn Leu

820 825 830

Leu Asp Val Glu Gly Val Asp Ala Lys Glu Val Lys Cys Leu Pro Leu

835 840 845

Pro Pro Ala His Gly Thr Glu Asn Cys

850 855

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

atggattctt cggagatttc aata 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

ctaacaattt tcagtaccat gcgc 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

aaaaggtaga aaagtagtaa tggttg 26

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

ttacccttta ttgaaatctc cgaa 24

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

ggactagtat ggattcttcg gagatttc 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

ggactagtac aattttcagt accatgcg 28

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

ggcactttgg tactcaagtc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

gaagcatccc aatcactctc 20

Claims

1.一种橡胶树的ARF基因，其特征在于，其为橡胶树生长抑制因子HbARF2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种蛋白质，其特征在于，其为权利要求1所述的橡胶树生长抑制因子HbARF2基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种权利要求1所述的橡胶树HbARF2基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从橡胶树树皮中提取总RNA；

(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

(4)PCR产物连接载体，转化，测序，获得HbARF2基因片段。

4.一种表达载体，其含有权利要求1所述的橡胶树HbARF2基因。

5.如权利要求1所述的橡胶树HbARF2基因、或者如权利要求4所述的表达载体在降低植物茎秆的生长发育中的应用。

6.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

7.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

8.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

9.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。