CN116121259B - 一种调控苹果果实酸含量的基因MdMYB21及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了苹果果实低酸调控基因MdMYB21，核苷酸序列表如序列表1所示；含有苹果低酸调控基因MdMYB21的重组过量表达载体，苹果低酸调控基因MdMYB21在调控苹果果实酸度中的应用，苹果果实低酸调控基因MdMYB21获得转基因低酸性状苹果材料的应用，苹果果实低酸调控基因MdMYB21获得转基因低酸性状番茄的应用以及秦冠x蜜脆杂交群体中在基因MdMYB21启动子SSR基序(CT)n中存在2bp变异对苹果酸含量的影响分析；本发明的苹果果实低酸调控基因MdMYB21能够负调控苹果酸在苹果果实中的积累。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种调控苹果果实酸含量的基因MdMYB21及其应用。
背景技术
苹果(Malus domestica Borkh.)，作为世界种植面积最大，消费最高的水果之一，富含矿物质和维生素，营养价值高。提高果实品质是苹果育种计划中最重要的目标之一，作为果实风味的重要组成部分，可溶性糖和有机酸的种类和含量对水果感官品质的形成起着至关重要的作用。果实细胞的酸度主要是由于液泡中有机酸的积累，苹果酸和柠檬酸是大多数成熟果实中的主要有机酸，而苹果酸是苹果中的主要有机酸。因此，了解苹果酸在苹果果实细胞中积累的机制是提高苹果果实品质的重要方面。
目前，在植物基因组中鉴定数量性状候选基因的另一种方法是通过关联作图分析进而发现感兴趣的复杂性状。关联作图，也称为连锁不平衡(LD)作图，是一种利用现有育种和栽培品系观察和鉴定与表型变异显著相关的遗传多态性的方法。果实的酸度是一种数量性状，研究表明，位于苹果16连锁群顶端存在着一个显著影响果实酸度的位点，命名为Ma位点，并且在该位点发现了一个控制果实酸度的主效基因ALMT9(Ma1)，但是在成熟果实中观察到的苹果酸含量表型变异中，该基因只能解释约7.46％的变异率，这表明在该位点处可能还存在其他控制苹果果实酸度的候选基因。因此本研究通过利用QTL作图结合关联分析对于进一步挖掘与苹果果实酸度相关基因具有重要意义。
虽然对苹果果实酸度相关候选基因的定位已有部分研究，但是果实酸度的积累是一个复杂的机制，需要我们不断进一步挖掘，研究与开发与苹果果实酸度关键基因及分子标记，对于苹果育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与苹果果实低酸调控相关基因MdMYB21，能够负调控苹果酸在苹果果实中的积累。
本发明还提供了一种MYB转录因子，能够负调控苹果果实中苹果酸的积累；
本发明是基于苹果16号连锁群顶端Ma位点基因标签的开发及在群体中的应用，如图1所示；利用混合线性模型对分子标记和苹果酸含量之间进行相关性分析，筛选候选基因的应用。
本发明所采用的技术方案是，苹果果实低酸调控基因MdMYB21，MdMYB21基因的核苷酸序列表如序列表1所示。
本发明所采用的第二个技术方案是，一种含有苹果低酸调控基因MdMYB21的重组过量表达载体。
本发明将苹果低酸调控基因MdMYB21在苹果中克隆出来，利用同源重组的方法构建过表达以及干扰载体，利用转基因技术，以苹果愈伤组织及果实为材料进行遗传转化，获得转基因低酸性状苹果材料的应用；具体为：
本发明所采用的第三个技术方案是，一种用苹果低酸调控基因MdMYB21在调控苹果果实酸度中的应用。
本发明所采用的第四个技术方案是，一种用苹果果实低酸调控基因MdMYB21获得转基因低酸性状苹果材料的应用。
本发明所采用的第五个技术方案是，苹果低酸调控基因MdMYB21在苹果中克隆出来，利用同源重组的方法构建过表达载体，将其异源转化至番茄中，获得转基因低酸性状番茄的应用。
本发明所采用的第六个技术方案是，‘秦冠’x‘蜜脆’杂交群体中在基因MdMYB21启动子SSR基序(CT)n中存在2bp变异对苹果酸含量的影响。
本发明的有益效果是
本发明利用QTL作图结合关联分析鉴定了一个与苹果果实酸度相关的基因，本发明一种苹果低酸调控基因MdMYB21，能够负调控苹果酸，抑制苹果酸在液泡里的积累，在提高苹果果实品质方面发挥重要作用，本发明一种苹果低酸调控基因MdMYB21，能够提前通过标记进行辅助选择育种，在杂交后代群筛选符合预期的子代，缩短育种筛选年限。
附图说明
图1是苹果16号染色Ma位点酸度性状的区间关联分析图；
图2是WBG82标记在自然群体中基因型检测及基因型与苹果酸含量相关性示意图；
图3是苹果果实发育过程中MdMYB21表达量与苹果酸含量相关性分析示意图；
图4是本发明MdMYB21在苹果不同组织特异性分析示意图；
图5是本发明的MdMYB21亚细胞定位图；
图6是本发明克隆的MdMYB21在苹果愈伤组织中过表达对苹果酸含量的影响；
图7是本发明克隆的MdMYB21在苹果果实中过表达对苹果酸含量的影响；
图8是本发明克隆的MdMYB21在番茄中过表达对总酸含量的影响示意图；
图9是本发明在‘秦冠’x‘蜜脆’杂交群体中克隆的MdMYB21启动子SSR基序(CT)n中的2bp变异对苹果酸含量影响的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
苹果低酸调控基因MdMYB21核苷酸序列所序列表1所示。
实施例1有机酸的提取和测定
有机酸含量的提取和测定采用高效液相色谱法(HPLC)，具体测定方法如下所述，取样品约0.15g，溶于1mL ddH2O中，置于水中进行超声，将混合物在室温下超声处理30min，然后在4℃离心机下以12000rpm离心15min；取上清液后使用0.22μm水滤膜进行过滤。过滤后溶液可置于-80℃保存；
有机酸含量使用二极管阵列耦合的Agilent 1260 Infinity HPLC系统(Milford，MA，USA)测定；流动相是0.02M KH2PO4溶液(pH＝2.4)，流速为0.8mL/min。使用的柱子型号为C18-WP,100A，4.6ⅹ150mm，5um，检测波长为210nm。
实施例2SSR分子标记的分型检测
取50-100mg的苹果叶片组织，用于植物基因组DNA的提取；分子标记PCR反应液使用25ul反应体系，如下：SE008 2×T5 Super PCR Mix：12.5ul，10uM Primer pair 1ul,DNA模板：50-100ng，ddH2O补齐至25ul；反应程序为：98℃3min，{98℃10s，60℃10s,72℃5s}35个循环,72℃延伸5min；PCR产物变性：取5ul的PCR产物加入等体积的Loading buffer，然后98℃10min；
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：将变性后的PCR产物吸取1ul于8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电压恒定为80w，电泳缓冲液为1ⅹTBE，电泳时间1-1.5h；
银染显色：将电泳后的玻璃板分开，拆开的胶先用蒸馏水洗三遍，在硝酸银溶液里进行染色(1.3g/L溶解到蒸馏水中)，染色10min，直至出现清晰可见的条带，然后将胶在蒸馏水中冲洗，保存拍照。
表1用于分子标记基因分型的引物列表
实施例3
苹果低酸调控基因MdMYB21，其表达模式与苹果酸积累的关系：
取‘蜜脆’苹果花后60天，90天，120天的果实样品进行苹果酸含量测定，每个样品包括三个生物学重复；取‘蜜脆’植株的根、茎尖、成熟叶片、完全盛开时期的花、以及成熟期果实，每个样品包括三个生物学重复，用于进行qRT-PCR分析；
检测结果如图3和图4所示，MdMYB21在果实中表达量最高；随着果实发育其表达量逐渐升高，并且与苹果酸含量呈显著负相关；以上结果表明MdMYB21与苹果酸的积累显著相关。
实施例4苹果低酸调控基因MdMYB21亚细胞定位
MdMYB21亚细胞定位使用pCAMBIA2300-GFP载体，载体上包含的GFP在目的基因的C端，选用的酶切位点为KpnI和BamHI，利用同源重组的方法，具体步骤如下：
(1)引物序列如下所示：
KpnI-F:acgggggacgagctcggtaccATGGCTGCTCCTACAACCCCAA
BamHI-R:ggtgtcgactctagaggatcc CGGCCCATCCATGTTCC
(2)以上述引物扩增DNA序列，在1％琼脂糖胶上进行检测，目的条带大小及亮度符合后，使用胶回收试剂盒购买于上海惠凌生物科技有限公司，具体操作步骤根据说明书进行；
(3)对pCAMBIA2300-GFP载体先后在30℃、37℃下各酶切1h后85℃热失活15min，然后降至4℃保存；将酶切后的载体与回收目的基因片段使用同源重组酶进行连接，酶切体系与连接体系分别如下所示：
表2双酶切体系
按照30℃1h、37℃1h，85℃15min，4℃反应程序进行。
表3酶切产物连接体系
通过PCR检测目的基因是否构建到载体上去，MdMYB21片段大小为894bp，条带大小一致后将菌液送公司测序，将测序结果与下载序列进行比对，若序列一致则连接成功。获得含有MdMYB21的重组载体，命名为MdMYB21-GFP，pCAMBIA2300-GFP空载体作为对照，将两者分别导入至农杆菌菌株GV3101并注射到烟草叶片中，在共聚焦显微镜下进行观察；如图5所示，空载体的绿色荧光在细胞膜及细胞核上能够被明显观察到，说明空载体良好；观察目的基因的绿色荧光时，在细胞核有明显表达，表明MdMYB21定位到细胞核中。
实施例5本发明克隆的MdMYB21在苹果愈伤组织中，果实以及番茄中过表达对苹果酸含量的影响：
为了进一步研究本发明中MdMYB21基因对苹果酸积累的影响，以转入pMDC83空载体的转基因愈伤组织及苹果果实为对照；测定了苹果过表达MdMYB21转基因愈伤及苹果果实苹果酸含量，测定方法如实施例1所示，检测结果如图6，图7，图8所示；图6，7，8分析结果表示，在苹果愈伤，果实以及番茄中过表达MdMYB21后对照相比能够显著降低苹果酸含量；
实施例6本发明在‘秦冠’x‘蜜脆’杂交群体中克隆的MdMYB21启动子SSR基序(CT)n中存在2bp变异对苹果酸含量的影响：
本发明以‘秦冠’和‘蜜脆’杂交群体的DNA为模板，以以下引物为对MdMYB21启动子区域进行扩增，将扩增后的PCR产物进行测序；苹果酸含量的测定按照实施例1所示进行。结果如图9所示。
PCR引物如下所示:
MYB21-F：CCATGGACTATACAACAAAATTTC
MYB21-R：AGCTGCTCTCTTGCTTGAGAGAGA
序列表1
核苷酸序列
ATGGCTGCTCCTACAACCCCAAATGAAGAAAATGAGTTCAGAAGAGGGCCATGGACTCTTGAGGAAGACAATCTGCTTATACATTACATCGTGAACCACGGCGAAGGCCATTGGAATTCTGTAGCAAAACTTGCAGGATTGAAGAGGACCGGAAAAAGCTGCAGATTGAGATGGCTAAATTACTTAAAACCCGACATTAAGCGCGGGAACCTTACTCCGCAAGAACAGCTCATGATCCTTGAACTCCACTCCAAGTGGGGTAACAGGTGGTCTAAAATTGCGCAGCATTTGCCGGGAAGAACAGACAATGAGATAAAGAACTATTGGAGAACAAGGGTGCAAAAACAGGCGCGCCAACTGAACATCGAGTCGAACAGCGAGCAATTTCTCGATGCAGTTCGGGGTTTCTGGGTGCCGACTCTGCTGCAAAAAATGGAGCAATCTTCTTCTTCTTGTTCTTCAACCTTGAGCACTTCTCAGAACTCCGCATCTCCTTGTCTGTCACCAAATCACGCAGCTCCTTCCGTGCCACTCTCAACCTCTCCACCTAGCAATGCGACAAACGTGTTGGACAATTATCACATTAGTGGAAATTCCAATCTTGCCACCGTCCCAAGTAATATCCTTTCGGCGGATTCTTTTGTTTCACACGTGCCTCAAATGGCAGAACCGTCCACGAGTTTTCCCCCTGCATATTACCGACTTGGCTACAGCAGCTTAAGTCCAGATGGCAGTCACTACGTGGACAGCAGTAGCTATGACGTGGAGGGTCTCAGCCTGGACCCTGTTTCGGCAATGGGCAATCTTGGCAATTCACAGTTTGATTGCCAGATGGGGGGAAATGATTGGATGTTGGACAATGTGACTGACAGTTTATGGAACATGGATGGGCCGTGA
Claims (3)
1.一种苹果果实低酸调控基因MdMYB21在调控苹果果实酸度中的应用；所述MdMYB21基因的核苷酸序列如序列表1所示。
2.一种过表达权利要求1中所述的苹果果实低酸调控基因MdMYB21获得转基因低酸性状苹果材料的应用。
3.一种过表达权利要求1中所述的苹果果实低酸调控基因MdMYB21获得转基因低酸性状番茄的应用。
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