CN101580543A

CN101580543A - 植物调节花色素苷合成的转录因子-myb编码基因

Info

Publication number: CN101580543A
Application number: CNA2008102255870A
Authority: CN
Inventors: 姚允聪; 沈红香; 田佶; 宋婷婷
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2008-11-06
Filing date: 2008-11-06
Publication date: 2009-11-18

Abstract

本发明公开了一种植物调节花色素苷合成的转录因子的编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能改变植物花色或叶色的由1)衍生的蛋白质。

Description

植物调节花色素苷合成的转录因子-MYB编码基因

技术领域

本发明涉及与植物花色素苷形成相关的酶编码基因与应用。

背景技术

转录因子也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白(王希庆，陈柏君，印莉萍.植物中的MYB转录因子，生物技术通报，2003，2：22～25.)。根据与DNA结合的方式可以把TF分为两类：普遍性转录因子(general transcription factor，GTF)和特异性转录因子(sequence-specifictranscription factor)(吴乃虎.《基因工程原理》(下册)，北京：科学出版社：2001，88～97.)。GTF能和启动子的核心序列TATA框结合，可以激活所有基因的转录，而特异性转录因子和DNA序列上的其它调节元件结合，只能激活特定的基因。

MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，它们都具有高度保守的DNA结合域-MYB结构域。每个MYB结构域约含有50-53个氨基酸残基，其中，有3个保守的色氨酸残基，其间隔为18-19个氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持螺旋-转角-螺旋(HTH)的构型起着非常重要的作用。MYB蛋白借助此结构插入靶DNA分子大沟与目的DNA结合，研究表明，每一重复子的C-端螺旋是结合DNA的识别螺旋，而R3的识别螺旋特异性地与其识别序列的核心结合，而R2的识别螺旋与核苷酸的结合专一性较差(Ogata K，MorikawaS，Ametani Y et al.Comparison of the free and DNA complexed forms of the DNA2 bindingdomain ofc-MYB.Nature Struct Biol，1995，2：309-320.)，有时色氨酸残基会被某个芳香族氨基酸或疏水氨基酸所取代；植物MYB蛋白R3重复子中第一个色氨酸残基通常为苯丙氨酸(Phe)或异亮氨酸(ILeu)所代替。

MYB相关基因的调节活性是自然界中植物着色模式多变的主要原因(Schwinn K，Venail.J，Shang Y.et al.A small family of MYB-regulatory genes controls floral pigmentationintensity and patterning in the genus Antirrhinum.Plant Cell 18：831-851.)，其中MYBR2R3家族与类黄酮和花色素昔生物合成途径调控紧密相关。如玉米的Cl，所编码的蛋白具有一个碱性N-端，包含2个重复结构域(R2R3)，和酸性的C-端则具有转录激活因子的特征。属于该类转录因子还包括玉米的Cl/Pl家族与P基因，拟南芥的TT2、PAP1/PAP2，矮牵牛的An2，金鱼草的AmMYB305，与AmMYB340，紫苏的MYB-PI(R3)。

近年来，许多类黄酮代谢途径中的转录因子基因已从拟南芥、番茄等模式植物中被克隆出来，根据其结构特点可以分为两个转录因子家族：一类是与脊椎动物原发癌基因c-MYB编码蛋白同源的MYB转录因子，它们都具有相似的螺旋一转角一螺旋(Helix-Turn-Helix，HTH)结构，多数MYB转录因子都具有两个相关的HTH结构，参与靶序列的结合。在每个MYB区域中，一般都含有3个保守的色氨酸残基，其间隔18-19氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持HTH的构型起着非常重要的作用；另一类是与脊椎动物原发癌基因c-MYC编码蛋白同源的MYC转录因子，它们具有共同的螺旋一环一螺旋(basic Helix-Loop-Helix，bHLH)结构，可与MYB转录因子相互作用，共同调节类黄酮的代谢(Gandikota M，de KochkoA，Chen L et al.Development of transgenetic rice plants expressing maize anthocyanin genes andincreased blast resistance.Mol Breed，2001，7：73-83.)。

Moyano等发现金鱼草AmMYB305与AmMYB304共同调控苯丙烷代谢途径的第一个酶PAL(phenylalanine ammonia-lyase)的合成(Moyano E，Martinez-Garcia JF，Martin C.ApparentRedundancy in MYB Gene Function provides Gearing for the control of Flavonoid Biosynthesisin Antirrhinum Flowers.Plant cell，1996，8：1519-1532.)，当AmMYB305与AmMYB304在同一细胞中表达时，AmMYB305优先结合在目的基因的启动子，从而减弱了AmMYB304的激活效率，因此，它们之间通过一种内部协调机制共同参与苯丙烷代谢。矮牵牛的AN2基因只在花瓣中表达，编码一个含有MYB结构的蛋自(F.Quattrocchio，J.Wing，K.V.D.Woude，etal.Molecular analysis of the anthocyanin 2 gene of Petunia and its role in the evolution of flowercolor.Plant cell，1999，11：1433-1444.)。在功能上，它能与玉米的Cl互换，并且可能与拟南芥(Arabidopsis thtalaina)外种皮透明基因2(Transparent Testa2，TT2)或花青素合成基因1(Production of anthocyanin pigment1，PAP1)和PAP2同源(N.Nesi，C.Jond，I.Debeaujon et al..TheArabidopsis TT2gene encodes an R2R3 myb domain protein that acts as a key determinant forproanthocynaidin accumulation in developing seed.Plant Cell，2001，13：2099-2114.)。

Elomaa等在非洲菊(Gerbera hybrida)中发现了一种R2R3型MYB因子-GMYB10。它同以前在矮牵牛和拟南芥中发现的诱导花青素合成的调控因子有高度的同源性。GMYB10能诱导转基因烟草花青素的合成，特别是在幼嫩组织和花粉囊中着色显著。在非洲菊中，GMYB10参与花青素合成基因在叶子、花梗和花朵中的诱导表达。在花朵中，它的表达被限制在花瓣表皮细胞层，并与花瓣的花青素积累模式相关。通过酵母(Saccharomyecescerevisiae)双杂交分析发现，GMYB10能与先前分离出的bHLH型转录因子GMYC1相互作用。利用转基因分析还表明，GMYB10/GMYC1是晚期花青素合成基因PGDFR2启动子转录激活所必须的调控因子(P.Elomaa，A.Uimari，M.Mehto.et al.Activation of anthocyaninbiosynthesis in Gerbera hybrida(Asteraceae)suggests conserved protein-protein andprotein-promoter interactions between the anciently diverged monocots and eudieots.plnatphysiol.，2003，133(4)：1831-1842.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物花色素苷形成相关的酶编码基因与.

本发明所提供的与植物花色素苷形成相关的酶，名称为MYB，来源于苹果属王族海棠(Malus Royalty)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由1)衍生的酶。

上述与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第948位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子；

4)与1)的基因具有95％以上的同源性，且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子。

序列表中的序列1由948个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-948位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的MYB。

扩增上述MYB基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生工生物技术服务有限公司完成。限制性内切酶EcoR I、HindIII和Taq酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司，pUC18-T Vector购自宝生物工程公司，BD SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司。

Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、DL2000DNA Marker、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。

一、MrMYB基因3’端序列的获得

以王族海棠(Malus Royalty)(北京农学院海棠种质资源圃)为实验材料，提取其根的总RNA，将提取得到的总RNA用50μl的DEPC水溶解，电泳检测。经甲醛变性凝胶电泳分析，结果如图1所示。从图中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA两条带，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大约为1∶1-2∶1。结果表明，提取得到的RNA是完整的，染色结果显示，提取得到的总RNA可以用来进行反转录。

以上述提取得到的根总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，跟据近缘物种植物MYB基因保守区段序列，设计3’race上游引物MYB3F扩增MrMYB基因的3’端序列。Master Mix预混物体系如下：

总体积34μL，将上述Master Mix预混物平均分成2管，按照下表加入引物：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性15S；68℃退火6min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，M为DL2000的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为MYB3F(序列表中序列4)和3R双引物对照。结果表明，双引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到670bp左右的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-VectorKit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的778bp片段即是MYB基因的3’端序列。

二、MYB基因5’端序列的获得

以步骤一获得的保守序列为模板，在其5′端设计引物，进行PCR反应，扩增MrMYB基因的5’端序列。Master Mix预混物体系如下：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性15S；58℃退火6min，共30个循环；最后72℃延伸7min。

将第一轮PCR产物稀释1000倍，取1μL作为模板，以MYB5R1和MYB5R2(序列表中序列5和6)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10μL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，M为MARKER II的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为MYB5R2和5F双引物对照。结果表明，双引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到680bp左右的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的700bp片段即是MrMYB基因的5’端序列。

三、MrMYB基因全长cDNA序列的获得

将上述PCR扩增获得的MrMYB基因5’端序列以及3’端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等生物软件进行拼接校正，拼接出MrMYB基因全长cDNA序列。根据拼接的MrMYB基因全长cDNA序列设计引物MYBF和MYBR(序列表中序列7和序列8)，提取王族海棠叶的总RNA，反转录为cDNA，用高保真Pfu酶替换Taq酶，PCR反应混合物如下：

10×PCR缓冲液	2.5μl
10×PCR缓冲液	2.5μl	dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
引物MYBF(100ng/μl)	0.5μl	dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
引物MYBF(100ng/μl)	0.5μl	引物MYBR(100ng/μl)	0.5μl
模板(反转录的cDNA)	1.5μl	引物MYBR(100ng/μl)	0.5μl
模板(反转录的cDNA)	1.5μl	Pfu酶(5U/μl)	0.3μl
ddH₂O	17.7μl	Pfu酶(5U/μl)	0.3μl
ddH₂O	17.7μl	Total	25μl

PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃50S，60℃1min，72℃2min，共35个循环；再72℃延伸7min，4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，M为MARKER II的DNA分子量标准，1为MrMYB基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得约1000bp的条带。切下该目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上。对扩增得到的MrMYB基因全长cDNA序列进行测序，测序结果表明，获得948bp的条带，该948bp的核苷酸片段即为MrMYB，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

附图说明

图1为王族海棠叶总RNA的提取结果

图2为MrMYB基因的5’RACE PCR扩增结果

图3为MrMYB基因的3’RACE PCR扩增结果

图4为MrMYB基因全长cDNA序列的PCR扩增结果

序列表

序列一

DNA

苹果属王族海棠(Malus Royalty)

948

1 CCCAAGCAAG AGAGCAGCTA TGGCCGCTCC TACAACCCCT

GAAGAAAATG AGTTCAGAAG

61 AGGGCCATGG ACTCTTGAGG AAGACAATCT GCTTATACAT

TACATCGTGA ACCACGGCGA

121 AGGCCATTGG AATTCTTTAG CAAAACTTGC AGGATTGAAG

AGGACCGGAA AAAGCTGCAG

181 ATTGAGATGG CTAAATTACT TAAAACCCGA CATTAAGCGC

GGGAACCTTA CTCCGCAAGA

241 ACAGCTCATG ATCCTTGAAC TCCACTCCAA GTGGGGTAAC

AGGTGGTCTA AAATTGCGCA

301 GCATTTGCCG GGAAGAACAA ACAATGAGAT AAAGAACTAT

TGGAGAACAA GGGTGCAAAA

361 ACAGGCGCGC CAACTGAACA TCGAGTCGAA CAGCGAGCAA

TTTCTCGATG CAGTTCGGGG

421 TTTCTGGGTG CCGACTCTGC TGCAAAAAAT GGAGCAATCT TCTTCTTCTT

GTTCTTCAAC

481 CTTGAGCACT TCTCAGAACT CCGCATCTCC TTGTCTGTCA CCAAATCACG

CAGCTCTTTC

541 CGTGCCACTC TCAACCTCTC CACCTAGCAA TGCGACAAAC GTGTTGGACA

ATTATCACAT

601 TAGTGGAAAT TCCAATCTTG CCACCGTCCC AAGTAATATC CTTTCGGCGG

ATTCTTTTGT

661 TTCACACGTG CCTCAAATGG CAGAACCGTC CACGAGTTTC CCCCCTGCAT

ATTACCGACT

721 TGGCTACAGC AGCTTAAGTC CAGATGGCAG TCACTACGTG

GACAGCAGTA GCTATGACGT

781 GGAGGGTCTC AGCCTGGACC CTGTTTCGGC AATGGGCAAT CTTGGCAATT

CACAGTTTGA

841 TTGCCAGATG GGGGGAAATG ATTGGATGTT GGACAATGTG

ACTGACAGTT TATGGAACAT

901 GGATGGGCCG TGACAACCTA GAAAGTTAGA AGATTTTCAG GGGATTCC

序列二

PRT

苹果属王族海棠(Malus Royalty)

314

1 PSKRAAMAAP TTPEENEFRR

21 GPWTLEEDNL LIHYIVNHGE

41 GHWNSLAKLA GLKRTGKSCR

61 LRWLNYLKPD IKRGNLTPQE

81 QLMILELHSK WGNRWSKIAQ

101 HLPGRTNNEI KNYWRTRVQK

121 QARQLNIESN SEQFLDAVRG

141 FWVPTLLQKM EQSSSSCSST

161 LSTSQNSASP CLSPNHAALS

181 VPLSTSPPSN ATNVLDNYHI

201 SGNSNLATVP SNILSADSFV

221 SHVPQMAEPS TSFPPAYYRL

241 GYSSLSPDGS HYVDSSSYDV

261 EGLSLDPVSA MGNLGNSQFD

281 CQMGGNDWML DNVTDSLWNM

301 DGP*QPRKLE DFQGI

序列三

DNA

人工序列

3R和5F：Long(0.4μM)：

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3′

Short(2μM)：

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′

序列四

DNA

人工序列

MYB3F：5’-GGGTCTWCCRGGWAGAACAG-3’。

序列五

DNA

人工序列

MYB5R1：5’-GATTGAGATGGCTAAATTACTTAAAAC-3’。

序列六

DNA

人工序列

MYB5R2：5′-GACATTAAGCGCGGGAACCT-3′

序列七

DNA

人工序列

MYBF：5’-GGAATCCCCTGAAAATCTTCT-3’

序列八

DNA

人工序列

MYBR：5’-CCCAAGCAAGAGAGCAGCTAT-3’

Claims

1、一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由1)衍生的蛋白质。

2、权利要求1所述蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的cDNA基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-948位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)的基因具有95％以上的同源性且编码编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。