CN110106189A

CN110106189A - VbMYB基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN110106189A
Application number: CN201910471424.9A
Authority: CN
Inventors: 张雅玲; 方智振
Original assignee: Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110106189B

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种乌饭myb转录因子VbMYB基因及其编码蛋白与应用。本发明提供了一种乌饭myb转录因子VbMYB，所述VbMYB的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID No.1所示。所述乌饭myb转录因子VbMYB基因表达与乌饭果皮花色苷积累呈正相关,可强烈诱导烟草叶片积累花色苷。这表明本发明提供的VbMYB能有效诱导植物花色苷生物合成，是花色苷合成正调控因子。乌饭myb转录因子VbMYB对花色苷生物合成具有转录调控作用，可应用到植物花色苷生物合成的基因工程和育种中，改变植物果实等组织的颜色。

Description

VbMYB基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种正调控花色苷合成的乌饭VbMYB基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

乌饭（Vaccinium bracteatum Thunb.）为杜鹃花科多年生常绿灌木，广泛分布于我国南方各省区的丘陵地带或海拔 400～1400m 的山坡林内或灌木丛，其果、根和叶均具有很高的药用价值，是一种具有很有开发利用前景的野生果树。乌饭树果实富含多种营养成分，具有抗衰老、抗氧化、抗癌防癌、抗菌抗病毒等功能。我们研究发现乌饭果实具有很强的花色苷合成和积累能力（每100g成熟乌饭果实含有500 mg以上花色苷）。

花色苷合成主要受MYB、bHLH和WD40等转录因子协同调控。其中，MYB是调控花色苷合成的关键转录因子。鉴定出参与乌饭果实花色苷生物合成调控的MYB转录因子，对于阐明乌饭果实花色苷合成调控机制具有重要意义，同时也可为其他植物的基因工程改良提供优异的基因资源，具有重要的理论和应用价值。然而，乌饭果实花色苷生物合成调控因子MYB未见报道。

发明内容

本发明从乌饭中获得VbMYB基因，构建VbMYB基因重组表达载体，构建带有VbMYB基因的工程菌株，目的在于提供一种正调控花色苷合成的乌饭VbMYB基因及其编码蛋白与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

乌饭VbMYB基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

制备含有乌饭VbMYB基因的重组表达载体pCAMBIA1302-VbMYB。

制备含有乌饭VbMYB基因的基因工程菌GV3101-VbMYB。

进一步地，将乌饭VbMYB基因应用于植物花色苷生物合成的基因工程和育种中。

本发明的优点在于：

本发明提供一种来源于乌饭的一种正调控花色苷合成的乌饭VbMYB基因核苷酸序列、编码蛋白及含有该基因的重组质粒和重组基因工程菌，本发明可应用于基因工程育种，用于培育花色苷含量改变的培育植物新品种。

附图说明

图1为乌饭VbMYB基因对烟草叶片积累花色苷的影响。

具体实施方式

实施例1乌饭VbMYB基因克隆

通过比较转录组学手段从乌饭果实中发现一个表达量与乌饭果皮花色苷积累呈正相关的基因，命名为VbMYB。以成熟的乌饭果实为材料进行RNA提取和cDNA合成。以特异引物对VbMYB18-F1：GGCAGCTTACATGAAAATTCTCC和VbMYB18-R1：CAAACAAAGAAATGCTTGCCG，进行PCR扩增获得VbMYB。PCR反应体系为50μl，成分包括为：I-5TM2xHigh-Fidelity Master Mix 25μl，上下游引物(10μM)各2μl，cDNA 1μl，H₂O 20μl。PCR程序为：90℃预变性3min，35个循环的98℃15s，56℃15s和72℃ 20s，72℃ 5min。

VbMYB基因序列如下：

GGCAGCTTACATGAAAATTCTCCATGTGCTTATTAAGTTGCATGATTCAATTAAAGGGTGCTACCGTGCTACGTTGGTACATGATTAGGAAAATGGACAGAGTTCCATTAGGAGTGAGAAAGGGTACTTGGACTAAGGAAGAAGACTGTCTTCTCAAGAAGTGCATTGAGAAGCATGGAGAGGGGAAGTGGCACCAAGTTCCTTACAAAGCAGGATTGAATAGATGCAGGAAAAGTTGTAGGCTGAGATGGTTGAATTATCTGAGGCCAAATATAAAGAGAGGAAATTTTACTGTGGATGAAATTGATCTCATTATCAGGCTTCATAAGCTCCTGGGCAATAGATGGTCGTTAATTGCGGGTAGACTTCCAGGAAGAACATCGAACGACGTGAAAAATTACTGGAATACCCATCTAAAAGGGAAATCGACGGACCAAAGTAGAGAGGTACAGAAATCTAAAACGACCCCGAATACGACTGAAAGGACCACAATCATACGGCCTCGACCACAAACCTTCTCCAAAAATCAACATGTTTTGATGGGTAGTACTGTCATTGCAGATAATATTCAAACAAGAGATCCAAATCTCTCGAACCCATCCCAAACACAACCACCGGGGGATGATGATGGAACATTGTGGTGGGATGACATGTTGTTCAATTATGAAATTAGCAGAGATATGATGACGTGGACCAATGACGGAGCAAATGAGGAGGCCATGATGGTGGATAACCGTGAAGAAGCAAAATCAGGTACACAAGGAGCTGGTGGGGATCATTACAGTTGTGTTCAAGAAGATCAGAATGATTGGAGTAACATTTTTATGGATAATGTGGACCTTTGGGATATTTTAGGTGATGAACAAGCAGTACTGTAATGTTTAGCATTTCTCTGGAATAATTAGTATCCGTCGATTTTTACGCTTTATGATTTGTATAAACAAAACTAGTTTACGCCACCGTACACGCATGGAGTCTCCTGTTTGTGCTATTTTTCAGCACATTAATGAAAAATTCTAGTAGTGGCCCAAAGCCCAACTTAGTGTCCATATATAAGACCTTGATATGTTCTAGAATTAGTAGAATGGAAAACCCTGTTCGTGCGTCTCAATCCCGAGAGCCAGCGGCAAGCATTTCTTTGTTTG

氨基酸序列：

MCLLSCMIQLKGATVLRWYMIRKMDRVPLGVRKGTWTKEEDCLLKKCIEKHGEGKWHQVPYKAGLNRCRKSCRLRWLNYLRPNIKRGNFTVDEIDLIIRLHKLLGNRWSLIAGRLPGRTSNDVKNYWNTHLKGKSTDQSREVQKSKTTPNTTERTTIIRPRPQTFSKNQHVLMGSTVIADNIQTRDPNLSNPSQTQPPGDDDGTLWWDDMLFNYEISRDMMTWTNDGANEEAMMVDNREEAKSGTQGAGGDHYSCVQEDQNDWSNIFMDNVDLWDILGDEQAVL

实施例2 含VbMYB基因的重组质粒和重组基因工程菌的制备

利用特异引物对：ACGGGGGACTCTTGACATGTGCTTATTAAGTTGCATGATTC (划线部分为NcoI酶切位点)和ATTCGAGCTGGTCACCTTACAGTACTGCTTGTTCATCACC（划线部分为BstEII酶切位点），以实施例1中获得的产物为模板进行PCR反应，PCR反应体系为50μl，成分包括为：I-5TM2xHigh-Fidelity Master Mix 25μl，上下游引物(10μM)各2μl，模板DNA 1μl，H₂O 20μl。PCR程序为：90℃预变性3min，35个循环的98℃15s，56℃15s和72℃ 20s，72℃ 5min。。将获得的PCR产物回收后，采用Aidlab One Step Seamless Cloning kit将目的片段连接到经NcoI和BstEII酶切的pCAMBIA1302载体中，测序验证，获得含VbMYB基因的重组质粒。然后将阳性质粒导入农杆菌菌株GV3101中，获得含VbMYB基因的重组基因工程菌，即含有超量表达载体的农杆菌菌株GV3101-VbMYB。

实施例3 基因功能验证

选择烟草叶片验证VbMYB基因功能。

1、实验方法：用注射缓冲液（含10mM MES, 10mMgCl₂, 100μM乙酰丁香酮）将GV3101-VbMYB、GV3101-PsMYB10.1（申请号201811595512.1）和GV3101-PsbHLH（申请号201811595512.1）重悬至OD₆₀₀为0.7，并在室温条件下静置4h。

将GV3101-VbMYB和GV3101-PsMYB10.1分别与GV3101-PsbHLH菌液等体积混合。随后，选取长势优良普通烟草，以叶片中心叶脉为分界线，用无针头注射器将GV3101-VbMYB、GV3101-PsbHLH、GV3101-PsMYB10.1+GV3101-PsbHLH或GV3101-VbMYB+GV3101-PsbHLH菌液注射在叶片两侧，烟草于14h:10h光暗周期、24℃和70％空气湿度的条件下培养13天。

2、实验结果：

分析结果如图1显示，注射GV3101-VbMYB、GV3101-PsMYB10.1+GV3101-PsbHLH或GV3101-VbMYB+GV3101-PsbHLH农杆菌的烟草叶片均积累花色苷，着紫红色。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，与VbMYB的DNA序列具有90％以上同源性的DNA分子、由该蛋白衍生的蛋白的经过一个或几个氨基酸残基的改变蛋白质、含有VbMYB基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌及其他依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院果树研究所

<120> VbMYB基因及其编码蛋白与应用

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1145

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcagcttac atgaaaattc tccatgtgct tattaagttg catgattcaa ttaaagggtg 60

ctaccgtgct acgttggtac atgattagga aaatggacag agttccatta ggagtgagaa 120

agggtacttg gactaaggaa gaagactgtc ttctcaagaa gtgcattgag aagcatggag 180

aggggaagtg gcaccaagtt ccttacaaag caggattgaa tagatgcagg aaaagttgta 240

ggctgagatg gttgaattat ctgaggccaa atataaagag aggaaatttt actgtggatg 300

aaattgatct cattatcagg cttcataagc tcctgggcaa tagatggtcg ttaattgcgg 360

gtagacttcc aggaagaaca tcgaacgacg tgaaaaatta ctggaatacc catctaaaag 420

ggaaatcgac ggaccaaagt agagaggtac agaaatctaa aacgaccccg aatacgactg 480

aaaggaccac aatcatacgg cctcgaccac aaaccttctc caaaaatcaa catgttttga 540

tgggtagtac tgtcattgca gataatattc aaacaagaga tccaaatctc tcgaacccat 600

cccaaacaca accaccgggg gatgatgatg gaacattgtg gtgggatgac atgttgttca 660

attatgaaat tagcagagat atgatgacgt ggaccaatga cggagcaaat gaggaggcca 720

tgatggtgga taaccgtgaa gaagcaaaat caggtacaca aggagctggt ggggatcatt 780

acagttgtgt tcaagaagat cagaatgatt ggagtaacat ttttatggat aatgtggacc 840

tttgggatat tttaggtgat gaacaagcag tactgtaatg tttagcattt ctctggaata 900

attagtatcc gtcgattttt acgctttatg atttgtataa acaaaactag tttacgccac 960

cgtacacgca tggagtctcc tgtttgtgct atttttcagc acattaatga aaaattctag 1020

tagtggccca aagcccaact tagtgtccat atataagacc ttgatatgtt ctagaattag 1080

tagaatggaa aaccctgttc gtgcgtctca atcccgagag ccagcggcaa gcatttcttt 1140

gtttg 1145

<210> 2

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Cys Leu Leu Ser Cys Met Ile Gln Leu Lys Gly Ala Thr Val Leu

1 5 10 15

Arg Trp Tyr Met Ile Arg Lys Met Asp Arg Val Pro Leu Gly Val Arg

20 25 30

Lys Gly Thr Trp Thr Lys Glu Glu Asp Cys Leu Leu Lys Lys Cys Ile

35 40 45

Glu Lys His Gly Glu Gly Lys Trp His Gln Val Pro Tyr Lys Ala Gly

50 55 60

Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu

65 70 75 80

Arg Pro Asn Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Val Asp Glu Ile Asp Leu

85 90 95

Ile Ile Arg Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala

100 105 110

Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr Ser Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn

115 120 125

Thr His Leu Lys Gly Lys Ser Thr Asp Gln Ser Arg Glu Val Gln Lys

130 135 140

Ser Lys Thr Thr Pro Asn Thr Thr Glu Arg Thr Thr Ile Ile Arg Pro

145 150 155 160

Arg Pro Gln Thr Phe Ser Lys Asn Gln His Val Leu Met Gly Ser Thr

165 170 175

Val Ile Ala Asp Asn Ile Gln Thr Arg Asp Pro Asn Leu Ser Asn Pro

180 185 190

Ser Gln Thr Gln Pro Pro Gly Asp Asp Asp Gly Thr Leu Trp Trp Asp

195 200 205

Asp Met Leu Phe Asn Tyr Glu Ile Ser Arg Asp Met Met Thr Trp Thr

210 215 220

Asn Asp Gly Ala Asn Glu Glu Ala Met Met Val Asp Asn Arg Glu Glu

225 230 235 240

Ala Lys Ser Gly Thr Gln Gly Ala Gly Gly Asp His Tyr Ser Cys Val

245 250 255

Gln Glu Asp Gln Asn Asp Trp Ser Asn Ile Phe Met Asp Asn Val Asp

260 265 270

Leu Trp Asp Ile Leu Gly Asp Glu Gln Ala Val Leu

275 280

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcagcttac atgaaaattc tcc 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caaacaaaga aatgcttgcc g 21

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgggggact cttgacatgt gcttattaag ttgcatgatt c 41

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attcgagctg gtcaccttac agtactgctt gttcatcacc 40

Claims

1.乌饭VbMYB基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种如权利要求1所述乌饭VbMYB基因，其特征在于，所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

3.含有权利要求1所述乌饭VbMYB基因的重组表达载体pCAMBIA1302-VbMYB。

4.含有权利要求1所述乌饭VbMYB基因的基因工程菌GV3101-VbMYB。

5.一种如权利要求1-4任一所述的乌饭VbMYB基因在植物花色苷生物合成的基因工程和育种中的应用。