CN105132456A - 一种小麦钙网联蛋白基因TaCRT1在植物耐旱中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种小麦基因Ta<i>CRT1</i>在耐旱植物体培育中的应用。转化该基因的植物体可耐受干旱胁迫的生长环境。本发明经过一系列实验研究，发现该基因可调控植物对干旱引起的胁迫反应，表现出耐旱特性，证明该基因在植物的耐旱方面有着巨大的潜在应用功能。通过将该基因超表达并转化进植物体，可以获得耐干旱胁迫相关的转基因植物品种，从而实现植物的耐旱功能。本发明为培育耐旱转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。

Description

一种小麦钙网联蛋白基因TaCRT1在植物耐旱中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程应用技术领域，具体涉及一种小麦钙网联蛋白基因TaCRT1在植物耐旱中的应用。

背景技术

干旱缺水是全球农业生产面临的严重问题，也是制约粮食作物产量潜力发挥的最严重因素。因此，通过提高作物的耐旱能力从而增加作物产量，已成为农业可持续发展的重大需求。随着分子生物学和基因工程研究的深入，利用基因工程技术改良作物的抗旱性已成为培育抗旱作物新品种的重要途径之一。

在生存进化中，植物自身形成了一系列的调控机制来抵抗干旱胁迫，其中抗旱基因的表达是抗旱能力提升的本质原因。研究表明，与抗旱相关的基因主要包括两类：一类为功能基因，包括低分子可溶性糖、小分子蛋白等基因，部分酶类，晚期胚胎发生丰富蛋白基因LEA;另一类为各种参与水分胁迫信号传递的调节基因，包括脱落酸（abscisicacid,ABA）、乙烯（ethylene,ETH）等信号分子合成的关键酶类基因，DREB等转录因子编码基因，蛋白质磷酸酶2A及2C等基因，植物蛋白激酶编码基因。

钙网联蛋白（Calreticulin,CRT）是真核生物内质网中一个重要的分子伴侣，不同生物体中的CRT蛋白序列存在较高的保守性，主要由N、P、C这三个保守的结构域及信号肽与内质网四肽滞留信号序列（HDEL或KDEL）构成。目前，动物钙网联蛋白已得到深入研究，结果表明CRT具有Ca²⁺的调控、细胞黏附、T-细胞的识别、基因的转录及转录后调控等多种功能，尤其作为分子伴侣在内质网中能帮助肽链的正确折叠装配，防止错误折叠蛋白的积聚，有效去处错误蛋白对机体的胁迫作用。但植物钙网联蛋白基因功能的解析相对较少。

发明内容

技术要求

本发明所要解决的技术问题是提供小麦钙网联蛋白基因TaCRT1在植物耐旱性方面的应用，从而为培育耐旱植物新品种提供可能性。

本发明是这样实现的：小麦钙网联蛋白基因TaCRT1在植物耐旱中的应用。

该基因用于植物耐受干旱胁迫生长环境。

本发明所述的小麦钙网联蛋白TaCRT1，它是具有序列表中SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的蛋白质。其氨基酸序列与核苷酸序列申请人已经通过在先申请的发明专利中公开。

含有上述TaCRT1蛋白的表达载体和转基因细胞系也在本发明的保护范围之内，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和转基因细胞系。

小麦钙网联蛋白TaCRT1的编码序列在培育耐旱植物中的应用。利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的TaCRT1蛋白编码序列导入植物细胞，可改变植物耐旱的转基因细胞系及转基因植株。使用载体时，其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因（如潮霉素、卡那霉素和庆大霉素等），加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于快速和有效的获得转基因材料。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外源基因之间或是外源基因与终止子之间加入报告基因（GUS基因、GFP和萤火虫荧光素报告基因），构建外源基因和报告基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以观察报告基因的表达与否和表达量高低，推测外源基因在植物体内的表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以在构建载体时不携带任何筛选标记基因或非抗生素筛选标记基因，直接通过PCR鉴定或表型筛选鉴定。含有本发明的TaCRT1的表达载体可通过使用基因枪、农杆菌介导、发粉管通道、电击、显微注射、Ti质粒、Ri质粒或植物病毒等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的植株既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如：水稻、棉花、小麦、大豆、油菜、烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、白菜、萝卜、杨树、草坪草、苜蓿、药材和花卉等。

小麦钙网联蛋白TaCRT1的编码序列可提高植物的耐旱性。

有益效果

通过基因工程的方法将本发明提供的小麦钙网联蛋白TaCRT1转入植物中，可以提高植物的耐旱性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可广泛应用于各种植物的育种应用。

附图说明

图1为转基因拟南芥与非转基因拟南芥的比较；Col-0、非转基因拟南芥；T1、转基因拟南芥；

图2为干旱胁迫处理转基因与非转基因拟南芥植株；Col-0、非转基因拟南芥；T1、转基因拟南芥；

图3为转基因植株T₃种子在MS培养基上萌发对1uMABA表现敏感；Col-0、非转基因拟南芥；T1、转基因拟南芥。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明的实施例1：小麦钙网联蛋白TaCRT1的获得：

以小麦(TriticumaestivumL)品种望水白（Wangshuibai）（南京农业大学应用基因组室保存）为材料，在开花期将赤霉菌孢子液喷洒穗部，所用孢子液为江苏省范围内强致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子混合液，接种后立即套带保湿，同时用水接种做为对照。接种6小时、12小时、24小时后分别取麦穗，立即用液氮冷冻。取700mg冻存的麦穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL10%三氯醋酸/丙酮振荡混匀、-20℃沉淀1小时；4℃15,000g离心15min，沉淀重新悬浮于5mL冷丙酮中，-20℃放置2小时；4℃15,000g离心15min，沉淀悬浮于80%的冷丙酮中，-20℃放置1小时，离心去丙酮，将沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10μL裂解液（7M脲，2M硫脲，4%CHAPS，1%CA，0.3%蛋白酶抑制剂，50U/mLDNaseI）的比例加入裂解液，4℃搅拌抽提15min后加入14mM的DTT；4℃再搅拌20min，然后35,000g离心10min，上清即为蛋白抽提液。将蛋白提取液进行等电聚焦后，进行SDS-PAGE电泳，电泳缓冲液用Tris-Glycine-SDS（pH8.3）缓冲液，温度为17℃；先用2.5W/胶预电泳30min后，再用5W/胶电泳至溴酚蓝到玻璃板下缘为止。电泳结束后取下凝胶立即银染。分析蛋白质的丰度与对照相比超过3倍的蛋白点，取一个分子量为47.2千道尔顿，等电点为4.30的蛋白点进行质谱分析，该蛋白电的肽质指纹图谱数据与大麦蛋白T05705理论酶切的肽质指纹图谱数据相匹配。用大麦蛋白T05705检索小麦EST数据库，并进行contigs的拼接，然后用Macvector软件设计引物P1，P1引物如下：F-5’-TCCGATCGGATCGGGGTAAAG-3’；R-5’-CCAGTGCTCGTAGATGCTTCCAG-3’。用英俊公司的Trizol试剂盒提取望水白穗部的总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。采用Promega的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA为模板，用引物P1扩增目标片段。PCR反应体系为25μL，包含5ng模板，F和R引物各5pmol、2.5μl10xPCRbuffer、37.3nmolMgCl2、5nmoldNTP、0.5U的rTaq聚合酶。扩增程序为：94℃预变性3min，94℃20s,60℃30s,72℃延伸45s,30个循环后，72℃反应5min。通过PCR扩增，获得1248bp的核苷酸序列，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，该序列编码415个氨基酸。

本发明的实施例2：小麦钙网联蛋白TaCRT1编码序列的应用：

以望水白穗部的总cDNA为模板，用引物进行PCR扩增。引物对如下：5'-CAGCTCTAGAATGTTCTTCCAGGAGAAGTTC-3'；5'-GCTCGGATCCCTTCTCGTCATCAGAC-3'。将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶XbaI和BamHI进行酶切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的双元表达载体pBI121进行连接，获得由CaMV35S启动子启动的TaCRT1基因超量表达载体。用冻融法将获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，，通过含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml利福平的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1998年CloughandBent的方法，将携带有TaCRT1基因超量表达载体的农杆菌菌液浸泡拟南芥花朵进行遗传转化，收获得到的拟南芥种子种植于含有50μg/ml的卡那霉素的1／2MS培养基上进行筛选，获得目的基因超量表达的抗卡那霉素的转基因拟南芥。对于转化的转基因植株，我们首先提取基因组DNA，5'-CAGCTCTAGAATGTTCTTCCAGGAGAAGTTC-3'；5'-GCTCGGATCCCTTCTCGTCATCAGAC-3'进行PCR鉴定。对于PCR阳性的转基因植株，提取总RNA，经过DNAseI处理后，进行反转录合成cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，用与检测DNA相同的PCR引物和程序进行转录水平的鉴定。拟南芥自交繁殖后，将T₃代转基因拟南芥和非转基因拟南芥种子播种在装有营养土的盆钵，在光照培养箱内正常生长（图1）。3星期后，停止浇水做干旱处理，同时用水处理做对照。随着处理时间的延长，对照与转基因植株的生长都受到显著的抑制，叶片萎蔫，3星期后做复水处理（图2）。转基因植株能迅速恢复生长，非转基因植株大部分死亡，少部分缓慢恢复生长。转基因植株T₃种子在MS培养基上萌发表现对1uMABA表现敏感，转基因种子萌发受到明显抑制。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQIDNO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1131bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQIDNO.1

(2)SEQIDNO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：377a.a

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列描述：SEQIDNO.2。

SEQUENCELISTING

序列表

<110>贵州省油菜研究所

<120>一种小麦钙网联蛋白基因TaCRT1在植物耐旱中的应用

<130>nm:

<160>6

<170>PatentInversion

<210>1

<211>1131

<212>DNA

<213>小麦望水白

<220>

<221>CDS

<222>

<223>

<220>

<221>mRNA

<400>1

TTCTTCCAGGAGAAGTTCGAAGATGGTTGGGAAAGCCGGTGGGTCAAGTC50

TGAGTGGAAGAAGGATGAGAACATGGCTGGTGAATGGAACCACACATCTG100

GAAAATGGCACGGAGATGCCGAGGACAAAGGTATCCAAACCTCAGAGGAC150

TACAGGTTCTACGCCATCTCGGCGGAGTACCCTGAGTTCAGCAACAAGGA200

CAAGACACTCGTGCTGCAGTTCACGGTGAAGCATGAGCAGAAGCTTGACT250

GCGGTGGTGGTTACGTCAAGTTGCTTGGAGGTGATGTTGACCAGAAGAAA300

TTCGGTGGTGACACACCCTACAGCATTATGTTTGGACCAGATATCTGTGG350

GTACAGCACCAAGAAGGTTCACACTATCCTTACCAAGGATGGCAAGAACC400

ATTTGATCAAGAAGGACGTGCCTTGCGAGACTGATCAGCTGTCGCATGTG450

TACACTTTGATCATCCGCCCTGATGCCACATACAGCATTCTCATTGACAA500

CGAAGAGAAGCAAACTGGAAGCATCTACGAGCACTGGGATATTCTTCCTC550

CCAAGGAAATCAAGGACCCAGAAGCTAAGAAGCCAGAGGACTGGGATGAC600

AAGGAGTACATTCCCGATCCTGAGGACGTCAAGCCAGAGGGCTACGATGA650

CATTCCCAAGGAAGTCACCGATCCTGATGCTAAGAAGCCTGAGGATTGGG700

ATGATGAGGAAGATGGTGAATGGACTGCCCCAACCATCCCCAACCCAGAG750

TACAAGGGCCCATGGAAGCAAAAGAAAATCAAGAACCCTAACTACCAGGG800

CAAATGGAAGGCACCTATGATTGCCAACCCAGACTTCAAGGATGATCCTT850

ACATCTATGCTTTCGACAGCCTGAAGTACATCGGAATTGAGCTGTGGCAG900

GTTAAGTCAGGAACTTTGTTTGACAACATTCTCATCACTGACGATGCTGC950

TTTGGCTAAGACATTTGCTGAAGAGACCTGGGCCAAGCATAAGGAAGCTG1000

AGAAGGCTGCTTTCGACGCTGCTGAAAAGAAGAAGGAAGAGGAGGATGCT1050

TCCAAGGCTAGTGAGGACGATGATGACTTGGATGATGAGGAAGCCGATGA1100

CGAGGACAAGGATGACAAGGCTGGGTCTGAC1131

<210>SEQIDNO.2

<211>377

<212>

<213>小麦(TriticumaestivumL)

<400>2

1020304050

FFQEKFEDGWESRWVKSEWKDENMAGEWNHTSGKWHGDAEDKGIQTSED

60708090100

YRFYAISAEYPEFSNKDKTLVLQFTVKHEQKLDCGGGYVKLLGGDVDQKK

110120130140150

FGGDTPYSIMFGPDICGYSTKKVHTILTKDGKNHLIKKDVPCETDQLSHV

160170180190200

YTLIIRPDATYSILIDNEEKQTGSIYEHWDILPPKEIKDPEAKKPEDWDD

210220230240250

KEYIPDPEDVKPEGYDDIPKEVTDPDAKKPEDWDDEEDGEWTAPTIPNPE

260270280290300

YKGPWKQKKIKNPNYQGKWKAPMIANPDFKDDPYIYAFDSLKYIGIELWQ

310320330340350

VKSGTLFDNILITDDAALAKTFAEETWAKHKEAEKAAFDAAEKKKEEEDA

360370

SKASEDDDDLDDEEADDEDKDDKAGSD

<210>SEQIDNO.3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用大麦蛋白T05705检索小麦EST数据库，并进行contigs的拼接，然后用Macvector软件设计,用于以用于PCR扩增。

<400>3

TCCGATCGGATCGGGGTAAAG21

<210>SEQIDNO.4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用大麦蛋白T05705检索小麦EST数据库，并进行contigs的拼接，然后用Macvector软件设计,用于以用于PCR扩增。

<400>4

CCAGTGCTCGTAGATGCTTCCAG23

<210>SEQIDNO.5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>利用P1引物扩增的PCR片段的核苷酸序列信息，用Macvector软件设计引物,并在5’末端添加限制性内切酶XbaI位点及保护碱基，以用于PCR扩增。

<400>5

CAGCTCTAGAATGTTCTTCCAGGAGAAGTTC31

<210>SEQIDNO.6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>利用P1引物扩增的PCR片段的核苷酸序列信息，用Macvector软件设计引物,并在5’末端添加限制性内切酶BamHI位点及保护碱基，以用于PCR扩增。

<400>6

GCTCGGATCCCTTCTCGTCATCAGAC26

Claims (2)

1.一种小麦钙网联蛋白基因TaCRT1在植物耐旱中的应用。

2.根据权利要求1所述的小麦钙网联蛋白基因TaCRT1在植物耐旱中的应用，其特征在于：该基因用于植物耐受干旱胁迫生长环境。