CN103073626B - 一种小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206及其编码序列与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206，它是具有序列表中SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQIDNO：2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQIDNO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNO：2衍生的蛋白质。本发明还公开了上述小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列TaCRT1-681的应用。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206转入植物中，可以提高植物的耐盐性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可广泛应用于各种植物的育种应用。

Description

一种小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206及其编码序列与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206及其编码序列与应用。

背景技术

土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题，高浓度的盐将导致植物体内离子紊乱，引起植物产量降低，死亡率升高，在全世界现有耕地中，至少有20%的灌溉土地都受到盐胁迫的严重危害。为了适应盐胁迫，植物自身形成了一系列的调控机制：主要包括提高抗氧化酶系统的活性，消除自由基对植物机体的伤害，改变体内各种激素含量，离子选择性吸收，离子区域化，拒盐作用、合成渗透调节物质和ER（Endoplasmic Reticulum）相关的蛋白降解等。近期的研究逐渐把植物对盐胁迫反应与ER质量检测系统（Endoplasmic Reticulum Quality Control, ERQC）联系起来，在ERQC中包含一种特殊的UPS机制，称为ER相关的蛋白降解机制（ER Associated protein Degradation, ERAD），ERAD特异性地降解ER中错误折叠的蛋白。

小麦是世界上重要的粮食作物之一，但土壤的盐渍化往往导致其产量的下降。不同植物之间对盐胁迫的适应性机制存在相似性，因此，我们可以通过盐胁迫反应相关基因的应用来提高植物的耐盐性。盐胁迫反应的调控因子分为正调控因子和负调控因子。正调控因子的超量表达，可以提高植物的耐盐性；而抑制该基因的表达则会导致耐盐性的减弱。

钙网联蛋白（Calreticulin, CRT）是真核生物内质网中一个重要的分子伴侣，不同生物体中的CRT蛋白序列存在较高的保守性，主要由 N、P、C 这三个保守的结构域及信号肽与内质网四肽滞留信号序列（HDEL 或 KDEL）构成。目前，动物钙网联蛋白已得到深入研究，结果表明CRT具有Ca²⁺的调控、细胞黏附、T-细胞的识别、基因的转录及转录后调控等多种功能，尤其作为分子伴侣在内质网中能帮助肽链的正确折叠装配，防止错误折叠蛋白的积聚，有效去处错误蛋白对机体的胁迫作用。

发明内容

技术要求

本发明所要解决的技术问题是提供一种小麦耐盐钙网联蛋白片段TaCRT1-206。

本发明还要解决的技术问题是提供上述蛋白片段的编码序列。

本发明还要解决的技术问题是提供上述基因片段在培育耐盐品种中的应用。

本发明是这样实现的：一种小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206，它是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

所述的小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

所述的小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列，它是下列核苷酸之一：

（1）序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

（2）编码序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸；

（3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列含有681bp的核苷酸。

含有上述TaCRT1-206蛋白片段的表达载体和转基因细胞系也在本发明的保护范围之内，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和转基因细胞系。

小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列在培育耐盐品种中的应用。利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的TaCRT1-206蛋白片段编码序列TaCRT1-681导入植物细胞，可改变植物耐盐性的转基因细胞系及转基因植株。使用载体时，其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因（如潮霉素、卡那霉素和庆大霉素等），加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于快速和有效的获得转基因材料。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外源基因之间或是外源基因与终止子之间加入报告基因（GUS基因、GFP和萤火虫荧光素报告基因），构建外源基因和报告基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以观察报告基因的表达与否和表达量高低，推测外源基因在植物体内的表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以在构建载体时不携带任何筛选标记基因或非抗生素筛选标记基因，直接通过PCR鉴定或表型筛选鉴定。含有本发明的TaCRT1-681片段的表达载体可通过使用基因枪、农杆菌介导、发粉管通道、电击、显微注射、Ti质粒、Ri质粒或植物病毒等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的植株既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如：水稻、棉花、小麦、大豆、油菜、烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、白菜、萝卜、杨树、草坪草、苜蓿、药材和花卉等。

小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列可提高植物的耐盐性。

有益效果

通过基因工程的方法将本发明提供的小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206转入植物中，可以提高植物的耐盐性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可广泛应用于各种植物的育种应用。

附图说明

图1 转基因烟草的耐盐性得到了提高。

图2 盐胁迫处理转基因烟草与对照的根长比较。C89，野生型烟草；T-32，T-34，和T-36：转基因烟草。

图3 盐胁迫处理转基因烟草与对照的根长。C89，野生型烟草；T-32，T-34，和T-36：转基因烟草。

图4 盐胁迫处理转基因烟草与对照的根重。C89，野生型烟草；T-32，T-34，和T-36：转基因烟草。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明的实施例1：小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的获得。

以小麦(Triticum aestivum L)品种望水白（Wangshuibai）（南京农业大学应用基因组室保存）为材料，在开花期将赤霉菌孢子液喷洒穗部，所用孢子液为江苏省范围内强致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子混合液，接种后立即套带保湿，同时用水接种做为对照。接种6小时、12小时、24小时后分别取麦穗，立即用液氮冷冻。取700mg冻存的麦穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL 10%三氯醋酸/丙酮振荡混匀、-20℃沉淀1小时；4℃ 15,000g离心15min，沉淀重新悬浮于5mL冷丙酮中，-20℃放置2小时；4℃ 15,000g离心15min，沉淀悬浮于80%的冷丙酮中，-20℃放置1小时，离心去丙酮，将沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10μL裂解液（7M 脲，2M 硫脲，4% CHAPS，1% CA，0.3% 蛋白酶抑制剂，50U/mL DNase I）的比例加入裂解液，4℃搅拌抽提15min后加入14mM的DTT；4℃再搅拌20min，然后35,000g离心10min，上清即为蛋白抽提液。将蛋白提取液进行等电聚焦后，进行SDS-PAGE电泳，电泳缓冲液用Tris-Glycine-SDS（pH 8.3）缓冲液，温度为17℃；先用2.5W/胶预电泳30min后，再用5W/胶电泳至溴酚蓝到玻璃板下缘为止。电泳结束后取下凝胶立即银染。分析蛋白质的丰度与对照相比超过3倍的蛋白点，取一个分子量为47.2千道尔顿，等电点为4.30的蛋白点进行质谱分析，该蛋白电的肽质指纹图谱数据与大麦蛋白T05705理论酶切的肽质指纹图谱数据相匹配。用大麦蛋白T05705检索小麦EST数据库，并进行contigs的拼接，然后用Macvector软件设计引物P1，P1引物如下：F-5’- TCCGATCGGATCGGGGTAAAG-3’； R-5’- CCAGTGCTCGTAGATGCTTCCAG -3’。用英俊公司的Trizol试剂盒提取望水白穗部的总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。采用Promega的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA为模板，用引物P1扩增目标片段。PCR反应体系为25μL，包含5ng 模板，F和R引物各5 pmol、2.5 μl 10x PCR buffer、37.3 nmol MgCl2、5 nmol dNTP、0.5 U的rTaq聚合酶。扩增程序为：94℃ 预变性3 min，94℃ 20s, 60℃ 30s, 72℃ 延伸45s, 30个循环后，72℃反应5min。通过PCR扩增，获得681bp 的核苷酸序列，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测序获得序列如 SEQ ID NO:1所示。该序列编码206个氨基酸，如SEQ ID NO:2所示。

本发明的实施例2：小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的获得。

将小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列TaCRT1-681克隆到表达载体PET-32a的EcoR I和BamH I酶切位点中，转化E. coli。挑取单菌落于1 mL的LB（Amp 100μ g/mL）中摇菌过夜，转至200 mL新鲜的LB培养基中摇至菌液浓度A₆₀₀≈0.6；加入IPTG至终浓度为1.0 mM，37℃培养诱导表达3小时。菌液12,000 g离心5 min，沉淀悬浮于提取缓冲液中（3M NaCl、1mM PMSF、50mM pH8.0 磷酸缓冲液）超声破碎细胞，12,000 g离心20 min，收集上清。用10mM咪唑、50mM pH8.0 磷酸缓冲液平衡Ni-Sepharose凝胶；加入细胞裂解液室温结合20min、用5倍凝胶体积的平衡缓冲液洗涤3次；然后用含300mM咪唑、50mM pH8.0 磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液即为纯化后的Trx-TaCRT1-206蛋白。纯化后的表达蛋白经透析除盐后按每毫克蛋白样品加入0.1mg肠激酶，于40mM的琥珀酸缓冲液（pH=5.6）中25℃温育2小时切去组氨酸标签，透析过夜即得到纯化的小麦钙网联蛋白TaCRT的蛋白质片段TaCRT1-206。

本发明的实施例3：小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列的应用。

以望水白穗部的总cDNA为模板，用引物P2进行PCR扩增。P2引物对如下：F-5’- CAGCTCTAGAATGTTCTTCCAGGAGAAGTTC -3’； R-5’- GAAGGGATCCCCAGTGCTCGTAGATGCT -3’。将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶XbaI和BamHI进行酶切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的双元表达载体pBI121进行连接，获得由CaMV35S启动子启动的TaCRT基因片段TaCRT1-681超量表达载体。用冻融法将获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，，通过含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml利福平的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1985年Horsch等发表在Science第227期1229-1231页上的文章方法，将携带有TaCRT基因片段TaCRT1-681超量表达载体的农杆菌菌液浸泡烟草叶盘进行遗传转化，收获得到的烟草种子种植于含有100μg/ml的卡那霉素的1／2MS培养基上进行筛选，获得目的基因片段超量表达的抗卡那霉素的转基因烟草。对于转化的转基因植株，我们首先提取基因组 DNA，用与扩增 TaCRT1-681基因片段相同的引物和 PCR 程序进行 PCR 鉴定。对于 PCR 阳性的转基因植株，提取总 RNA，经过DNAse I处理后，进行反转录合成cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，用与检测DNA相同的 PCR 引物和程序进行转录水平的鉴定。烟草自交繁殖后，将T₃代转基因烟草和非转基因烟草种子播种在装有营养土的穴盘中，在光照培养箱内正常生长3星期后，直接用500mM的NaCl溶液浇灌，1次／天，同时用水处理做对照。随着处理时间的延长，对照与转基因植株的生长都受到显著的抑制，叶片发黄，但转基因植株生长势显著高于对照（图1）。处理两星期后转基因植株的初生根根长显著长于对照（图2, 3），根鲜重也显著高于非转基因植株（图4）。因此我们认为小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列TaCRT1-681对提高植物耐盐能力具有重要作用。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

 (1) SEQ ID NO. 1的信息

(i)序列特征：

  (A)长度：681bp

  (B)类型：核苷酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

 (2) SEQ ID NO. 2的信息

(i)序列特征：

  (A)长度：206 a.a

  (B)类型：氨基酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

SEQUENCE LISTING                        

序列表

<110>  贵州省油菜研究所

<120>  一种小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206及其编码序列与应用

<130>  nm:

<160>  2     

<170>  PatentIn version 

<210>  1

<211>  681

<212>  DNA

<213>  小麦望水白

<220>

<221>  CDS

<222>  (64)..(681)

<223>  

<220>

<221>  mRNA

                                                 tcc gat cgg atc g    13

gg gta aag gct tcc acg agc tct cgt ctc gac tgc cgc cgc ccg ccc gag    63

            atg gcg atc cgc cgt ggg tcc tcc tgc gcc gtc ctc gcc ctg ctc gcg ct    113

            Met Ala Ile Arg Arg Gly Ser Ser Cys Ala Val Leu Ala Leu Leu Ala Leu

            1               5                   10                  15

            c gcc tcc gtc gcc gcc gtc agc gcc gac gtc ttc ttc cag gag aag ttc g   163

              Ala Ser Val Ala Ala Val Ser Ala Asp Val Phe Phe Gln Glu Lys Phe

                      20                  25                  30    

            aa gat ggt tgg gaa agc cgg tgg gtc aag tct gag tgg aag aag gat gag    213

           Glu Asp Gly Trp Glu Ser Arg Trp Val Lys Ser Glu Trp Lys Lys Asp Glu

               35                  40                  45                  50

            aac atg gct ggt gaa tgg aac cac aca tct gga aaa tgg cac gga gat gc    263

            Asn Met Ala Gly Glu Trp Asn His Thr Ser Gly Lys Trp His Gly Asp Ala

                            55                  60                  65

            c gag gac aaa ggt atc caa acc tca gag gac tac agg ttc tac gcc atc t   313

              Glu Asp Lys Gly Ile Gln Thr Ser Glu Asp Tyr Arg Phe Tyr Ala Ile   

                      70                  75                  80

            cg gcg gag tac cct gag ttc agc aac aag gac aag aca ctc gtg ctg cag    363

           Ser Ala Glu Tyr Pro Glu Phe Ser Asn Lys Asp Lys Thr Leu Val Leu Gln

               85                  90                  95                  100

            ttc acg gtg aag cat gag cag aag ctt gac tgc ggt ggt ggt tac gtc aa    413

            Phe Thr Val Lys His Glu Gln Lys Leu Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys

                            105                 110                 115

            g ttg ctt gga ggt gat gtt gac cag aag aaa ttc ggt ggt gac aca ccc t   463

              Leu Leu Gly Gly Asp Val Asp Gln Lys Lys Phe Gly Gly Asp Thr Pro

                      120                 125                 130

            ac agc att atg ttt gga cca gat atc tgt ggg tac agc acc aag aag gtt    513

           Tyr Ser Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Tyr Ser Thr Lys Lys Val

               135                 140                 145                 150

            cac act atc ctt acc aag gat ggc aag aac cat ttg atc aag aag gac gt    563

            His Thr Ile Leu Thr Lys Asp Gly Lys Asn His Leu Ile Lys Lys Asp Val

                            155                 160                 165

            g cct tgc gag act gat cag ctg tcg cat gtg tac act ttg atc atc cgc c   613

              Pro Cys Glu Thr Asp Gln Leu Ser His Val Tyr Thr Leu Ile Ile Arg

                      170                 175                 180

            ct gat gcc aca tac agc att ctc att gac aac gaa gag aag caa act gga    663

           Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Ile Leu Ile Asp Asn Glu Glu Lys Gln Thr Gly

               185                 190                 195                 200

            AGC ATC TAC GAG CAC TGG  681

            Ser Ile Tyr Glu His Trp

                                206

<210>  SEQ ID NO. 2

<211>  206

<212>  

<213>  小麦(Triticum aestivum L)

<400>  

            Met Ala Ile Arg Arg Gly Ser Ser Cys Ala Val Leu Ala Leu Leu Ala Leu

            1               5                   10                  15

            Ala Ser Val Ala Ala Val Ser Ala Asp Val Phe Phe Gln Glu Lys Phe

                    20                  25                  30    

            Glu Asp Gly Trp Glu Ser Arg Trp Val Lys Ser Glu Trp Lys Lys Asp Glu

                35                  40                  45                  50

            Asn Met Ala Gly Glu Trp Asn His Thr Ser Gly Lys Trp His Gly Asp Ala

                            55                  60                  65

            Glu Asp Lys Gly Ile Gln Thr Ser Glu Asp Tyr Arg Phe Tyr Ala Ile   

                    70                  75                  80

            Ser Ala Glu Tyr Pro Glu Phe Ser Asn Lys Asp Lys Thr Leu Val Leu Gln

                85                  90                  95                  100

            Phe Thr Val Lys His Glu Gln Lys Leu Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys

                            105                 110                 115

            Leu Leu Gly Gly Asp Val Asp Gln Lys Lys Phe Gly Gly Asp Thr Pro

                    120                 125                 130

            Tyr Ser Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Tyr Ser Thr Lys Lys Val

                135                 140                 145                 150

            His Thr Ile Leu Thr Lys Asp Gly Lys Asn His Leu Ile Lys Lys Asp Val

                            155                 160                 165

            Pro Cys Glu Thr Asp Gln Leu Ser His Val Tyr Thr Leu Ile Ile Arg

                    170                 175                 180

            Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Ile Leu Ile Asp Asn Glu Glu Lys Gln Thr Gly

                185                 190                 195                 200

            Ser Ile Tyr Glu His Trp

                            205

<210> 3

<211> 21 

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用大麦蛋白T05705检索小麦EST数据库，并进行contigs的拼接，然后用Macvector软件设计,用于以用于PCR扩增。

<400> 3

TCCGA TCGGA TCGGG GTAAA G  21

<210> 4

<211> 23 

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用大麦蛋白T05705检索小麦EST数据库，并进行contigs的拼接，然后用Macvector软件设计,用于以用于PCR扩增。

<400> 4

CCAGT GCTCG TAGAT GCTTC CAG  23

<210> 5

<211> 31 

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>利用P1引物扩增的PCR片段的核苷酸序列信息，用Macvector软件设计引物,并在5’末端添加限制性内切酶XbaI位点及保护碱基，以用于PCR扩增。

<400> 5

CAGCT CTAGA ATGTT CTTCC AGGAG AAGTT C  31

<210> 6

<211> 28 

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>利用P1引物扩增的PCR片段的核苷酸序列信息，用Macvector软件设计引物,并在5’末端添加限制性内切酶BamHI位点及保护碱基，以用于PCR扩增。

<400> 6

GAAGG GATCC CCAGT GCTCG TAGAT GCT  28

Claims (4)

1.一种小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列，其特征在于：它是下列核苷酸之一：

（1）序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

（2）编码序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列，其特征在于：小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.一种如权利要求1所述的小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列在培育耐盐品种中的应用。

4.根据权利要求3所述的小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列在培育耐盐品种中的应用，其特征在于：小麦钙网联蛋白片段TaCRT1-206的编码序列可提高植物的耐盐性。

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