CN101532005B

CN101532005B - 一种大豆plp类酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101532005B
Application number: CN2009100294502A
Authority: CN
Inventors: 喻德跃; 宁慧霞; 姚瑶
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2009-04-14
Filing date: 2009-04-14
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2029-04-14
Also published as: CN101532005A

Abstract

本发明公开了一种大豆PLP类酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该大豆PLP类酶，命名为GmCBL酶，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因为GmCBL基因SEQ ID NO.1的DNA序列。本发明大豆PLP类酶及其编码基因可用于培育高含量蛋氨酸植物品种特别是高含量蛋氨酸大豆品种。过量表达GmCBL的烟草与未转基因烟草相比，其蛋氨酸含量显著提高，说明GmCBL基因对提高植物的蛋氨酸含量能力方面起着重要作用。

Description

一种大豆PLP类酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及与蛋氨酸合成相关的吡哆醛-5′-磷酸依赖碳-硫(C-S)裂解酶(pyridoxal-5′-phosphate-dependent carbon-sulfur(C-S)lyase，PLP)及其编码基因与应用，并涉及来源于大豆的与蛋氨酸合成相关的PLP类酶GmCBL及其编码基因与其在培育高含量蛋氨酸植物品种中的应用。

背景技术

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上主要的粮食和油料作物，是人类和动物食物中高质量植物蛋白质的主要来源。随栽培条件和生长环境，大豆含有的蛋白质为30-55％，对大豆蛋白需求超过最一般的消费食物资源。但含硫半光氨酸和蛋氨酸含量少，是大豆蛋白质营养价值的限制因素，大豆蛋白中第一限制性氨基酸是蛋氨酸，其限制和降低了其它氨基酸的有效性。目前大豆蛋白质改良的最主要目标是提高蛋白质含量的同时，增加含硫氨基酸的即蛋氨酸(Met)的含量，以提高作为人蓄植物蛋白主要来源的大豆营养价值和经济效益。利用基因工程手段改良大豆含硫氨基酸含量，有效的途径之一是对涉及硫生物合成路径中的关键酶进行操作。Cystathionine β-lyase(CBL)(EC 4.4.1.8)，是PLP(pyridoxal-5′phosphate-dependent carbon-sulfur(C-S)lyase)裂解酶类α家族内的γ亚家族，这个酶主要参与微生物和植物蛋氨酸生物合成的倒数第二步骤，其催化裂解L型-胱硫醚生成同型半胱氨酸，丙酮酸和NH₃。CBL酶是广泛存在于植物、酵母、细菌以及真菌中。目前主要从大肠杆菌、拟南芥、马铃薯、水稻、菠菜等克隆出此基因。系统发育分析表明，CBL基因主要分为三种类型：单子叶植物、双子叶植物和藻类植物。

蛋白资源短缺是21世纪面临的全球性严重问题，尤其是发展中国家，因此尽快提高大豆品种蛋白质含量的同时，积极改善蛋白质的品质，提高其营养价值，对改善人类生活质量和畜牧产业具有积极而深远的现实意义。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种大豆PLP类酶及其编码基因与应用。

技术方案

本发明所提供的大豆PLP类酶，名称为GmCBL，来源于大豆属大豆[Glycinemax(L.)]，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。

上述的大豆PLP类酶的编码基因，其cDNA基因具有序列表中GmCBL基因SEQID NO.1的DNA序列；其中，序列表中的GmCBL基因SEQ ID NO.1由1404个脱氧核苷酸组成，本序列为GmCBL基因的读码框，编码具有序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明GmCBL基因SEQ ID NO.1的表达载体是指pMDC83-GmCBL植物过量表达载体，宿主菌是指将GmCBL基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

扩增GmCBL基因的引物是，

GmCBL ORF正向引物：5‘-ATGTTTTCTTCTGCAATTT-3’，

GmCBL ORF反向引物：5‘-AAGAGGCCCTGTTCTAAGT-3’。

上述大豆PLP类酶GmCBL酶及其编码基因GmCBL基因可在培育高含量蛋氨酸植物中得到应用。

有益效果

导入过量表达GmCBL的烟草与未转基因烟草相比，其蛋氨酸含量显著提高，说明GmCBL基因对提高植物的蛋氨酸含量方面起着重要作用。

本发明的GmCBL对培育高含量蛋氨酸植物品种特别是高含量蛋氨酸大豆，提高农作物特别是大豆的品质具有重要意义。

利用植物表达载体，将本发明的GmCBL的编码基因导入植物细胞，可获得高含量蛋氨酸的转基因细胞系及转基因植株。

使用GmCBL构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GmCBL的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GmCBL基因在大豆染色体位置结构示意图

图2为含有GmCBL的植物表达载体的部分结构示意图，此表达载体在大肠杆菌和农杆菌中，抗卡那霉素(Km，50mmol/l)、潮霉素B(hygromycin，50mmol/l)

图3为转GmCBL烟草株系19、株系20、株系23与野生型植株荧光定量(QRT-PCR)表达分析比较图

图4为转基因株系19、株系20、株系23和野生型植株蛋氨酸相对含量的统计分析

(*，P≤0.05；**，P≤0.01)

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

一、大豆GmCBL及其编码基因的cDNA克隆与鉴定

大豆(Glycine max(L.)Merr.)材料南农88-31(简写NN88-31)(余本水，中国种植科技育种成果指南，2003，237)由南京农业大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供，材料种植于网室，常规田间管理。依据模式植物拟南芥(AtHCBL，L40511)上报道鉴定的胱硫醚β-裂解酶(cystathionine β-lyase)基因，并依据大豆的EST信息，及物种间氨基酸序列的同源性分析，序列拼接、分析，其具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由468个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)预测出GmCBL基因从1-33具有叶绿体转运肽结构，第81位点具有亮氨酸富集核输出信号特点，第134位是糖基化位点(0-(alpha)-GlcNAc glycosylation sites)。第81位K为赖氨酸残基，为辅因子磷酸吡多醛的结合位点。GmCBL蛋白有多个磷酸化作用位点。

用Peimer3程序根据GmCBL基因序列设计引物：

GmCBL ORF sense：5‘-ATGTTTTCTTCTGCAATTT-3’，

GmCBL ORF antisense：5‘-AGAGGCCCTGTTCTAAGT-3’应用RT-PCR方法，从大豆总RNA中扩增GmCBL基因。取大豆88-31叶片，置于液氮中研碎，RNA提取依据TIANGEN总RNA提取试剂盒RNA Plant Extraction kit DP417进行。cDNA第一链合成依据TaKaRa试剂公司cDNA第一链合成试剂盒TaKaRa PrimeScript^TM 1ststrand cDNA Synthesis Kit D6110A，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。25μl μl PCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(10μM)、2.5μl 10×PCR缓冲液、2.5μl Mg²⁺、4μl dNTP(10mM)和1.25ULA Taq DNA聚合酶，用超纯水补足25μl。反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，其程序为95℃变性5min；再94℃ 30sec，56℃ 50sec，72℃ 1min30sec，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物回收后经链接pGEM-T Easy载体、转化大肠杆菌DH5α、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，命名为GmCBL基因，然后将SEQ ID NO.1序列放入大豆基因组数据库中Blast，确定SEQ ID NO.1在大豆染色体中的位置(图1)。

二、GmCBL基因编码蛋白的功能鉴定

利用Invitrogen公司的

Technology with Clonase^TM II试剂盒，将GmCBL基因正向插入到表达载体pMDC83(Sokolov et al，2005，PNAS，103；9732-9737)(图2)中，得到pMDC83-GmCBL植物过量表达载体，用冻融法将pMDC83-GmCBL转入根癌农杆菌菌株EHA105(Avsian-Kretchmer et al，2004，Plant Physiology，135：1685-1696)中。pMDC83-GmCBL通过农杆菌EHA105的介导转化烟草，PCR检测结果表明获得30株阳性植株，结合QRT-PCR分析结果，根据GmCBL基因表达量选择了表达量高的3个阳性转基因株系(株系19、株系20、株系23)，GmCBL基因在3个阳性转基因株系中表达极显著(图3)。取十个星期左右的株系19、株系20、株系23和野生型株系的叶片用A200 amino acid Nova analyzer氨基酸分析仪测定自由氨基酸含量，检测和判定依据标准为JY/Y 019-1996氨基酸分析方法通则，结果如图4所示，转基因株系与野生型烟草相比蛋氨酸含量均极显著提高，其中株系19(0.404％)比野生型(0.196％)增长0.208％、株系20(0.741％)增长0.545％、株系23(0.515％)增长0.319％。说明过量表达GmCBL基因能提高转基因烟草的蛋氨酸含量。转基因株系(19、20、23)与野生型株系在表型上没有差异。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种大豆PLP类蛋白及其编码基因与应用

<130>说明书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1404

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max L.)

<220>

<221>GmCBL基因读码框(ORF)

<222>(1)..(1404)

<223>

<400>1

atgttttctt ctgcaatttc tccgaagccc ttccttcggt ccctcgtcat tgatcgttac 60

gctcagagca caactactgc aaccaggtgt gagtgcttgg ggtttaacaa gtcagaaaat 120

ttcagtacca agagagagtt gtgtgctgag gggttcaagc tgaattgctt ggttgaaaat 180

agagagatgg atgtggagtc atcatcatca tcatctttgg tggatgatgc ttccttgagc 240

ttaagtgaag aggatttagg ggagcctagt atctcaacat tggtgatgaa tttcgagagt 300

aagttcgatc cttttggagc aattagtacc cctctttacc aaacggctac ttttaagcag 360

ccttctgcaa tagaaaacgg cccctatgac tataccagaa gtggaaatcc tacacgagat 420

gctttagaaa gtttactagc aaagcttgat aaagcagata gagccctgtg cttcaccagt 480

ggaatggctg ctttgagtgc tgttgttcgt cttgttggaa ctggcgagga aattgtcgcc 540

ggagatgatg tatatggtgg ctcagatagg ttgctgtctc aagtggttcc aaggactgga 600

attgtggtga agcgggcaaa tacatgtgat ctaaatgagg ttgcagcagc cattggaccc 660

aagactaagc ttgtgtggct tgagagtcca accaatcctc ggctacaaat ttctgatatt 720

caaaaaatat cagagatagc tcattcacat ggtgctcttg tgttagtgga caatagtata 780

atgtcacctg tgttgtctcg gccattggaa cttggagcag atattgtcat gcactctgct 840

acaaaattta ttgctggaca tagtgacatt atggctggtg tgcttgctgt gaagggtgaa 900

aagttgggaa aggaattgta tttcttgcaa aatgcagagg gttcaggctt agcaccattt 960

gactgttggc tttgtttgcg aggaatcaag acaatggccc tgcgaattga aaaacaacag 1020

gataatgcac agaagattgc tgagttcctt gcctcccatc ctcgagtgaa gaaagtgaat 1080

tatgctggct tgcctggtca tcctggtcgt gatttacact attctcaggc aaagggtgca 1140

ggatctgtgc ttagcttctt gactggttca ttggaacttt caaagcatat tgttgaaact 1200

accaaatact acagtataac cgtcagcttt gggagtgtga agtcccttat tagcatgcca 1260

tgctttatgt cacatgcaag catacctgct gcagttcgtg aggccagagg tttaactgaa 1320

gatcttgtac gtatatctgt gggaattgag gatgtgaatg atctcattgc tgatcttgac 1380

aatgcactta gaacagggcc tctt 1404

<210>2

<211>468

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max L.)

<220>

<221>GmCBL蛋白序列

<222>(1)..(468)

<223>

<400>2

Met Phe Ser Ser Ala Ile Ser Pro Lys Pro Phe Leu Arg Ser Leu Val

1 5 10 15

Ile Asp Arg Tyr Ala Gln Ser Thr Thr Thr Ala Thr Arg Cys Glu Cys

20 25 30

Leu Gly Phe Asn Lys Ser Glu Asn Phe Ser Thr Lys Arg Glu Leu Cys

35 40 45

Ala Glu Gly Phe Lys Leu Asn Cys Leu Val Glu Asn Arg Glu Met Asp

50 55 60

Val Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Val Asp Asp Ala Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Ser Glu Glu Asp Leu Gly Glu Pro Ser Ile Ser Thr Leu Val Met

85 90 95

Asn Phe Glu Ser Lys Phe Asp Pro Phe Gly Ala Ile Ser Thr Pro Leu

100 105 110

Tyr Gln Thr Ala Thr Phe Lys Gln Pro Ser Ala Ile Glu Asn Gly Pro

115 120 125

Tyr Asp Tyr Thr Arg Ser Gly Asn Pro Thr Arg Asp Ala Leu Glu Ser

130 135 140

Leu Leu Ala Lys Leu Asp Lys Ala Asp Arg Ala Leu Cys Phe Thr Ser

145 150 155 160

Gly Met Ala Ala Leu Ser Ala Val Val Arg Leu Val Gly Thr Gly Glu

165 170 175

Glu Ile Val Ala Gly Asp Asp Val Tyr Gly Gly Ser Asp Arg Leu Leu

180 185 190

Ser Gln Val Val Pro Arg Thr Gly Ile Val Val Lys Arg Ala Asn Thr

195 200 205

Cys Asp Leu Asn Glu Val Ala Ala Ala Ile Gly Pro Lys Thr Lys Leu

210 215 220

Val Trp Leu Glu Ser Pro Thr Asn Pro Arg Leu Gln Ile Ser Asp Ile

225 230 235 240

Gln Lys Ile Ser Glu Ile Ala His Ser His Gly Ala Leu Val Leu Val

245 250 255

Asp Asn Ser Ile Met Ser Pro Val Leu Ser Arg Pro Leu Glu Leu Gly

260 265 270

Ala Asp Ile Val Met His Ser Ala Thr Lys Phe Ile Ala Gly His Ser

275 280 285

Asp Ile Met Ala Gly Val Leu Ala Val Lys Gly Glu Lys Leu Gly Lys

290 295 300

Glu Leu Tyr Phe Leu Gln Asn Ala Glu Gly Ser Gly Leu Ala Pro Phe

305 310 315 320

Asp Cys Trp Leu Cys Leu Arg Gly Ile Lys Thr Met Ala Leu Arg Ile

325 330 335

Glu Lys Gln Gln Asp Asn Ala Gln Lys Ile Ala Glu Phe Leu Ala Ser

340 345 350

His Pro Arg Val Lys Lys Val Asn Tyr Ala Gly Leu Pro Gly His Pro

355 360 365

Gly Arg Asp Leu His Tyr Ser Gln Ala Lys Gly Ala Gly Ser Val Leu

370 375 380

Ser Phe Leu Thr Gly Ser Leu Glu Leu Ser Lys His Ile Val Glu Thr

385 390 395 400

Thr Lys Tyr Tyr Ser Ile Thr Val Ser Phe Gly Ser Val Lys Ser Leu

405 410 415

Ile Ser Met Pro Cys Phe Met Ser His Ala Ser Ile Pro Ala Ala Val

420 425 430

Arg Glu Ala Arg Gly Leu Thr Glu Asp Leu Val Arg Ile Ser Val Gly

435 440 445

Ile Glu Asp Val Asn Asp Leu Ile Ala Asp Leu Asp Asn Ala Leu Arg

450 455 460

Thr Gly Pro Leu

465

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>GmCBL ORF正向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>3

atgttttctt ctgcaattt 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>GmCBL ORF反向引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>4

aagaggccctgttctaagt 19

Claims

1.一种大豆吡哆醛-5′-磷酸依赖碳-硫(C-S)裂解酶PLP类酶，命名为GmCBL酶，其序列为SEQ ID NO.2。

2.编码权利要求1所述的大豆PLP类酶的基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，为大豆PLP类酶的cDNA基因，其序列为SEQ ID NO.1。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，是指pMDC83-GmCBL植物过量表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。

7.根据权利要求6所述的宿主菌，是指将GmCBL基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

8.扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征是，

GmCBL ORF正向引物：5‘-ATGTTTTCTTCTGCAATTT-3’

GmCBL ORF反向引物：5‘-AAGAGGCCCTGTTCTAAGT-3’。

9.权利要求1所述的大豆PLP类酶在培育高含量蛋氨酸植物中的应用。

10.权利要求2或3所述的大豆PLP类酶编码基因在培育高含量蛋氨酸植物中的应用。