CN107012166A

CN107012166A - 水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用

Info

Publication number: CN107012166A
Application number: CN201710216526.7A
Authority: CN
Inventors: 张建军; 彭新湘; 江小梅; 刘坤; 刘衡郴; 梁枫
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2017-04-05
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2037-04-05
Also published as: CN107012166B

Abstract

本发明公开了水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用。本发明的水稻OsAT1蛋白的编码基因可以插入到植物表达的多克隆位点制备成重组表达载体，进一步构建转基因植物，导入该基因的水稻能导致水稻叶片硼元素含量增加。本发明还公开了所述蛋白的编码基因、含有所述基因的质粒、该种质粒的植物表达载体、相应的转基因植物细胞，以及对水稻硼含量进行改造的方法。本发明有助于研究水稻硼转运的分子机制，对生产上培育不同硼含量的水稻品种，或是通过转基因的方法调控水稻或其他作物的硼含量具有很大的应用价值。

Description

水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用。

背景技术

硼是植物正常生长发育所必需的微量元素之一，对植物生长有重要的作用。研究表明：植物细胞壁和细胞膜的结构稳定性都需要硼的存在(Hu and Brown.Localizationof boron in cell walls of squash and tobacco and its association withpectin.Plant Physiology,1994,105(2):681-689；Matoh et al.Isolation andcharacterization of a boron-polysaccharide complex from radish roots.PlantCell and Physiology,1993,34(4):639-642)，硼参与植物生殖代谢，在植物花粉形成、花粉管萌发和受精作用中具有重要作用，并对植物中各种物质代谢起着重要的作用，如酚类物质(Ruiz et al.Relationship between boron and phenolic metabolism in tobaccoleaves.Phytochemistry,1998,48(2):269-272)、IAA等激素(施益华和刘鹏.硼在植物体内生理功能研究进展.亚热带植物科学,2002,31(2):64-69；Wang et al.Involvement ofauxin and CKs in boron deficiency induced changes in apical dominance of peaplants(pisum sativum L.).Journal of Plant Physiology,2006,163(6):591-600)。缺硼或硼过量均会对植物生长产生不利的影响，油菜“花而不实”(刘积述和陈智君.甘兰型油菜缺硼症状与喷硼试验.福建农业科技,1979,5:6)、棉花“蕾而不花”(周世恭.硼与植物开花结果.1980,6:017)、小麦“穗而不实”(李文雄等，小麦大面积不结实原因的研究.东北农学院学报,1978,3:19)等都是作物缺硼的典型病症；而硼过量不仅会抑制植株生长，造成叶尖或成熟叶缘失绿并出现黄褐色坏死斑(Nable et al.,Boron toxicity.Plant andsoil,1997,193:181-1998；Reid et al.,A critical analysis of the causes of borontoxicity in plants.Plant,Cell and Environment,2004,27:1405-1414)，而且会造成水稻和绿豆等作物籽粒变小，产量下降(Ochiai et al,Boron toxicity in rice(Oryzasativa L.).Ⅰ.Quantitative trait locus(QTL)analysis of tolerance to borontoxicity.Theoretical and Applied Genetics,2008,117:125-133；Chatterjee et al,Biochemical changes,yield,and quality of gram under boronstress.Communications in Soil Science and Plant Analysis,2005,36:1763-1771)。但硼既不是酶的组分，也不参与电子传递和氧化还原能力，相较于其他营养元素，人们对硼的吸收、运输和生理功能的认识还比较缺乏。因此，明确植物吸收硼、分配硼的机理对提高农作物产量和改善品质具有非常重要的意义。

不同的植物中硼含量变化很大，含量低的只有2mg.kg^-1，而含量高的可达100mg.kg^-1(陆景陵，植物营养学(上册).北京：中国农业出版社，2003)。土壤和植物中硼元素以不带电荷的硼酸形式存在，植物体吸收和运输硼的主要形式为硼酸。硼酸主要通过两种方式进入植物根系细胞：一是通过细胞质膜磷脂双分子层的被动扩散进入根系细胞，通过共质体和质外体途径装载进入木质部导管，随蒸腾流运输到地上部；二是通过通道蛋白和转运蛋白的调控可促进硼的扩散并主动运输硼进入细胞；2002年，Takano等在拟南芥中成功克隆到第一个硼的外向转运蛋白(Efflux-type borate transporter)BOR1，定位于木质部周围的中柱鞘细胞的内膜，促进硼向木质部的装载从而随蒸腾流运输到植物体的各个部位(Takano et al.,Arabidopsis boron transporter for xylem loading.Nature,2002,420(6913):337-340)，在低硼下负责将硼从根部运向地上部；然而在高硼下，体内的BOR1会被内吞体吸收并运往液泡进行降解(Takano et al.,Endocytosis anddegradation of BOR1,a boron transporter of Arabidopsis thaliana,regulated byboron availability.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2005,102(34):12276-12281)。随后，在拟南芥中有发现AtBOR2、AtBOR4、AtNIP5；1、AtNIP6；1也具有转运硼的功能(Miwa et al.,Roles of BOR2,aboron exporter,in cross linking of RhamnogalacturonanⅡ and root elongationunder boron limitation in Arabidopsis.Plant Physiol,2013,163:1699-1709；Miwaet al.,Plants tolerant of high boron levels.Science,2007,318:1417；Takano etal.,The Arabidopsis major intrinsic protein NIP5；1is essential for efficientboron uptake and plant development under boron limitation.Plant Cell,2006,18:1498-1509；Tanaka et al.,NIP6；1is a boric acid channel for preferentialtransport of boron to growing shoot tissues in Arabidopsis.Plant Cell,2008,20:2860-2875)。而在近几年，在水稻也克隆到多个转运硼的蛋白基因，OsBOR1是水稻中第一个报道定位于质膜上的外向型硼转运蛋白，并在内皮层和外皮层同时表达，缺硼条件下参与硼高效吸收进入根系细胞；与AtBOR1不同的是，OsBOR1不论是缺硼条件还是正常硼条件下，其在根中的表达量均高于地上部的表达量(Nakagawa et al.,Cell-typespecificity of the expression of OsBOR1,a rice efflux boron transporter gene,is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake andxylem loading.Plant Cell,2007,19:2624-2635)；OsBOR4是一个在花粉中特异表达的外向型硼转运蛋白，对花粉的萌发和花粉管的延伸起重要作用(Tanaka et al.,Roles ofpollen-specific boron efflux transporter,OsBOR4,in the rice fertilizationprocess.Plant and cell Physiology,2013,54:2011-2019)；OsPIP2；4和OsPIP2；7是两个编码水稻质膜内在蛋白基因介导了硼的转运，在硼胁迫下，它们在地上部的表达下调，而在根中被显著上调，负责将水稻体内过量的硼转运到体外，提高水稻对硼胁迫的抗性(Kumaret al.,Two rice plasma membrane intrinsic proteins,OsPIP2；4and OsPIP2；7,areinvolved in transport and providing tolerance to boron toxicity.Planta,2014,239:187-198)；OsNIP3；1是与AtNIP5；1和AtNIP6；1最相似的通道蛋白，主要在外皮层表达，负责调节水稻地上部和根之间硼的分布(Hanaoka et al.,OsNIP3；1,a rice boric acidchannel,regulates boron distribution and is essential for growth under boron-deficient conditions.The Plant Journal,2014,78:890-8-902)；DTE1与拟南芥中AtNIP5；1为直系同源基因，定位于细胞质膜，主要在水稻根中的外皮层细胞表达；在缺硼条件下，该基因在地上部和根中大量诱导表达，主要负责在缺硼条件下通过影响硼的转运调节水稻生长发育(Liu et al.,Dwarf and tiller-enhancing 1regulates growth anddevelopment by influencing boron uptake in boron limited conditions inrice.Plant Science,2015,236:18-28)。

水稻OsAT1基因编码一个阴离子通道蛋白，该基因与硅酸分泌通道基因Lsi2编码的蛋白属于同一基因家族(Ma et al,An efflux transporter of silicon inrice.Nature,2007,448(12):209-213)，但其编码的蛋白序列与Lsi2一致性为56％，是一个新的通道蛋白，目前还没有关于OsAT1具有硼转运的相关功能研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用。

所述应用优选为所述的水稻OsAT1蛋白在制备改善植物硼含量的药物中的应用，和/或所述的水稻OsAT1蛋白的编码基因在制备改善植物硼含量的转基因植物中的应用。

所述的水稻OsAT1蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或是具有通过突变、删除、插入或取代方式将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的至少1个氨基酸改变的序列。

编码所述的水稻OsAT1蛋白的基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；或在严格条件下可与SEQ ID NO.1杂交并且编码所述的水稻OsAT1蛋白的DNA分子，所述的严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次；或者与SEQ ID NO.1的序列有90％以上的同源性(优选95％以上同源性)，并且编码上述水稻OsAT1蛋白的DNA分子。

编码所述水稻OsAT1蛋白的基因的启动子，核苷酸序列优选为如SEQ ID NO:3所示；或严格条件下可与SEQ ID NO:3所示的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子。

所述的严格条件是：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗杂交膜一次。

一种表达载体，是由所述水稻OsAT1蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成。

此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或者转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或是邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构区域。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可以产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除秀剂基因)等。

以上所述任意一种表达载体，所述的植物表达载体为pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI121，或其他衍生植物表达载体。

携带有本发明的水稻OsAT1蛋白的编码基因的植物表达载体可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或是组织中。被转化的宿主植物可以是水稻或其它作物。

一种改善植物硼含量的转基因植物，通过包括如下步骤的制备方法制备得到：将所述的水稻OsAT1蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建重组植物表达载体；将所述的重组植物表达载体转化到宿主植物进行表达，得到所述的改善植物硼含量的转基因植物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的实验结果表明，OsAT1过量表达植株表现为水稻叶片硼含量显著提高，籽粒千粒重下降，而OsAT1干涉植株水稻叶片硼含量显著降低，籽粒千粒重略有增加；OsAT1蛋白和其编码基因对调控水稻硼含量有重要的实际意义，在实际应用中可以将OsAT1基因转入不同的水稻品种中以培育更加理想的水稻栽培品种，或调节OsAT1基因的表达获得相应的水稻硼含量的水稻品种。OsAT1蛋白及其编码基因在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1是水稻OsAT1转基因植株的表型照片图；其中，OsAT1i9-5，OsAT1i8-3为OsAT1干涉表达转基因植株；WT为野生型植株中花11；OsAT1OV3-3，OsAT1OV4-1为OsAT1过量表达转基因植株。

图2是荧光定量PCR转基因植株中OsAT1的表达量结果分析图；其中，OsAT1i9-5，OsAT1i8-3表示OsAT1干涉表达转基因植株；WT表示野生型植株中花11；OsAT1OV3-3，OsAT1OV4-1表示OsAT1过量表达转基因植株。

图3是转基因水稻叶片中硼含量测定的结果分析图；其中，OsAT1i9-5表示OsAT1干涉表达转基因植株；WT表示野生型植株中花11；OsAT1OV3-3表示OsAT1过量表达转基因植株。

图4是测定不同酵母细胞中硼含量的结果分析图；其中，pYES2表示pYES2空载体；OsBOR1表示酵母细胞表达OsBOR1；OsAT1表示酵母细胞表达OsAT1。

图5是不同浓度硼处理下OsAT1转基因植株的表型照片图；其中，OsAT1i9-5表示OsAT1干涉表达转基因植株；WT:野生型植株中花11；OsAT1OV3-3表示OsAT1过量表达转基因植株。

图6是测定不同浓度硼处理下OsAT1转基因植株的千粒重的结果分析图；其中，OsAT1i9-5表示OsAT1干涉表达转基因植株；WT:野生型植株中花11；OsAT1OV3-3表示OsAT1干涉表达转基因植株。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 OsAT1基因的获得

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于该基因的cDNA序列(SEQID NO:1)设计引物，

其中，过量表达载体引物序列如下：

OsAT1-F1:ACGAAGCTTGTTCTTGATTGGCGGCAATG(SEQ ID NO:4下划线为限制性内切酶HindIII识别位点)

OsAT1-R1:ACTACGCGTTCAGTTGCTTCTGATGAGCAG(SEQ ID NO:5下划线为限制性内切酶MluI识别位点)

干涉表达载体引物序列如下：

OsAT1-F2:AACAGAGCTCATCCTGCTCTGCCTCTACTG(SEQ ID NO:6下划线为限制性内切酶SacI识别位点)

OsAT1-R2:CCACAAGCTTCCAGCATGCTCAATGTGATG(SEQ ID NO:7下划线为限制性内切酶HindIII识别位点)

以粳稻品种中花11号2周的幼苗叶片cDNA为模板，过量表达DNA在引物OsAT1-F1和OsAT1-R1的引导下，用常规方法扩增OsAT1基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化大约1600bp左右的DNA片段；干涉表达DNA在引物OsAT1-F2和OsAT1-R2的引导下，用常规方法扩增OsAT1基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化大约400bp左右的DNA片段，分别将片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得pMD18-T-OsAT1-1和pMD18-T-OsAT1-2载体，送北京奥科生物技术有限公司测序。

测序结果表明，两个DNA片段的序列与SEQ ID NO:1所示序列的一致性为100％，并在其DNA两端引入了合适的酶切位点。

实施例2遗传转化鉴定目的基因的功能

分别将OsAT1基因克隆入植物过量表达载体pCAMBIA1380(购自澳大利亚CAMBIA公司)多克隆位点的HindIII和MluI酶切位点之间和干涉表达载体pRNAi-Ubi(载体信息参考胡旭霞和刘耀光.植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用.分子植物育种,2006,4(5):621-626)多克隆位点的HindIII和SacI酶切位点之间，分别得到含有OsAT1基因的过量表达和干涉表达的植物表达载体，然后利用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11号的成熟胚的愈伤组织，方法如下述文献描述(Hiei et al,Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6(2):271-282)，经过预分化、分化，转化OsAT1过量表达得到16株转化植株(下文将以OsAT1OV3-3、OsAT1OV4-1为代表转化植株展开研究)，转化OsAT1干涉载体获得9株转化植株(下文将以OsAT1i9-5、OsAT1i8-3为代表转化植株展开研究)，经过PCR鉴定，全部为阳性，PCR引物序列如下：

引物1：5’-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3'(SEQ ID NO:8)；

引物2：5’-TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA-3’(SEQ ID NO:9)；

PCR扩增条件为：94℃2min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

经过PCR鉴定为阳性的转基因植株后，提取T1代转基因植株叶片基因组DNA进行Southern Blot检测插入基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后取100粒以上种子发芽后利用50毫克/升潮霉素进行筛选，若没有死亡则表明种子已经纯合；选择已经纯合的转基因种子和野生型水稻中花11种子萌发后，利用木村B营养液(调pH为4.8)培养水稻至4叶期，然后提取水稻叶片RNA，检测总RNA浓度和完整度后再合成cDNA第一链，以水稻Actin作为内参基因，加入等量的cDNA模板，在荧光定量PCR仪扩增Actin和OsAT1，从图2可以看出，过量表达转基因植株叶片中OsAT1的表达较野生型水稻分别提高了15倍和18倍；干涉表达转基因植株叶片中OsAT1的表达是野生型水稻的40％和60％，所用PCR引物序列如下：

Actin-F:5’-GCCACACTGTCCCCATCTATG-3'(SEQ ID NO:10)；

Actin-R:5’-AGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3'(SEQ ID NO:11)；

AT1-F:5’-CGTCACCTCCCACCGCTTCT-3'(SEQ ID NO:12)；

AT1-R:5’-TGGTGACAGGGACGGGCTTC-3'(SEQ ID NO:13)；

PCR扩增条件为：95℃10min；95℃15sec，60℃1min，40个循环；60-95℃分析溶解曲线。

木村B营养液具体配方为：(NH₄)₂SO₄(0.365mM),KH₂PO₄(0.182mM),KNO₃(0.183mM),K₂SO₄(0.086mM),Ca(NO₃)₂(0.366mM),MgSO₄(0.548mM),EDTA-Fe^Ⅲ(0.020mM),MnCl₂·4H₂O(0.091×10^-3mM),ZnSO₄·7H₂O(0.77×10^-3mM),CuSO₄·5H₂O(0.32×10^-3mM),H₃BO₃(0.0462mM),(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O(0.145×10^-3mM)。

通过以上实验，我们证实获得表达效果较好了过量表达和干涉表达OsAT1的转基因植株，其成熟期的转基因纯合植株表型如图1所示。通过测定转基因植株和野生型植株叶片的不同元素的含量显示(测定方法参考Tanaka et al，Roles of pollen-specificboron efflux transporter,OsBOR4,in the rice fertilization process.Plant Celland Physiology.2013,54(12):2011-2019)：只有硼元素在过量表达植株中较野生型植株提高了3.6倍；而干涉表达转基因植株硼元素含量下降了40％(图3)，而硅、砷、铝、锌、镉、镍、钠、镁、钾、锰、磷、硫、钼、硒、铬均没有明显差异。

实施例3酵母细胞中鉴定目的基因的功能

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的关于OsAT1(SEQ ID NO:1)和OsBOR1(SEQ ID NO:18)的cDNA序列设计引物，引物序列如下：

OsAT1-F3:TATCAAGCTTGCAATGGCGATGGAGCCGAC(SEQ ID NO:14下划线为限制性内切酶HindIII识别位点)

OsAT1-R3:GTCAGAGCTCTTCAGTTGCTTCTGATGAGC(SEQ ID NO:15下划线为限制性内切酶SacI识别位点)

OsBOR1-F1:CACGGGTACCAAAATGGAGGAGAGCTTCGT(SEQ ID NO:16下划线为限制性内切酶KpnI识别位点)

OsBOR1-R1:GACTCTCGAGCTTCACTTTGGTGTTGATCC(SEQ ID NO:17下划线为限制性内切酶XhoI识别位点)

以粳稻品种中花11号2周的幼苗叶片cDNA为模板，在引物对OsAT1-F3、OsAT1-R3和OsBOR1-F1、OsBOR1-R1的引导下，用常规方法扩增OsAT1和OsBOR1基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，分别回收并纯化大约1600bp和2100bp的DNA片段；分别将片段克隆到pYES2载体(购自invitrogen公司)上，获得pYES2-OsAT1和pYES2-OsBOR1载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，两个重组DNA片段的序列分别与序列1(SEQ ID NO:1)和18(SEQ ID NO:18)的一致性为100％，并在其DNA两端引入了合适的酶切位点。将构建好的表达载体转化酵母菌(INVSC1,购自invitrogen公司)，在SC-U固体培养基选择平板上挑选单菌落，接种于15毫升SC-U液体培养基上，30℃过夜培养；测定OD600＝4～6，加入到50毫升SC-U诱导培养基中使OD600＝0.4，5000rpm，5min，4℃。去上清，将沉淀溶于1～2毫升SC-U诱导培养基，加入到50mLSC-U诱导培养基30℃过夜培养20小时后，5000rpm，5min，4℃离心；弃去上清，加入新鲜的SC-U诱导培养基，同时加入终浓度为200微摩尔的硼酸，再诱导1小时，5000rpm，5min，4℃。将细胞用冰水反复冲洗几次，去掉酵母细胞外的硼酸等物质，用1毫升超纯水悬浮后，100℃加热30分钟充分裂解酵母，12000rpm，10min，上清用于硼酸的含量测定，沉淀为酵母重量。通过ICP-MS测定(方法参考Tanaka etal，Roles of pollen-specific boron efflux transporter,OsBOR4,in the ricefertilization process.Plant Cell and Physiology.2013,54(12):2011-2019)上清中硼元素表明：表达OsAT1和OsBOR1的酵母细胞中硼含量只有对照的70％左右(图4)，说明OsAT1是一个外向的转运蛋白。

其中，本实施例涉及的培养基配方如下：

(1)SC-U固体培养基：6.7g L^-1YNB+1g L^-1Adenine+1g L^-1Arginine+1g L^- ¹Cysteine+1g L^-1Leucine+1g L^-1Lysine+1g L^-1Threonine+1g L^-1Tryptophan+0.05g L^- ¹Aspartic acid+0.05g L^-1Proline+0.05g L^-1Histidine+0.05g L^-1Serine+0.05g L^- ¹Isoleucine+0.05g L^-1Tyrosine+0.05g L^-1Methionine+0.05g L^-1Valine+0.05g L^- ¹Phenylanine+20g L^-1D-glucose+15g L^-1Agar。

(2)SC-U液体培养基：6.7g L^-1YNB+1g L^-1Adenine+1g L^-1Arginine+1g L^- ¹Cysteine+1g L^-1Leucine+1g L^-1Lysine+1g L^-1Threonine+1g L^-1Tryptophan+0.05g L^- ¹Aspartic acid+0.05g L^-1Proline+0.05g L^-1Histidine+0.05g L^-1Serine+0.05g L^- ¹Isoleucine+0.05g L^-1Tyrosine+0.05g L^-1Methionine+0.05g L^-1Valine+0.05g L^- ¹Phenylanine+20g L^-1D-glucose。

(3)SC-U诱导培养基：6.7g L^-1YNB+1g L^-1Adenine+1g L^-1Arginine+1g L^- ¹Cysteine+1g L^-1Leucine+1g L^-1Lysine+1g L^-1Threonine+1g L^-1Tryptophan+0.05g L^- ¹Aspartic acid+0.05g L^-1Proline+0.05g L^-1Histidine+0.05g L^-1Serine+0.05g L^- ¹Isoleucine+0.05g L^-1Tyrosine+0.05g L^-1Methionine+0.05g L^-1Valine+0.05g L^- ¹Phenylanine+20g L^-1D-galactose。

实施例4不同浓度硼处理转基因植株鉴定目的基因的功能

选择已经纯合的转基因种子和野生型水稻中花11种子萌发后，利用木村B营养液(调pH为4.8)培养水稻至4叶期，分别用不同浓度的硼酸处理3周，处理溶液分别为木村B溶液去掉硼酸，木村B溶液和木村B溶液中加入至终浓度460微摩尔的硼酸，图5和图6的分析结果表明：硼酸处理后，OsAT1过量表达植株高度明显变矮，千粒重变小，只有未加硼的60～70％；而OsAT1干涉植株与野生型植株高度在硼处理后差异不大，OsAT1干涉植株的千粒重比野生型植株略高。

本试验所有数据分析均采用Excel软件对原始数据进行标准化处理，然后用SPSS19.0软件进行统计分析。各平均数的多重比较采用最小显著差数法(LSD)，比较结果采用字母标记法标记，相同字母的两组数据之间未达到5％显著水平，标记不同的两组数据之间达到5％显著水平。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用

<130> 1

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2587

<212> DNA

<213> Oryza sativa Japonica

<400> 1

gggtgtacac atcatcctca tcaatgagta gagagaagag tagagggtag tagagagcca 60

aaaaaaatcg atcatggaga ggccatgtgg agctcgccaa gtgtgagcat ttaccttctt 120

ggaaagaatc ccaagctaga aatccacaga attatctgct ctcaaacatt ggctcatctg 180

ctcaacaatc ctatcctcct cctcctcctc actggcagtg attcccccaa ccccatttct 240

ctctgaattg ggcttgtttc tttgctgaat tattattttg ctcattccac tctggttgct 300

tgttcagaga ctccatgtac aattagttga ccattcttct agttagcttc tcttgtgttc 360

ttggagttgg agctggtctg tccatgtgag ccatgttgca gattgggcta gctttgggag 420

caagagagtg gtagatcttc ttcttgccag atttattgta gatacaatac aatcccattt 480

cttgttcaga tttcttggtg aaaattccta gctagatcca tactttctcc agtgtagtgt 540

gtagagaaga agaggccttg tgaatcttat cttgggaaaa agaggtatat ccatccaccc 600

atctgtgtgc tgttcttgat tggcggcaat ggcgatggag ccgacggtga aggtggcgct 660

ggggacggcg gcgttcggga tcttctgggt gctggcggtg ttcccggcgg tgccattcct 720

gccgatcggg aggacggcgg ggtcgctgct gggcgcgatg ctgatggtgc tgttcggcgt 780

gatgtccgcc gacgaggcgt acgccgccgt ggacctcccc atcctcggcc tcctgttcgg 840

caccatggtg gtgagcgtct acctggagcg cgccgacatg ttcaagcacc tcgggaggct 900

gctgtcatgg cggagccagg gcggcaagga cctgctcgtc cgcacctgcg tcgtggcggc 960

gctcgcgtcg gcgctcttca ccaacgacac ctgctgcgtc gtgctcaccg agttcatcct 1020

caagatcgcg cggcagaaca acctcccgcc caagccgttc ctcctggcgc tcgcgtccag 1080

cgccaacatc ggctccgccg cgacgcccat cggcaacccg cagaacctgg tcatcgccgt 1140

ccagagcggc atctccttcg gccagttcgt gttcggcatc ctcccggcca ccctcgtcgg 1200

cgccgtcgtc aacgccgcca tcctgctctg cctctactgg cgccacctct ccgacgagaa 1260

gtgcgtcgag gtcgtcgccc cggtccccac cgacgtcgtc gaagaggagg acgtcacctc 1320

ccaccgcttc tcgccggcga ccatgtcaca cccccgttcc tcctcccacc accaccacca 1380

ccagcagcct ggcagctcgc tgtcgtcgcc tgactgcgag gtgttcgagc cagtgaagcc 1440

cgtccctgtc accagcaatg gcgactccaa caacaagccg gacgccgccg acgccgccgt 1500

cgtcgtcggg atccaccaga ggcgcggcgg cgtcggcggc ggcgtgagga tgaaggagga 1560

acatgcgttc cggtgggtgg aggagaagga ggaggccatg gagcaatgga agagcacggt 1620

gtggaagacg ggtgtgtacg tcatcacatt gagcatgctg gtggcgctgc tgttgggtct 1680

caacatgtca tggagcgcca tcaccgccgc actcgccctc atcgtcctcg acttcaagga 1740

tgcccgcccc tgcctcgaga aggtttccta tccacttcta ctcttcttct gtgggatgtt 1800

catcactgtg gatggattca acaagacggg cattcctagc gcattctggg aattcatgga 1860

gccctatgca cggatcgata caccgaccgg gatagtaatc ctcgccctgg ttattcttct 1920

cctctcaaat gtggcgtcaa atgttccaac tgttctcctg cttggtgctc gggtggcagc 1980

gtcagcagcg gccatctccc ctgcagcaga gaccaatgcc tggctcatcc tggcctgggt 2040

cagcacggtg gccggcaacc tctccctcct tggctccgcc gcgaacttga tcgtttgcga 2100

gcaagctcgc aggtcggagc agtacggata caccctctcc ttcttcagcc acctccagtt 2160

cggcttcccg gcgacgctca tcgtcaccgg gattggccta ctgctcatca gaagcaactg 2220

aaaaatggta cagaacatat atatgaagaa gacatggata tcaggacatg tacaaaaaga 2280

atgtgaattt tcaggtcagg tcgattgtat ttctgcaaag attcaattgt gggataaaag 2340

aaaaatgtct atctttgcct cggaattaag cacggatatc atggtgcttg gaggcttttt 2400

gagctgtaca tttgttagtt catattgggg ggagaagatg tatatgttgc agtagcaagg 2460

atcataaaag ggaaatgtat atttttgttc agcattctac ttgtaatcca tatatatttt 2520

ttgaagtcga ataatttgta taggcaggag aagagaaaat caatgaaatg catgccccta 2580

tcgatgc 2587

<210> 2

<211> 530

<212> PRT

<213> Oryza sativa Japonica

<400> 2

Met Ala Met Glu Pro Thr Val Lys Val Ala Leu Gly Thr Ala Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ile Phe Trp Val Leu Ala Val Phe Pro Ala Val Pro Phe Leu Pro

20 25 30

Ile Gly Arg Thr Ala Gly Ser Leu Leu Gly Ala Met Leu Met Val Leu

35 40 45

Phe Gly Val Met Ser Ala Asp Glu Ala Tyr Ala Ala Val Asp Leu Pro

50 55 60

Ile Leu Gly Leu Leu Phe Gly Thr Met Val Val Ser Val Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Arg Ala Asp Met Phe Lys His Leu Gly Arg Leu Leu Ser Trp Arg Ser

85 90 95

Gln Gly Gly Lys Asp Leu Leu Val Arg Thr Cys Val Val Ala Ala Leu

100 105 110

Ala Ser Ala Leu Phe Thr Asn Asp Thr Cys Cys Val Val Leu Thr Glu

115 120 125

Phe Ile Leu Lys Ile Ala Arg Gln Asn Asn Leu Pro Pro Lys Pro Phe

130 135 140

Leu Leu Ala Leu Ala Ser Ser Ala Asn Ile Gly Ser Ala Ala Thr Pro

145 150 155 160

Ile Gly Asn Pro Gln Asn Leu Val Ile Ala Val Gln Ser Gly Ile Ser

165 170 175

Phe Gly Gln Phe Val Phe Gly Ile Leu Pro Ala Thr Leu Val Gly Ala

180 185 190

Val Val Asn Ala Ala Ile Leu Leu Cys Leu Tyr Trp Arg His Leu Ser

195 200 205

Asp Glu Lys Cys Val Glu Val Val Ala Pro Val Pro Thr Asp Val Val

210 215 220

Glu Glu Glu Asp Val Thr Ser His Arg Phe Ser Pro Ala Thr Met Ser

225 230 235 240

His Pro Arg Ser Ser Ser His His His His His Gln Gln Pro Gly Ser

245 250 255

Ser Leu Ser Ser Pro Asp Cys Glu Val Phe Glu Pro Val Lys Pro Val

260 265 270

Pro Val Thr Ser Asn Gly Asp Ser Asn Asn Lys Pro Asp Ala Ala Asp

275 280 285

Ala Ala Val Val Val Gly Ile His Gln Arg Arg Gly Gly Val Gly Gly

290 295 300

Gly Val Arg Met Lys Glu Glu His Ala Phe Arg Trp Val Glu Glu Lys

305 310 315 320

Glu Glu Ala Met Glu Gln Trp Lys Ser Thr Val Trp Lys Thr Gly Val

325 330 335

Tyr Val Ile Thr Leu Ser Met Leu Val Ala Leu Leu Leu Gly Leu Asn

340 345 350

Met Ser Trp Ser Ala Ile Thr Ala Ala Leu Ala Leu Ile Val Leu Asp

355 360 365

Phe Lys Asp Ala Arg Pro Cys Leu Glu Lys Val Ser Tyr Pro Leu Leu

370 375 380

Leu Phe Phe Cys Gly Met Phe Ile Thr Val Asp Gly Phe Asn Lys Thr

385 390 395 400

Gly Ile Pro Ser Ala Phe Trp Glu Phe Met Glu Pro Tyr Ala Arg Ile

405 410 415

Asp Thr Pro Thr Gly Ile Val Ile Leu Ala Leu Val Ile Leu Leu Leu

420 425 430

Ser Asn Val Ala Ser Asn Val Pro Thr Val Leu Leu Leu Gly Ala Arg

435 440 445

Val Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ile Ser Pro Ala Ala Glu Thr Asn Ala

450 455 460

Trp Leu Ile Leu Ala Trp Val Ser Thr Val Ala Gly Asn Leu Ser Leu

465 470 475 480

Leu Gly Ser Ala Ala Asn Leu Ile Val Cys Glu Gln Ala Arg Arg Ser

485 490 495

Glu Gln Tyr Gly Tyr Thr Leu Ser Phe Phe Ser His Leu Gln Phe Gly

500 505 510

Phe Pro Ala Thr Leu Ile Val Thr Gly Ile Gly Leu Leu Leu Ile Arg

515 520 525

Ser Asn

530

<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> Oryza sativa Japonica

<400> 3

caaacatgct cactaattaa attgtgagag ggcgaagcag aagtgatcaa cttccaaact 60

tgtggtaacc aatcagtaac aggaactgtc gtcacaggtt atactaccat agcaccatat 120

cttttatttc tctataacct atatgagatg caatcgtata taatcattat cgacccatct 180

ggttatagat aaatgctagt tttgactttg agttgttcta cttcgaacaa tatttttttt 240

aataatttaa ctatttagca ttaaaattat gccattagat ttgtaaccag aaatagttta 300

ctagtactat cttacattta aatatattcg ctttgatatc acttagaagc aactgttgaa 360

attcatctac tatatttgtt tttttaatac ataacgttat taacttttga aataatgttt 420

gatcattcgc attatttaaa aatttactcc tttcatttta tattgtaagt cgttttggct 480

ttttcctagt caaactcgtt taagtttgac taaatttttg gaaaatctaa aataccgaat 540

tggttttatt taatctagca ttgaatatat tttgataata tgctattata attttctata 600

tactcggtca aactcaaata aagttgacta aaaaaaagtt aaaacgactt acaatatgaa 660

acgaacggaa taatatagat atgttaagat ataagttata cttaaagttt atttaaagat 720

aaaacaagtc atatcaaaat aaatcatatt tatatatatt ataaatggac ataggaagta 780

caatacttgt gttgagatcc gtcaattatt tattaacaga gaaagtataa tgcctttata 840

ttagagtata aataaaatgc ccctaagtgt gaatttagtg atataatatt cacgtagaca 900

atttagctga gtttgttata ttggtgaaca agctgatgaa gaggcatgag gtaataattc 960

atctgaatat gttactagta gtagttagtg atattttaag actcagcaga gggtgagaaa 1020

cgttccaccc atgcatctct ttgcctgtca attagtgaca ataatagtat acaaaaatca 1080

gctgatatga aagcaacatt cttacatgtg gcggtgaatc atcgttacca agtaaaaaaa 1140

actctgtggt aataacatga tcgtattgtc aagtttccag gagaaattct caaatataaa 1200

cccagaaatc aaacatttta ttccttgtgc agctaggatc caatagagac atgtctgtag 1260

taatcatgtt catgtaaaca aatgaggtga gcagaccgca gcgagtgagc tcacatgcgc 1320

caaccatttt tctgcacatg aaaatacaag aatgtttttt tcttttttct ttgggtgtac 1380

acatcatcct catcaatgag tagagagaag agtagagggt agtagagagc caaaaaaaat 1440

cgatcatgga gaggccatgt ggagctcgcc aagtgtgagc atttaccttc ttggaaagaa 1500

tcccaagcta gaaatccaca gaattatctg ctctcaaaca ttggctcatc tgctcaacaa 1560

tcctatcctc ctcctcctcc tcactggcag tgattccccc aaccccattt ctctctgaat 1620

tgggcttgtt tctttgctga attattattt tgctcattcc actctggttg cttgttcaga 1680

gactccatgt acaattagtt gaccattctt ctagttagct tctcttgtgt tcttggagtt 1740

ggagctggtc tgtccatgtg agccatgttg cagattgggc tagctttggg agcaagagag 1800

tggtagatct tcttcttgcc agatttattg tagatacaat acaatcccat ttcttgttca 1860

gatttcttgg tgaaaattcc tagctagatc catactttct ccagtgtagt gtgtagagaa 1920

gaagaggcct tgtgaatctt atcttgggaa aaagaggtat atccatccac ccatctgtgt 1980

gctgttcttg attggcggca 2000

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OsAT1-F1

<400> 4

acgaagcttg ttcttgattg gcggcaatg 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OsAT1-R1

<400> 5

actacgcgtt cagttgcttc tgatgagcag 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OsAT1-F2

<400> 6

aacagagctc atcctgctct gcctctactg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OsAT1-R2

<400> 7

ccacaagctt ccagcatgct caatgtgatg 30

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物1

<400> 8

ctgaactcac cgcgacgtct gtc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物2

<400> 9

tagcgcgtct gctgctccat aca 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Actin-F

<400> 10

gccacactgt ccccatctat g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Actin-R

<400> 11

aggtcgagac gaaggatagc at 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物AT1-F

<400> 12

cgtcacctcc caccgcttct 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物AT1-R

<400> 13

tggtgacagg gacgggcttc 20

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OsAT1-F3

<400> 14

tatcaagctt gcaatggcga tggagccgac 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OsAT1-R3

<400> 15

gtcagagctc ttcagttgct tctgatgagc 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OsBOR1-F1

<400> 16

cacgggtacc aaaatggagg agagcttcgt 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OsBOR1-R1

<400> 17

gactctcgag cttcactttg gtgttgatcc 30

<210> 18

<211> 2828

<212> DNA

<213> Oryza sativa Japonica

<400> 18

attgccctct gagtctctga aatcctgaag cttcttcttc ttcttccttc ctcctcttgc 60

tctcttgctc ttcctatgct agcactctcc atgctcttct tgcccttgta gcattggctc 120

cttggtttcc atccatggat ccacgctaaa tgcattgcga ggctgcaaat tggtagcatt 180

cccttccccg ttgcatctgc tgcaactatg taagcaggag tgtctgattt gacacgcctg 240

aatacagctt ctcagatctt cagttttgtt gtttgtctga gaaaaggaga gagagagagg 300

cctcttttgg gtccaagaag agaaaaatgg aggagagctt cgtgcccctc cgtggcatca 360

agaacgacct ccatgggagg ctccagtgct acaagcagga ttggaccgga ggattccgcg 420

ccggtatcag gatccttgcg ccgaccacct acatattctt cgcttcggcc ataccggtga 480

tatcgttcgg agagcaattg gagaggaaca ctgatggtgt tctgacagca gttcagacat 540

tggcatccac tgcactttgt ggcataatcc actcctttct tggagggcag cctctgctga 600

tcctcggtgt ggccgagccg acggtgctca tgtacacatt catgttcaac tttgccaagg 660

acaggcctga tcttggaagg aggctgttcc tcgcatggac cggttgggtt tgtgtctgga 720

cagcaatttt gctgttcttg ctggcgatac taggcgcgtg ctcgatcatc aaccggttca 780

cccgcatcgc gggtgagctg tttgggctcc tgattgcaat gctcttcatg cagcaggcta 840

tcaaggggct tgttgacgag ttccgcatcc ctgagaggga gaacagaaag gcattagagt 900

ttgtttcatc atggaggttc gccaacggaa tgtttgctat cgtcttgtcg tttggccttt 960

tgctcactgc actgcggagc aggaaggctc gatcatggcg ctatggaaca ggttggctcc 1020

gtggcttcat cgccgactat ggtgtcccac tgatggtgct agtatggaca ggagtttcct 1080

acattccata tggtagtgtt ccaaaaggaa ttccacggcg ccttttcagc cccaacccat 1140

ggtcccctgg tgcatatgat aattggacag tcatcaggga catgccaaat gtgccactcc 1200

tctacattat tggtgccttc ataccagcaa cgatgatagc cgtcctgtac tacttcgatc 1260

acagtgttgc ttctcagctt gctcagcaga aggagttcaa tttgaggaag cccccatctt 1320

tccattatga tttgcttctc ctgggtttcc tgacattatt gtgtggcctt attggtatcc 1380

ctccggcgaa tggtgtcatt ccacagtctc caatgcatac gaagagtttg gctactctca 1440

aacatcaact actccgtaac cgactagtag ccacagcccg acaaagcatg agccagaatg 1500

cgagcttgag ccagctgtat ggcagcatgc aggaagctta ccagcagatg cagacaccac 1560

tgatttacca gcaaccgtca gtcaagggat tgaatgagct caaggactca acagtccaaa 1620

tggcttcaag catgggcaac atcgatgcgc cagttgatga gacagtcttt gacatcgaga 1680

aagaaatcga tgacctgctg cctatcgagg tcaaggagca gaggttgagc aacttgctcc 1740

aggccacaat ggttgggggt tgtgttgctg ctatgccatt gctcaagaag atcccgactt 1800

ctgtcctctg gggctacttc gccttcatgg ccattgagag cttgcctggt aaccagttct 1860

gggagaggat cttgctgctc ttcactgctc ccagcagaag atacaaggtg ttagaagagt 1920

accacaccac gtttgtcgag accgtgccat tcaagacgat agccatgttc acactcttcc 1980

agacaatgta tctactcgtc tgcttcggga tcacatggat cccgattgct ggggttcttt 2040

tccccctcat gatcatgctg ctggttccag tcaggcagta catcctccca aagctcttca 2100

aaggtgcaca tctgactgat ctggatgcag cagagtatga ggagtcacca gctataccgt 2160

tcattgccgc gcaagatatt gatgttgcat tggcgcgcac ccagagtgca gaaatccttg 2220

atgacattgt cactagaagc cgtggtgaaa tcaagcgcct gaacagtcct aagatcacca 2280

gctccggtgg cacaccagtg gcagaactta aaggaatccg cagcccttgt atctctgaga 2340

gggcatacag cccttgtatc accgagttga ggcatgaccg cagccctcta ggaggaagag 2400

gcagcccaag gaccggtgag acccgatcgt ccaagttggg cgaaggatca acaccaaagt 2460

gaagcaagaa tgatgcactg ctcatatgag ctatgcaact acctgaaatc agctatacta 2520

atgatttctg tataactatg gcgtacggtt atatgatgtc ttatgatcaa gtatcaagta 2580

tgagtctatg agaatgttta tgtatatctc tagcctagta tatcacccct tcctcttttt 2640

ttggtgtatt tcctgatttg gagcaccata tgtgtaatct ctgaactacc agaatattag 2700

agtgactact tggtaacctt ttgagtttca tttgctaaat tcctgtcaga acttgtggat 2760

gattcatact gaaaactatt tgtattcatt aattctttaa aagaaacagg attatagttg 2820

gcatcctt 2828

Claims

1.水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用。

2.根据权利要求1所述的水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用，其特征在于：所述的应用为所述的水稻OsAT1蛋白在制备改善植物硼含量的药物中的应用，和/或所述的水稻OsAT1蛋白的编码基因在制备改善植物硼含量的转基因植物中的应用。

3.根据权利要求1所述的水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用，其特征在于：所述的水稻OsAT1蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或是具有通过突变、删除、插入或取代方式将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的至少1个氨基酸改变的序列。

4.根据权利要求1所述的水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用，其特征在于：编码所述的水稻OsAT1蛋白的基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；或在严格条件下可与SEQ ID NO.1杂交并且编码所述的水稻OsAT1蛋白的DNA分子。

5.根据权利要求1所述的水稻OsAT1蛋白在改善植物硼含量中的应用，其特征在于：编码所述水稻OsAT1蛋白的基因启动子的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示；或严格条件下可与SEQ ID NO:3所示的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子。

6.一种表达载体，是由权利要求1所述水稻OsAT1蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成。

7.根据权利要求6所述的表达载体，所述的植物表达载体为pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI121，或其他衍生植物表达载体。

8.一种改善植物硼含量的转基因植物，通过包括如下步骤的制备方法制备得到：将权利要求1所述的水稻OsAT1蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建重组植物表达载体；将所述的重组植物表达载体转化到宿主植物中进行表达，得到所述的改善植物硼含量的转基因植物。