CN108530524A

CN108530524A - 杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN108530524A
Application number: CN201810346342.7A
Authority: CN
Inventors: 冉昆; 孙晓莉; 王少敏; 魏树伟; 董肖昌
Original assignee: Shandong Institute of Pomology
Current assignee: Shandong Institute of Pomology
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2018-09-14

Abstract

本发明涉及杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用。一种分离自杜梨的MYB转录因子基因Pb4RMYB，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将Pb4RMYB基因转化拟南芥，获得的转基因植株经生物学功能验证，Pb4RMYB基因过表达植株，相比野生型对照植株，对高盐逆境胁迫的耐受性显著提高。本发明对植物耐盐分子机理的研究具有重要意义；另外，该基因在培育耐盐果树砧木或品种中具有重要功能，从而为培育抗逆果树新品种提供了重要的可能性，对果树生产具有重要意义。

Description

杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用

技术领域

本发明涉及杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着工业污染加剧、灌溉农业的发展以及化肥使用不当等原因，土壤次生盐渍化日趋加重，目前已成为影响农业生产的世界性问题，全球近20％的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁。对于果树生产而言，土壤盐渍化已成为限制果树生产和分布的主要因子之一。盐碱地果树生长发育的主要障碍是过高的盐分浓度。由于盐碱地淋溶作用弱，所以大量的盐分离子会聚集在根系附近，从而对果树生长产生胁迫；而且易发生盐离子毒害，引起营养缺乏，降低成活率；在离子拮抗等作用下，易发生中微量元素缺乏，生理病害严重；另外，盐含量过高对土壤胶体具有很强的分散作用，导致土壤容易板结，导致土壤通透性差，严重影响土壤微生物的代谢，最终导致土壤日益贫瘠，从而影响果树的生长发育，尤其不适合深根性果树的生长。

MYB转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域通常含有1-4个不完全重复的氨基酸序列(R)。根据含有R的多少，MYB家族转录因子被分为四类，1R-，R2R3-，3R-和4R-MYB转录因子。其中，植物中绝大多数MYB属于R2R3-MYB型，由数量众多的基因家族编码，主要与植物环境胁迫应答密切相关；3R-MYB主要与细胞周期控制相关，在高等植物基因组中一般由5个基因编码；数量最少的为4R-MYB型，在多种植物基因组中只存在1个，目前对其功能知之甚少。在砀山酥梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)基因组中，存在129个MYB基因，分属于31个亚家族，分布于16条染色体上。MYB转录因子广泛参与植物次生代谢调控、细胞形态决定、胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等。

梨是温带地区的主要栽培树种，其果品营养价值高，耐贮性好，供应周期长，世界上很多国家都将其列为主要消费果品。与多数果树一样，梨主要靠嫁接繁殖，所以梨的耐盐性问题实质是砧木的耐盐性问题，选择耐盐性高的砧木是提高梨耐盐性的关键措施之一。杜梨原产中国，广泛用作梨栽培品种的砧木，具有耐旱、耐涝、耐盐等优良特性，对环境的适应能力较强，嫁接后可以提高品种的抗逆性。由于梨是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。近年来，梨基因组测序(Jun Wu等，2013)的完成以及现代生物技术的迅速发展为通过基因工程手段改良植物抗逆性开辟了新途径。果树砧木生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。目前对MYB的研究主要集中在拟南芥、水稻、大豆等少数模式植物上，而在果树方面研究较少。因此挖掘梨MYB基因并进行功能研究，为梨抗逆育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中的应用。本发明通过植物基因工程技术将Pb4RMYB基因转化拟南芥，得到耐盐性提高的植株，首次证实Pb4RMYB基因与植物耐盐性相关，这为果树抗逆基因工程提供了重要的基因资源。

本发明的技术方案如下：

杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性方面的应用，所述杜梨Pb4RMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述杜梨Pb4RMYB基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高果树耐盐性方面的应用。

更进一步的，杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高拟南芥耐盐性方面的应用。

Pb4RMYB基因是从杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)中克隆获得的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码区序列(CDS)长度为2913bp，编码954个氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，预测编码蛋白质具有4个保守的SANT结构域，分子量为109600.6Da，等电点为7.41，不含信号肽和跨膜区。

克隆Pb4RMYB基因cDNA序列：正向引物Pb4RMYB-F1：5’-ATGTCTCCTCCCTCCGATGACG-3’；反向引物Pb4RMYB-R1：5’-TTAACCACATTGACGCCGCCTCTTCG-3’。

利用qRT-PCR技术分析了在杜梨响应高盐胁迫过程中Pb4RMYB基因的表达模式，结果表明Pb4RMYB在高盐胁迫下被诱导上调表达，且在叶片、根中的表达量明显高于花和果实，说明Pb4RMYB可能与杜梨的耐盐性相关。

构建了杜梨Pb4RMYB的亚细胞定位融合表达载体pCAMBIA1302-Pb4RMYB-GFP，通过农杆菌介导进行烟草瞬时表达，结果表明Pb4RMYB定位于细胞核。

构建了杜梨Pb4RMYB基因的植物过表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将Pb4RMYB基因转化拟南芥，获得的转基因植株经种子萌发及耐盐性分析，表明本发明克隆的Pb4RMYB基因具有提高拟南芥耐盐性的功能。

果树等木本经济作物因遗传转化周期太长，基因功能的鉴定往往在模式植物(如拟南芥、番茄等)中进行，将外源基因导入模式植物中，若表现相应的表型或性状，则可以推断该基因具有相应的功能。本发明将Pb4RMYB基因转化拟南芥，发现转基因拟南芥的耐盐性提高，说明该基因为盐胁迫诱导基因，该基因上调表达可以提高植物的耐盐性。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明利用转基因技术得到耐盐性提高的拟南芥植株，突破了传统育种手段的障碍，为果树等抗逆基因工程提供了重要的候选基因资源。

附图说明

图1为Pb4RMYB基因在杜梨叶片响应200mmol/L甘露醇胁迫的qRT-PCR分析图；

图2为Pb4RMYB基因在杜梨叶片响应200mmol/L NaCl胁迫的qRT-PCR分析图；

图3为Pb4RMYB基因的亚细胞定位图，其中，A为明场条件下，B为GFP荧光条件下，C为自发光条件下，D为荧光和自发光叠加条件下；

图4为Pb4RMYB基因在转基因拟南芥叶片中的表达量分析图，其中，WT为野生型拟南芥；1-6为阳性转Pb4RMYB基因拟南芥株系；

图5为野生型和过表达拟南芥种子在1/2MS培养基生长5天后表型；

图6为野生型和过表达拟南芥种子在含150mmol/L NaCl的1/2MS培养基生长萌发5天后的表型；

图7为野生型和Pb4RMYB过表达拟南芥种子在150mmol/L NaCl胁迫下种子萌发率；

图8为Pb4RMYB-OE和野生型拟南芥在200mmol/L NaCl胁迫7d并恢复2d后的表型，对照(WT)浇纯水；

图9为Pb4RMYB-OE和野生型拟南芥在NaCl胁迫下的SPAD值，对照浇纯水；

图10为在盐胁迫处理后野生型和T3转基因株系中Pb4RMYB的表达；

图11为在盐胁迫处理后野生型和T3转基因株系中盐胁迫响应基因AtNHX1和AtSOS1的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。pCAMBIA-1302载体由山东省果树研究所保存，在pCAMBIA-1302载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1302载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1302载体相关信息：

http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html#dsy585_Description。拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0)为拟南芥生物研究中心(ABRC，https://www.arabidopsis.org/)的产品。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，由山东省果树研究所保存。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α(DE3)感受态为全式金生物有限公司产品。

实施例1：杜梨Pb4RMYB基因的克隆

以具6-8片真叶的杜梨幼苗为试材，提取总RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增Pb4RMYB基因。利用改进快速CTAB法(CTAB提取缓冲液包括：2％CTAB，2.5％PVP，100mMTris-HCl(pH 8.0)，25mM EDTA(pH 8.0)，2M NaCl，0.05％亚精胺，2％β-巯基乙醇)提取总RNA，取1μg RNA样品，经1U DNase I(购自TaKaRa公司)37℃孵育30min后，加入1μL EDTA(25mM)65℃孵育10min。

采用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa code:D6210)进行cDNA第一条链的合成。扩增引物为：正向引物Pb4RMYB-F1：5’-ATGTCTCCTCCCTCCGATGACG-3’；反向引物Pb4RMYB-R1：5’-TTAACCACATTGACGCCGCCTCTTCG-3’。25μL PCR反应体系包括：1×PCR缓冲液(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl₂(购自TakaRa公司)，0.25mM dNTPs(购自TakaRa公司)，0.5μM正向引物Pb4RMYB-F1，0.5μM反向引物Pb4RMYB-R1，100ng cDNA，1U TaqDNA聚合酶(购自TakaRa公司)。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。4℃保存。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，将目的条带按照胶回收试剂盒说明书操作回收。回收纯化的PCR产物与pMD19-T Vector(购自TakaRa公司)进行连接反应，体系包括：4.0μL回收纯化的PCR产物，1.0μL pMD19-T Vector和5.0μL Solution I(购自TakaRa公司)。采用热击法转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素(Amp)的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英俊生物技术有限公司完成)。测序结果表明，扩增的目的片段长度为2913bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过序列比对分析，确定该序列是目的基因，命名为Pb4RMYB。

Pb4RMYB基因包括2913bp的开放阅读框，编码954个氨基酸，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，预测编码蛋白质具有4个保守的SANT结构域，分子量为109.6KD，等电点为7.41，分子式为C₄₇₀₃H₇₅₃₈N₁₄₀₈O₁₅₂₈S₄₂。负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为157，正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys)为158，不稳定系数为56.12，脂溶性指数为62.65，亲水性平均数为-0.960。二级结构分析表明，Pb4RMYB含有52.78％的不规则卷曲、32.27％的α螺旋、10.41％的延伸链和4.54％的β转角。

在NCBI上进行Blastp分析，发现与砀山酥梨(Pyrus bretschneideri，XP_009360099.1)，苹果(Malus domestica，XP_008393405.2)，梅(Prunus mume，XP_008240182.1)，甜樱桃(Prunus avium，XP_021802956.1)，桃(Prunus persica，XP_007210492.1)，可可树(Theobroma cacao，EOY21190.1)分别为98％，94％，66％，66％，62％和55％。由此证明扩增出来的序列是杜梨Pb4RMYB基因。

实施例2：Pb4RMYB在杜梨响应盐胁迫的qRT-PCR分析

杜梨总RNA的提取、cDNA合成的方法同实施例1。用梨tubulin(AB239681)作为对照，引物序列如下：正向引物TUB-F：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’，反向引物TUB-R：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’。利用Primer Premier 5.0在Pb4RMYB基因的开放阅读框内设计基因特异的qRT-PCR引物对，引物序列如下：正向引物Pb4RMYB-F2：5’-TGTATCTCCCGGGTCGTTCT-3’，反向引物Pb4RMYB-R2：5’-TTGATACCGTGCCAAGCACT-3’。

qRT-PCR采用SYBR Green试剂盒(购自TaKaRa公司)。20μL PCR扩增体系含：10μL 2×SYBR Premix Ex Taq，上下游引物各0.2μM和模板cDNA100ng。应用qRT-PCR专用96孔板(Axygen)和高透光率封口膜(Axygen)，荧光定量PCR仪iQ5Quantitative Real-time PCRSystem(Bio-Rad，美国)进行qRT-PCR分析，PCR程序为95℃，30sec；95℃10sec，50℃30sec，72℃15sec，共40个循环。每个cDNA样品重复3次，计算出每个cDNA样品的平均Ct值，通过计算2^–△△C _T得出Pb4RMYB基因的相对表达量。

结果如图1和图2表明，在200mmol/L NaCl和甘露醇胁迫下，Pb4RMYB的相对表达量随着处理时间的延长而增强，在处理的第48h，Pb4RMYB的相对表达量均达到最高峰，这说明Pb4RMYB的表达受盐胁迫诱导，Pb4RMYB为盐胁迫诱导基因。

实施例3：Pb4RMYB基因的亚细胞定位

利用烟草瞬时表达系统研究Pb4RMYB基因的亚细胞定位，所用的表达载体为pCAMBIA1302，该表达载体上具有GFP基因。利用RT-PCR扩增出Pb4RMYB基因整个ORF，ORF扩增引物为实施例1中的Pb4RMYB-F1和Pb4RMYB-R1，并在其ORF扩增引物Pb4RMYB-F1和Pb4RMYB-R1的5’端分别加上Nco I和Spe I两个酶切位点，即得到带酶切位点的扩增引物：正向引物Pb4RMYB-F3：5’-CCCATGGATGTCTCCTCCCTCCGATGACG-3’，反向引物Pb4RMYB-R3：5’-GGACTAGT TTAACCACATTGACGCCGCCTCTTCG-3’。下划线为酶切位点，CCATGG为Nco I酶切位点，ACTAGT为Spe I酶切位点。

首先将扩增产物连在pMD19-T载体上，从而得到重组载体PMD19-Pb4RMYB。同时用Nco I和Spe I酶切pCAMBIA1302和PMD19-Pb4RMYB，回收产物并连接，获得重组载体pCAMBIA1302-Pb4RMYB-GFP。在确认序列无误后，将pCAMBIA1302-Pb4RMYB-GFP重组载体及对照pCAMBIA1302空载体用热击法分别转入农杆菌EHA105。卡那霉素和利福平双抗性筛选含有功能质粒的农杆菌。农杆菌28度培养至OD600＝0.3，用等体积的buffer(10mM MES，200μM乙酰丁香酮，10mM MgCl₂)悬浮，室温静置4-6小时，然后由下表皮注射到4周大的烟草叶片中，继续培养4-6天，用激光共聚焦显微镜观察直接观察叶片的荧光情况。激光共聚焦型号为PERKINEIMER UITRAVIEW VOX双转盘激光共聚焦实时成像分析仪，GFP激发光为458nm，检测为宽波长范围：530-600nm，自发光检测波长在600-650nm之间。亚细胞定位结果表明：含Pb4RMYB基因载体的农杆菌浸染的烟草叶片中GFP荧光只在细胞核中，如图3所示，证明Pb4RMYB是核定位蛋白。

实施例4：构建Pb4RMYB基因的植物过表达载体

首先对pBI121载体的多克隆位点和Pb4RMYB基因的核苷酸序列进行了分析，在引物Pb4RMYB-F1和Pb4RMYB-R1的5’端分别加入酶切位点Xba I和Sac I，即得到相应的引物Pb4RMYB-F4和Pb4RMYB-R4，用于构建表达载体pBI121-Pb4RMYB，引物核苷酸序列如下：正向引物Pb4RMYB-F4：5’-GCTCTAGAATGTCTCCTCCCTCCGATGACG-3’；反向引物Pb4RMYB-R4：5’-CGAGCTCTTAACCACATTGACGCCGCCTCTTCG-3’。下划线为酶切位点，TCTAGA为Xba I酶切位点，GAGCTC为Sac I酶切位点。

用含100mg·L-¹氨苄青霉素的液体LB培养基悬浮培养成功转化‘Pb4RMYB-pMD19-T’重组质粒的大肠杆菌DH5α，37℃，220rpm培养12h。提取‘Pb4RMYB-pMD19-T’重组质粒作为模板进行PCR。25μL PCR反应体系包括：1×LA PCR Buffer II(Mg²⁺free)(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl₂，0.4mM dNTPs，0.5μM正向引物Pb4RMYB-F4，0.5μM反向引物Pb4RMYB-R4，100ng重组质粒，1.25U LA Taq聚合酶(购自TakaRa公司)。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58.5℃退火40s，72℃延伸3min，35个循环；循环完成后72℃延伸10min。目的片段的回收纯化、与pMD19-T Vector的连接、阳性克隆的获得与测序，均同实施例1。测序正确的结果包括上游酶切位点XbaΙ、Pb4RMYB基因和下游酶切位点Sac I，最终获得‘XbaΙ-Pb4RMYB-Sac I-pMD19-T’重组质粒。

分别提取‘XbaΙ-Pb4RMYB-Sac I-pMD19-T’重组质粒和pBI121质粒进行双酶切。40μL双酶切体系包括：质粒8μL，10×M缓冲液(购自TakaRa公司)4μL，XbaΙ和Sac I各2μL，无菌双蒸水24μL。37℃酶切4h后分别纯化回收Pb4RMYB基因和pBI121载体。连接反应体系包括：pBI121载体2μL，Pb4RMYB基因6μL，10×T4DNA连接缓冲液(购自TakaRa公司)1μL，T4DNA连接酶(购自TakaRa公司)1μL。16℃孵育12-16h。取10μL连接产物，采用热击法转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg·L-¹卡那霉素的固体LB平板中筛选阳性克隆，进行测序。测序正确的结果包括上游酶切位点Xba Ι、Pb4RMYB基因和下游酶切位点Sac I，且无核苷酸变异。同时提取‘Xba Ι-Pb4RMYB-Sac I-pBI121’重组载体进行双酶切验证，双酶切体系同上。获得含有插入Pb4RMYB基因的重组载体，将其命名为‘pBI121-Pb4RMYB’重组载体，应用冻融法将重组载体‘pBI121-Pb4RMYB’导入到农杆菌GV3101中。

实施例5：拟南芥的遗传转化和转化植株鉴定

1、Pb4RMYB转基因拟南芥植株的获得

将实施例4构建的重组表达载体‘pBI121-Pb4RMYB’通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用Pb4RMYB-F1和Pb4RMYB-R1进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有Pb4RMYB基因的农杆菌GV3101命名为pBI121-Pb4RMYB。

采用农杆菌花序侵染的方法将上述所得的重组农杆菌pBI121-Pb4RMYB转化拟南芥野生型(Col-0生态型)。转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素的MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥种子，即转入pBI121-Pb4RMYB的拟南芥植株(T1代)。

2、Pb4RMYB转基因拟南芥鉴定

(1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数

根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝Pb4RMYB转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。

(2)转基因拟南芥OE2、OE3和OE4纯合系的筛选

经上述鉴定分析后，选择其中3个具有代表性的单拷贝Pb4RMYB转基因拟南芥株系，分别记为OE2、OE3和OE4(T1代)。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T3代转基因拟南芥OE2、OE3和OE4的纯合系植株，作为实验材料进行后续实验分析。

实施例6：半定量RT-PCR检测Pb4RMYB基因在转基因拟南芥植株中的过表达

本研究采用半定量RT-PCR分析转基因拟南芥植株中外源基因Pb4RMYB的表达量，提取拟南芥总RNA，反转录后获得cDNA。利用Primer Premier 5.0在Pb4RMYB基因的开放阅读框内设计基因特异的半定量RT-PCR引物对，其引物的核苷酸序列为：Pb4RMYB-F6：5’-GTTGTTCAGATGCTCATGGGATA-3’，Pb4RMYB-R6：5’-ATGATGGCTGCTTCGGGAT-3’。

用拟南芥β-actin作内参基因，Actin-F：5’-GTGCCAATCTACGAGGGTT-3’，Actin-R：5’-TTCTTTGCTCATACGGTCA-3’。反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，51.5℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。半定量PCR分析结果如图4所示，目的基因在转基因株系1-6中过量表达，野生型中没有表达。由此可见，目的基因已经整合到了拟南芥植株中。

实施例7转Pb4RMYB基因拟南芥植株种子萌发与耐盐性分析

1、Pb4RMYB基因在拟南芥植株中过量表达对种子萌发的影响

选取Pb4RMYB-OE 3个株系OE2、OE3、OE4的种子，在150mmol/L NaCl胁迫下进行发芽实验。如图5、图6和图7所示，结果表明相较于野生型对照，150mmol/L的NaCl处理下Pb4RMYB过表达的株系表现出较强的耐性，其萌发率比野生型对照分别提高了45.1％、45.2％和47.8％，表明本研究克隆的Pb4RMYB基因可提高盐胁迫下种子的萌发率。

2、Pb4RMYB过表达拟南芥植株的耐盐性鉴定

选择OE2、OE3、OE4这3个株系来进一步研究Pb4RMYB在盐胁迫响应中的功能。将生长4周的转基因株系和野生型幼苗用200mmol/L^–1NaCl水溶液处理7d，发现过表达株系的成活率比野生型高，尤其是OE3、OE4株系，如图8所示。以200mmol/L^–1NaCl处理3d后，过表达株系的SPAD值显著高于野生型，如图9所示。说明在盐胁迫下转基因植株比野生型含有更高的叶绿素，反映过表达Pb4RMYB株系具有较强的耐盐性。

以actin为内参基因，检测转基因和野生型植株中盐胁迫响应途径关键基因的表达变化。如图10和图11所示，在200mmol/L^–1 NaCl处理3d后，过表达植株中AtSOS1和AtNHX1的表达显著上调，这些表明Pb4RMYB能够通过调控拟南芥中盐胁迫响应相关基因的表达来提高植物对盐胁迫的耐力。

序列表

<110> 山东省果树研究所

<120> 杜梨Pb4RMYB基因及其编码蛋白在提高植物耐盐性中应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 2913

<212> DNA

<213> 杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)

<400> 2

atgtctcctc cctccgatga cgaccaagac cagttttccg tcgacgaaga agaagaagac 60

gatgaccttt tcgaagcgga catggaagcc ctacggcggg cctgtatgct caccggcact 120

agccccgacg acctcaaaaa cgacggcggc ggcggcaacg acgacgaacg ccaagcttct 180

gccgactcag agtccgactc cgacgccgac gacgatgacc tcgagttgct ccgccaaata 240

aggagccggt tctcgaattc gtccgacgcg tgcgagcctt tgtctctgaa gcccttgtgt 300

actttgccgc ctgatgcctc cggcgacgag gaggacgatt accagacgct cctcgccatt 360

aggaaacgtt tctcagccta cgggaacgat actctggaaa atgatacgaa acaggttggt 420

tcctgttgca aatcggtgaa ggaaacttgc gatgaaattt ctgctatcag aaatgatgct 480

cttgaaagtt ttccagatcc tgaagatgct gatctggcca ccaatccact gagtgataat 540

gcagagggac agtcttctgc attgattgtg tggaatcagt cagattcttg cagcacgtcc 600

atgttgccac gcaaagactc gagcttccca aaggctgctc aggtgtttat ggatgccatt 660

aagaagaata gggccagtca gaagtttatc cggaataagt tgatccaaat tgaagcaaaa 720

attgaggaga acagaaaact gaaggaacgt gttaaaatcc ttaaagactt tcaggtttct 780

tgcaaaagac gaacttgggg atcattgtcc caaaagaagg atcctcgtgt ccagttattt 840

ttatcgaaag ggccaaggga ttccagggat tcaaaggttc atgacaaaaa gatctcagct 900

ttgttatatg gcccagaaga gaactctcat gtcactaatt acagaatgac gatgaaaaaa 960

tatctggact cattatatcg aaaaaaatgg tcaaaggtag aaagggaagc ccttgaaaag 1020

ggtataaagc aacaatttca agaaatggtg ctccaatctt ctgttgatga atcaagtttt 1080

tccgagagac cttgtggaga atctaatcat attgatgaca ttttggcttc aatcaacagt 1140

cttgaaatta ccccagaaat gatcagagag ttcctgccta aggttaaatg ggaacagttg 1200

gcttccatgt atctcccggg tcgttctggt gcagaatgtg aaacaaggtg gttgaactgg 1260

gaggatcctt taattaatcg taaatcatgg actgcaaagg aggacaagaa tcttctgtat 1320

tttgtccagg agaaagggat caataattgg tttgatattg cagtgtcatt ggggacaaac 1380

aggactcctt ttcagtgctt ggcacggtat caaaggagcc taaacgcttc catacttaaa 1440

cgggagtgga ccaaggatga ggatgcaaag cttcgctctg ctgtagaaac tttgggtgag 1500

ggtaattggc aagctgtagc ttctgcattg ggaggacgag ctggcaccca gtgctctaat 1560

agatggaaga aatctcttca cccaaccaag aaaagagaag gtaggtggac tccagaggaa 1620

gacaaacgtc tgaaagtagc tcaaatgctt tttggaccaa aaaattggaa taaaacagct 1680

caatttgtgc caggtcgaac tcagtcacag tgtagagata gatatgtcaa ctctttagaa 1740

ccatctttga actacggtga atggactgaa gaagaggact caagattgag agcagcaatc 1800

gaggaacacg gatattgctg gtccaaagtt gctgcatgtg tgcctcgacg tactgataat 1860

atgtgctgga ggagatgtaa ggttttatat ccagaagaag tgctcttgct caaagaacag 1920

aagaaaatca agaaggttgc tcttatgtgc aactttgttg atcgggagga agagcgtcca 1980

gcccttggcc ccaatgattt tcttccagcg attgatacta caaccaaaac tctaacttat 2040

cctaagaagc agaatggaaa attaagcaaa gttccgaaca agactagacc caggaggaat 2100

aaaatcaata gtgaaagttg ttcagatgct catgggatag ataattctca tcaagttgag 2160

acatccaacg gacatgatgt gcctaataag aagaataatg ttcgtaaaca gcggcgtaga 2220

aggcgcaaaa gtagtgagcc aacaggagag ggtcaggtta ttgtacctgt tcctgatgag 2280

cacgttacac acagagaaga acagagggaa acgtcttgtt ctgatcagat tgtcggaaca 2340

tcagatggag atgatactac acttgctgtc tttcaacgca ataaatcaaa gaagagaaat 2400

cttgggcctc cctcaaatga tacgagaaag aagagaaagc ttgtagtttc tgattgttct 2460

gttcaagatt cccccgccaa caatatccag aagggagctg gatcgcatcc cgaagcagcc 2520

atcatggttt gcgaaagtga gcaaggtgga cttaagttag acagcgagcc aaatgttgcc 2580

ttccaagaac ctgtgatcaa agtggcgggc gttagtccaa aaagtgatca tgatgctgat 2640

gataaattct tgcttccttg gggaaagaaa tcaaagaaga ggcgccctca aacttccaaa 2700

agaagtcctc aagcttgccc tccttcaagt gcgacgatga aatcagaatc gcttccaaaa 2760

ggagttggtc taggaaaagg agaggggctt gatcactgtg aacctgtgag cgaaacaggg 2820

aacaatcgtg ccgaaggtga tcatgaggat ggtgatatga cactagcttg ctttctgcga 2880

aacaaatcga agaggcggcg tcaatgtggt taa 2913

<210> 3

<211> 954

<212> PRT

<213> 杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)

<400> 3

Ser Pro Pro Ser Asp Asp Asp Gln Asp Gln Phe Ser Val Asp Glu Glu

1 5 10 15

Glu Glu Asp Asp Asp Leu Phe Glu Ala Asp Glu Ala Leu Arg Arg Ala

20 25 30

Cys Leu Thr Gly Thr Ser Pro Asp Asp Leu Lys Asn Asp Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Asn Asp Asp Glu Arg Gln Ala Ser Ala Asp Ser Glu Ser Asp Ser

50 55 60

Asp Ala Asp Asp Asp Asp Leu Glu Leu Leu Arg Gln Ile Arg Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Asn Ser Ser Asp Ala Cys Glu Pro Leu Ser Leu Lys Pro Leu

85 90 95

Cys Thr Leu Pro Pro Asp Ala Ser Gly Asp Glu Glu Asp Asp Tyr Gln

100 105 110

Thr Leu Leu Ala Ile Arg Lys Arg Phe Ser Ala Tyr Gly Asn Asp Thr

115 120 125

Leu Glu Asn Asp Thr Lys Gln Val Gly Ser Cys Cys Lys Ser Val Lys

130 135 140

Glu Thr Cys Asp Glu Ile Ser Ala Ile Arg Asn Asp Ala Leu Glu Ser

145 150 155 160

Phe Pro Asp Pro Glu Asp Ala Asp Leu Ala Thr Asn Pro Leu Ser Asp

165 170 175

Asn Ala Glu Gly Gln Ser Ser Ala Leu Ile Val Trp Asn Gln Ser Asp

180 185 190

Ser Cys Ser Thr Ser Leu Pro Arg Lys Asp Ser Ser Phe Pro Lys Ala

195 200 205

Ala Gln Val Phe Asp Ala Ile Lys Lys Asn Arg Ala Ser Gln Lys Phe

210 215 220

Ile Arg Asn Lys Leu Ile Gln Ile Glu Ala Lys Ile Glu Glu Asn Arg

225 230 235 240

Lys Leu Lys Glu Arg Val Lys Ile Leu Lys Asp Phe Gln Val Ser Cys

245 250 255

Lys Arg Arg Thr Trp Gly Ser Leu Ser Gln Lys Lys Asp Pro Arg Val

260 265 270

Gln Leu Phe Leu Ser Lys Gly Pro Arg Asp Ser Arg Asp Ser Lys Val

275 280 285

His Asp Lys Lys Ile Ser Ala Leu Leu Tyr Gly Pro Glu Glu Asn Ser

290 295 300

His Val Thr Asn Tyr Arg Thr Lys Lys Tyr Leu Asp Ser Leu Tyr Arg

305 310 315 320

Lys Lys Trp Ser Lys Val Glu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Gly Ile Lys

325 330 335

Gln Gln Phe Gln Glu Val Leu Gln Ser Ser Val Asp Glu Ser Ser Phe

340 345 350

Ser Glu Arg Pro Cys Gly Glu Ser Asn His Ile Asp Asp Ile Leu Ala

355 360 365

Ser Ile Asn Ser Leu Glu Ile Thr Pro Glu Ile Arg Glu Phe Leu Pro

370 375 380

Lys Val Lys Trp Glu Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Pro Gly Arg Ser Gly

385 390 395 400

Ala Glu Cys Glu Thr Arg Trp Leu Asn Trp Glu Asp Pro Leu Ile Asn

405 410 415

Arg Lys Ser Trp Thr Ala Lys Glu Asp Lys Asn Leu Leu Tyr Phe Val

420 425 430

Gln Glu Lys Gly Ile Asn Asn Trp Phe Asp Ile Ala Val Ser Leu Gly

435 440 445

Thr Asn Arg Thr Pro Phe Gln Cys Leu Ala Arg Tyr Gln Arg Ser Leu

450 455 460

Asn Ala Ser Ile Leu Lys Arg Glu Trp Thr Lys Asp Glu Asp Ala Lys

465 470 475 480

Leu Arg Ser Ala Val Glu Thr Leu Gly Glu Gly Asn Trp Gln Ala Val

485 490 495

Ala Ser Ala Leu Gly Gly Arg Ala Gly Thr Gln Cys Ser Asn Arg Trp

500 505 510

Lys Lys Ser Leu His Pro Thr Lys Lys Arg Glu Gly Arg Trp Thr Pro

515 520 525

Glu Glu Asp Lys Arg Leu Lys Val Ala Gln Leu Phe Gly Pro Lys Asn

530 535 540

Trp Asn Lys Thr Ala Gln Phe Val Pro Gly Arg Thr Gln Ser Gln Cys

545 550 555 560

Arg Asp Arg Tyr Val Asn Ser Leu Glu Pro Ser Leu Asn Tyr Gly Glu

565 570 575

Trp Thr Glu Glu Glu Asp Ser Arg Leu Arg Ala Ala Ile Glu Glu His

580 585 590

Gly Tyr Cys Trp Ser Lys Val Ala Ala Cys Val Pro Arg Arg Thr Asp

595 600 605

Asn Cys Trp Arg Arg Cys Lys Val Leu Tyr Pro Glu Glu Val Leu Leu

610 615 620

Leu Lys Glu Gln Lys Lys Ile Lys Lys Val Ala Leu Cys Asn Phe Val

625 630 635 640

Asp Arg Glu Glu Glu Arg Pro Ala Leu Gly Pro Asn Asp Phe Leu Pro

645 650 655

Ala Ile Asp Thr Thr Thr Lys Thr Leu Thr Tyr Pro Lys Lys Gln Asn

660 665 670

Gly Lys Leu Ser Lys Val Pro Asn Lys Thr Arg Pro Arg Arg Asn Lys

675 680 685

Ile Asn Ser Glu Ser Cys Ser Asp Ala His Gly Ile Asp Asn Ser His

690 695 700

Gln Val Glu Thr Ser Asn Gly His Asp Val Pro Asn Lys Lys Asn Asn

705 710 715 720

Val Arg Lys Gln Arg Arg Arg Arg Arg Lys Ser Ser Glu Pro Thr Gly

725 730 735

Glu Gly Gln Val Ile Val Pro Val Pro Asp Glu His Val Thr His Arg

740 745 750

Glu Glu Gln Arg Glu Thr Ser Cys Ser Asp Gln Ile Val Gly Thr Ser

755 760 765

Asp Gly Asp Asp Thr Thr Leu Ala Val Phe Gln Arg Asn Lys Ser Lys

770 775 780

Lys Arg Asn Leu Gly Pro Pro Ser Asn Asp Thr Arg Lys Lys Arg Lys

785 790 795 800

Leu Val Val Ser Asp Cys Ser Val Gln Asp Ser Pro Ala Asn Asn Ile

805 810 815

Gln Lys Gly Ala Gly Ser His Pro Glu Ala Ala Ile Val Cys Glu Ser

820 825 830

Glu Gln Gly Gly Leu Lys Leu Asp Ser Glu Pro Asn Val Ala Phe Gln

835 840 845

Glu Pro Val Ile Lys Val Ala Gly Val Ser Pro Lys Ser Asp His Asp

850 855 860

Ala Asp Asp Lys Phe Leu Leu Pro Trp Gly Lys Lys Ser Lys Lys Arg

865 870 875 880

Arg Pro Gln Thr Ser Lys Arg Ser Pro Gln Ala Cys Pro Pro Ser Ser

885 890 895

Ala Thr Lys Ser Glu Ser Leu Pro Lys Gly Val Gly Leu Gly Lys Gly

900 905 910

Glu Gly Leu Asp His Cys Glu Pro Val Ser Glu Thr Gly Asn Asn Arg

915 920 925

Ala Glu Gly Asp His Glu Asp Gly Asp Thr Leu Ala Cys Phe Leu Arg

930 935 940

Asn Lys Ser Lys Arg Arg Arg Gln Cys Gly

945 950

Claims

1.杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因在提高植物耐盐性方面的应用，所述杜梨Pb4RMYB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因在提高果树耐盐性方面的应用。

3.如权利要求1所述杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因在提高拟南芥耐盐性方面的应用。

4.如权利要求1所述杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因编码蛋白在提高植物耐盐性方面的应用，所述杜梨Pb4RMYB基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

5.如权利要求4所述杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因编码蛋白在提高果树耐盐性方面的应用。

6.如权利要求4所述杜梨Pb4RMYB基因的应用，其特征在于，杜梨Pb4RMYB基因编码蛋白在提高拟南芥耐盐性方面的应用。