CN104845979B - 甘蓝型油菜skip基因家族及其重组载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及甘蓝型油菜SKIP(BnSKIP)基因家族及其重组载体和应用，BnSKIP基因家族包括BnSKIP‑1基因和BnSKIP‑2基因两个成员，BnSKIP‑1全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示，基因组DNA如SEQ ID No.12所示；BnSKIP‑2全长cDNA序列如SEQ ID No.15所示，基因组DNA如SEQ ID No.13所示；将BnSKIP‑1基因和BnSKIP‑2基因构建超量表达载体，转化甘蓝型油菜品种中油821后，获得转基因植株；与非转基因对照相比，转基因植株在干旱胁迫条件下的抗性显著提高，为通过基因工程手段改良油菜抗逆性提供了重要的基因资源。

Description

甘蓝型油菜SKIP基因家族及其重组载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜SKIP(BnSKIP)基因家族，还涉及含有BnSKIP基因家族的重组载体和BnSKIP基因家族的应用。

背景技术

干旱对农业生产有极其严重的影响，是造成全世界作物减产最主要的自然逆境因素，其危害相当于其它自然灾害之和。我国是一个水资源贫乏的国家，人均水资源占有量不及世界人均水平的1/4，是全球13个人均水资源最贫乏的国家之一。近60年来，我国年均受旱面积2157万公顷，成灾面积956万公顷，占总气象灾害受灾面积的55％。尤其是2000年以来，因旱成灾面积大幅度增加，全国年均因旱粮食损失达到3728万吨，占粮食总产的7.7％，严重威胁着我国的粮食安全。

油菜(Brassica napus)是世界上主要的油料作物之一。目前，我国常年种植面积约733万公顷，总产1200万吨，播种面积和总产量均居世界首位。作为我国传统的食用油，2009年菜籽油已占国产油料作物产油的57％以上，成为国产食用植物油的第一大来源。近年，随着人民生活水平的提高，人们对植物油的需求与日俱增，但由于油菜比价效益降低，种植面积迅速下降，导致国内食用植物油自给率低于40％，成为我国大宗农产品中对国际市场依存度最大最严峻的作物。长江流域是我国油菜主产区，虽然降雨充沛，但全年降水不均，季节性干旱频繁发生，长江中游油菜主产区常常受到秋冬旱危害，而长江上游产区则主要受春旱的危害。例如2011年，长江中下游地区遭受50年一遇的罕见高温干旱灾害，导致油菜单产和总产量均显著下降。干旱已成为限制我国油菜生产和发展的重要障碍因素之一。发生旱灾时，油菜出苗不齐、栽后出叶缓慢、绿叶面积减小、生长缓慢、植株矮小，严重影响产量，区域总产减少可达25％-32％。严重干旱还会影响营养元素的正常吸收，加重油菜缺硼的发生程度和范围，导致油菜花而不实。因此，系统研究油菜耐旱的生理、遗传和分子机理，挖掘油菜自身的基因潜力，利用基因工程技术提高油菜的抗旱能力，培育抗旱油菜新品种，对保障我国食用油供给安全，实现农业的可持续发展具有深远的理论意义与应用价值。

同为十字花科的模式植物拟南芥功能基因组学的研究成果，为推动甘蓝型油菜重要性状的分子机理研究和比较基因组学研究提供了重要参考。通过对拟南芥盐敏感突变体Atskip的研究发现AtSKIP基因在植株适应干旱、盐害和其他非生物胁迫中具有重要作用。作为细胞周期信号途径的调节因子，AtSKIP可参与拟南芥根和叶片细胞周期调节的生长和发育。AtSKIP能与剪接复合体中的剪接因子富含丝氨酸和精氨酸蛋白45(Ser/Arg-richprotein45，SR45)互作，并能通过调节时间节律相关基因PSEUDORESPONSE REGULATOR 7(PRR7)和PRR9等的可变剪接方式实现对植物生物钟的精确调控。但是，目前甘蓝型油菜SKIP基因的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、与抗旱性的关系和在基因工程中的应用等都未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜SKIP(BnSKIP)基因家族。

为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，克隆了甘蓝型油菜SKIP基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统的生物信息学分析和功能比较基因组学研究。结果显示：

所述甘蓝型油菜SKIP基因家族包括以下2个成员：BnSKIP-1基因和BnSKIP-2基因；所述BnSKIP-1基因如SEQ ID No.12所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示；所述BnSKIP-2基因如SEQ ID No.13所示，其全长cDNA序列如SEQ ID No.15所示。

甘蓝型油菜SKIP基因家族2个成员间具有较高的同源性，基因组序列一致率为92.6％，编码区序列一致性为97.1％，编码蛋白水平的一致性为98.4％。甘蓝型油菜SKIP基因家族成员BnSKIP-1和BnSKIP-2与拟南芥SKIP(AtSKIP)基因间基因组序列一致率为76.7％和75.8％，编码区序列一致率为83.1％和82.9％，编码蛋白水平的一致率为86.0％和86.7％，其中在SNW/SKIP结构域的一致性达到94.6％和95.2％。核酸水平的序列比对、系统发生聚类、特征性变异碱基、特征性变异氨基酸等方面都表明，甘蓝型油菜SKIP基因家族2个成员都是AtSKIP基因的垂直同源基因，具有相似的结构特征。

定量RT-PCR检测表明，甘蓝型油菜SKIP基因家族2个成员总体表达是相似的，也与拟南芥SKIP大体相似。BnSKIP基因家族及成员BnSKIP-1在55D种子中的表达量最高，其次是花，接着是15D种子、蕾、叶、30D种子、45D种子、根、荚果皮、下胚轴、茎，在子叶中表达量最低。成员BnSKIP-2在55D种子中的表达量最高，其次是花，但其表达量均比BnSKIP基因家族及成员BnSKIP-1稍低，而在下胚轴和子叶中的表达量却比BnSKIP基因家族及成员BnSKIP-1稍高，具体表达量高低依次为下胚轴、15D种子、30D种子、子叶、叶、45D种子、蕾、根、荚果皮、茎。

甘蓝型油菜SKIP基因家族总体及分成员逆境响应和激素诱导表达模式分析表明，BnSKIP基因家族的总体表达受PEG(10％)、甘露醇(50μM)、高温、NaCl(250mM)和脱落酸(0.1mM ABA)处理诱导表达上调，成员间对不同处理的响应不完全一致。水杨酸(5mM SA)处理对BnSKIP-2无诱导作用，但使BnSKIP-1显著上调5倍左右。这些结果均表明BnSKIP基因家族受多种逆境胁迫诱导，在甘蓝型油菜抗旱分子机制中具有重要作用。

本发明的目的之二在于提供含有甘蓝型油菜SKIP基因家族或BnSKIP基因家族截短片段的重组表达载体。

为实现上述目的利用本发明的BnSKIP基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建BnSKIP基因重组表达载体，用于SKIP基因的超量表达、反义抑制、RNA干扰和CRISP/CAS9基因编辑等。优选的，所述重组表达载体含有SEQ ID No.14所示第1～2168位和SEQ ID No.15所示第1-2214位的核苷酸序列。更优选的，所述重组表达载体是在pCAMBIA2301M1B载体的35S启动子和NOS终止子之间连入SEQ ID No.14所示第1～2168位和SEQ ID No.15所示第1-2214位的核苷酸序列；所述pCAMBIA2301M1B载体由以下方法制备：用EcoRI和HindIII限制性内切酶切下pBI121载体的GUS表达盒，连入pCAMBIA2301的EcoRI和HindIII之间，得pCAMBIA230G；然后用SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所述序列扩增pFGC5941载体的BASTA表达盒，经HindIII酶后正向连入pCAMBIA230G的HindIII酶位点处，pCAMBIA2301M1B载体。

本发明的目的之三在于提供含有上述重组表达载体的转化体。

为实现上述发明目的，本发明将重组表达载体转化入农杆菌中。

本发明的目的之四在于提供甘蓝型油菜SKIP基因家族在植物抗旱分子育种中的应用。

为达到上述目的，本发明选取BnSKIP基因家族1个正义超量表达片段BnSKIP-1(核苷酸序列与SEQ ID No.14的1-2168bp和一致，与SEQ ID No.15的1-2214bp高度相似)，将其插入pCAMBIA2301M1B载体的35S启动子和NOS终止子之间，构建了BnSKIP-1基因的正义超量表达载体pC2301M1B-BnSKIP-1，培养OX-BnSKIP-1工程菌株，并通过根癌农杆菌介导的下胚轴侵染法转入甘蓝型油菜典型黑籽品种中油821，得到了10株外源基因超量表达的转基因植株。与非转基因对照相比，转基因植株在干旱胁迫条件下的抗性显著提高，是通过基因工程手段改良油菜抗逆性的重要基因资源。

本发明的有益效果在于：本发明提供了SKIP基因在甘蓝型油菜中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、进化关系、表达的器官组织特异性和诱导特性等，并采用转基因技术在甘蓝型油菜中正义超量表达BnSKIP基因家族的一个成员，转基因植株抗旱显著提高，证明SKIP基因对于甘蓝型油菜等植物的抗旱分子育种中具有重要意义，应用前景好。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为3'RACE和5'RACE电泳图，其中泳道1-1为3'RACE第一次扩增，泳道1-2为3'RACE第二次扩增，泳道2-1为5'RACE第一次扩增，泳道2-2为5'RACE第二次扩增。

图2为BnSKIP基因家族全长基因组DNA电泳图，其中第1泳道为BnSKIP-1全长基因组DNA的扩增，第2泳道为BnSKIP-2全长基因组DNA的扩增。

图3为甘蓝型油菜2个SKIP蛋白与其它的SKIP蛋白的系统分析(玉山筷子芥：XP_002889128；拟南芥：AtSKIP；白菜：Bra015687；甘蓝：Bol027574；盐水芹：TpSKIP；山萮菜：ESQ27402；荠菜：EOA33904；苜蓿：XP_003594547；大豆：NP_001237712；杨树：XP_002332355；葡萄：XP_002283858；桃树：EMJ04082；高粱：XP_002454583；玉米：NP_001152362；二穗短柄草：XP_003570590；水稻：NP_001048184；江南卷柏：XP_002963888；小立碗藓：XP_001762646；小球藻：EFN54130；丝盘虫：XP_002117236；中国仓鼠：XP_003499705；褐家鼠：NP_001102749；小家鼠：EDL02956；穴兔：XP_002719668；苏门答腊猩猩：NP_001127521；非洲象：XP_003408847；马：XP_001492173；牛：NP_001071302；短尾猊：XP_001367089；北美绿蜥蜴：XP_003214414；非洲爪蟾：NP_001089903；斑马鱼：NP_001002864；囊舌虫：XP_002741369；文昌鱼：XP_002613528；肩突硬蜱：XP_002405417；埃及伊蚊：XP_001648953；赤拟谷盗：XP_971504；人虱：XP_002424133；丽蝇蛹集金小蜂：NP_001135956；小蜜蜂：XP_003698978；熊蜂：XP_003488198；意蜂：XP_623623；苜蓿切叶蜂：XP_003703527；印度跳蚁：EFN87996；佛罗里达弓背蚁：EFN68099；切叶蚁：EGI59317；火蚂蚁：EFZ18215；进化树由NJ法构建，每个分支上的数值为自展检验值(1000次重复)。

图4为AtSKIP与BnSKIP家族2个蛋白的二级结构图。

图5为BnSKIP基因家族总体及分成员在甘蓝型油菜各器官中转录水平的qRT-PCR检测结果，其中A为BnSKIP基因家族总体在甘蓝型油菜各器官中转录水平的qRT-PCR检测，B为BnSKIP-1基因在甘蓝型油菜各器官中转录水平的qRT-PCR检测，C为BnSKIP-2基因在甘蓝型油菜各器官中转录水平的qRT-PCR检测；Ro表示根；Hy表示下胚轴；Co表示子叶；St表示茎；Le表示叶；Bu表示蕾；Fl表示花；SP表示荚果皮；15D、30D、45D和55D分别表示开花后15、30、45和55天的种子。

图6为甘蓝型油菜BnSKIP基因家族总体及分成员逆境响应和激素诱导表达模式；A为PEG6000处理；B为甘露醇处理；C为高温胁迫处理；D为NaCl处理；E为ABA处理；F为SA处理；0h表示对照；0.5h表示处理后0.5h；6h表示处理后6h；12h表示处理后12h。

图7为植物表达载体pCAMBIA2301M1B用XbaI+SacI完全双酶切验证的电泳图，其中CK为未酶切的质粒对照，1和2均为双酶切后线性化的pCAMBIA2301M1B载体骨架；M为Marker。

图8为包含cDNA片段的T载体质粒pGEM-BnSKIP-1和pGEM-BnSKIP-2用XbaI+SacI完全双酶切验证的电泳图，其中1和2分别为双酶切后片段，3和4分别为未酶切的质粒对照；M为Marker。

图9为构建成功的pC2301M1B-BnSKIP-1和pC2301M1B-BnSKIP-2(简称OX-BnSKIP-1和OX-BnSKIP-2)质粒用XbaI+SacI完全双酶切验证的电泳图，其中2和4分别为双酶切后片段，1和3分别为未酶切的质粒对照；M为Marker。

图10为OX-BnSKIP-1和OX-BnSKIP-2z植物过量表达载体转化甘蓝型油菜中油821的再生植株进行PCR检测结果，A为引物组合F35S3ND+RNOS5ND，B为引物组合F35S3ND+SKIP-52，C为引物组合F35S3ND+SKIP-52，泳道1-4的模板为OX-BnSKIP-1T₀代植株的基因组DNA；泳道5-8的模板为OX-BnSKIP-2T₀代植株的基因组DNA；泳道9的模板为中油821的基因组DNA；泳道10的模板为OX-BnSKIP-1质粒对照。

图11为自然失水12天后的中油821和过量表达BnSKIP-1的OX-BnSKIP-1转基因苗。

图12为自然失水对对照中油821和转基因植株叶片丙二醛含量的影响；G72-2,G44-12，G60-1代表的是过量表达BnSKIP-1转基因株系的编号；数据表示为3次重复的平均值±标准差(n＝3)；柱形图上的单星号(*)和双星号(**)分别表示P<0.05和P<0.01。

图13为自然失水对对照中油821和转基因植株叶片超氧化物歧化酶活性的影响；G72-2，G44-12，G60-1代表的是过量表达BnSKIP-1转基因株系的编号；数据表示为3次重复的平均值±标准差(n＝3)；柱形图上的单星号(*)和双星号(**)分别表示P<0.05和P<0.01。

图14为自然失水对对照中油821和转基因植株叶片脯氨酸含量的影响；G72-2，G44-12，G60-1代表的是过量表达BnSKIP-1转基因株系的编号；数据表示为3次重复的平均值±标准差(n＝3)；柱形图上的单星号(*)和双星号(**)分别表示P<0.05和P<0.01。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明采用的植物材料：甘蓝型油菜的材料为典型黑籽DH系中油821，均由重庆市油菜工程技术研究中心提供，常规大田试验条件种植。

本发明采用的试剂及试剂盒：pGEM-T载体购自美国Promega公司；RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、DNA Ligation Kit、Taq DNA聚合酶、DNase I(RNase-free)及buffer、RNaseInhibitor、DL-2000及λ-HindIII DNA Marker购自大连宝生物(TaKaRa)生物工程有限公司；限制性内切酶SacI和XbaI等购自美国NEB公司；X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid)和Silwet L-77购自Sigma公司；MS(Murashige&Skoog medium,including vitamins)培养基为荷兰Duchefa公司产品；DL-2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等试剂购北京全式金(Transgen)生物技术有限公司；利福平(Rif)、链霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖、Tris、CTAB、Tris饱和酚(pH＝8.0)、Tryptone、YeastExtract、X-gal、IPTG、CTAB、脯氨酸、酸性茚三酮、冰醋等其它生化与分子生物学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。植物丙二醛(malondiadehyde，MDA)含量测定试剂盒和总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活性测定试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。

本发明采用的主要仪器：Veriti^TM多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；实时定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司，以及分子生物学和基因工程的其它常规仪器和设备。

实施例1、甘蓝型油菜SKIP基因家族的克隆

(1)甘蓝型油菜基因组总DNA和总RNA的提取

每个品系取典型植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。同时，以甘蓝型油菜典型黑籽系的根、下胚轴、子叶、茎、真叶、花、蕾、荚果皮、和四个时期种子(15D、30D、45D和55D)为材料，采用植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，参照试剂盒说明提取总RNA，并去除总RNA中含有的DNA杂质。电泳检测总RNA的质量，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。电泳结果表明，用CTAB法提取的甘蓝型油菜基因组总DNA的完整性好，平均分子量略大于λHindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化完全，分光光度法检测的纯度也较高，可用于PCR扩增。总RNA电泳分析表明其特征条带清晰，无明显RNA降解和DNA污染，分光光度法检测评价的质量也较好，能够满足下游实验的要求。

(2)甘蓝型油菜RACE总cDNA第一链的获得

以甘蓝型油菜中油821的蕾、花、及15天、30天、450天种子的总RNA各1μg混合，采用GeneRacer试剂盒按照其说明书操作，得到在3’和5’同时锚定有人工接头序列的总cDNA第一链，并用于下一步的RACE锚定扩增。

(3)甘蓝型油菜SKIP基因家族5’cDNA末端和3’cDNA末端的扩增

通过Geneious Pro 4.85对拟南芥AtSKIPa、水稻OsSKIPa等基因进行多重比对，根据SKIP保守点设计RACE的基因特异引物(GSP)：正向引物SKIP-31和SKIP-32，反向引物SKIP-51和SKIP-52，具体见表1所示。以甘蓝型油菜RACE试剂盒合成的总cDNA为2μL模板，引物SKIP-51和SKIP-31分别与试剂盒提供的Universal Primer A Mix(简称UPM，包括0.4μMLUPM和2μM SUPM)配对进行BnSKIP基因家族5'RACE和3'RACE末端的初次扩增反应。PCR反应的程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。然后以5’RACE末端的初次扩增产物0.1μL为模板，NUP和SKIP-52为引物进行5’RACE的巢式扩增，扩增程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环；72℃延伸10min；以3’RACE末端的初次扩增产物0.1μL为模板，NUP和SKIP-32为引物进行3’RACE的巢扩增，扩增程序为：94℃变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。

结果显示，BnSKIP基因家族5’cDNA巢式扩增产物在约600bp有条带，与AtSKIP序列所预测的长度基本一致。回收目的条带，与pGEM-T载体连接后转化DH5α，对白斑单克隆子进行菌液PCR检测，电泳检测后发现插入片段具有丰富的长度多态性。挑选有多态性的一批代表性的阳性单克隆子，采用M13F引物进行测序。测序结果剪去SMARTer II AOligonucleotide残留的接头序列后：BnSKIP基因的5’cDNA末端序列介于579～597bp(5个579bp克隆子、1个591bp克隆子和2个597bp克隆子)。将测序结果在NCBI进行比对分析(BALSTn)，结果表明这些片段与AtSKIP具有最高的同源性，证明所得克隆子的序列为甘蓝型油菜BnSKIP基因家族的5’末端。Geneious Pro 4.85上进行的多重比对表明，尽管这些克隆子长度多态性丰富，但BnSKIP基因家族5’cDNA末端分别只代表了2条独立基因，且存在可变转录起始位点。

BnSKIP基因家族3’cDNA巢式扩增产物在600bp左右处均有条亮带，与AtSKIP基因家族所预测的长度基本一致。胶回收，与TA克隆载体连接后转化DH5α，对白斑单克隆子进行菌液PCR检测，电泳检测后发现插入片段具有一定的长度多态性。挑选有多态性的一批代表性的阳性单克隆子，采用M13F引物进行测序。测序结果表明，BnSKIP的3’cDNA末端序列介于556～606bp(2个550bp克隆子、1个556bp克隆子、1个570bp克隆子、1个586bp克隆子、2个589bp克隆子、2个606bp克隆子)。将测序结果在NCBI进行比对分析(BALSTn)，结果表明这些片段与AtSKIP基因具有最高的同源性，证明所得克隆子的序列为BnSKIP基因家族的3’末端。Geneious Pro 4.85上进行的多重比对表明，BnSKIP的3’RACE末端分别代表了2条独立基因，但每个独立基因均存在多个可变性的Poly(A)加尾位点。

表1、甘蓝型油菜SKIP基因家族的克隆引物

(4)BnSKIP基因家族全长cDNA和基因组DNA的克隆

根据BnSKIP基因家族的5’和3’cDNA末端测序结果，设计了正向引物SKIP1-F、SKIP2-F和反向引物SKIP1-R、SKIP2-R，具体引物见表1所示。正向引物和反向引物组合后用于全长cDNA和基因组序列的扩增。

BnSKIP基因家族全长cDNA和DNA序列克隆：

采用甘蓝型油菜基因组总DNA为模板，将两条正向引物SKIP1-F、SKIP2-F与两条反向引物SKIP1-R、SKIP2-R两两配对进行扩增，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。结果显示，引物组合SKIP1-F+SKIP1-R和SKIP2-F+SKIP2-R能分别扩增出了2.5kb左右的宽带，而SKIP1-F+SKIP2-R和SKIP2-F+SKIP1-R无扩增条带与基于AtSKIP的预测基本一致，胶回收、转化大肠杆菌后，送代表性克隆子测序，获得BnSKIP基因的长度分别为2452bp和2514bp(不计人工酶切位点)，核苷酸序列如SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示。

将模板替换成甘蓝型油菜总cDNA，进行与前面一样的PCR扩增，电泳结果显示在2.2kb处扩增出一条特异条带，将条带胶回收、转化大肠杆菌后，送几个代表性克隆子测序，获得的长度分别为2168和2214bp(不计人工酶切位点)，核苷酸序列如SEQ ID NO.14和SEQID NO.15所示。

对BnSKIP的所有3’cDNA末端、5’cDNA末端、全长cDNA和全长基因组序列的测序结果进行多重比对，发现它们代表2条独立基因，分别命名为BnSKIP-1和BnSKIP-2。NCBIBLASTn表明它们与AtSKIP基因有最高的同源性。

实施例2、BnSKIP基因家族的生物信息学分析

在Geneious Pro 4.85上进行序列比对、开放阅读框(ORF)查找与翻译，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和BRAD数据库(http://brassicadb.org/brad/index.php)网站上进行BLAST和蛋白序列的CDD搜索，在www.expasy.org等网站提供链接的生物信息学网站上进行蛋白质结构分析，在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html和http://www.ebi.ac.uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和聚类分析。BnSKIP蛋白与其他生物SKIP蛋白序列以ClustalW 2.0比对，然后采用MEGA 5.2软件，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，1000次自展重复(Bootstrap replicates)检验每个分支的置信度。

(1)BnSKIP基因家族核酸水平的分析

BnSKIP-1和BnSKIP-2基因(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)长度分别为2452bp和2514bp，cDNA分别为2168和2214bp(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15，不计poly(A)尾巴)。它们都有1个内含子和2个外显子，这与拟南芥AtSKIP一样，BnSKIP-1的内含子位于98-381bp处，BnSKIP-2的内含子位于111-410bp处符合GT······AG的内含子边界序列特征，并且和AtSKIP的内含子位置也相符合。

将内含子剔除后，在BnSKIP-1和BnSKIP-2cDNA序列的114-1946bp和145-1980bp区段(对应于基因组序列的398-2230bp和445-2280bp处)为1833bp和1836bp的开放阅读框(ORF，包括终止密码子)，分别编码一个由610和611个氨基酸(aa)组成的多肽链，在ORF的上游存在113bp和144bp的5’UTR，在ORF的下游存在222bp和234bp的3’UTR。2个基因成员在3’UTR中均存在一个典型的poly(A)加尾信号A₂₁₃₃ATAAA₂₁₃₈和A₂₁₆₈ATAAA₂₁₇₃。

BnSKIP基因家族各成员的核苷酸组成在不同区段变化颇大。在2个基因成员的5'UTR区，G+C含量分别为48.5％和46.7％；在ORF区G+C含量分别为51.0和41.6％；在3'UTR区G+C含量分别为32.0％和25.7％。

采用Geneious Pro 4.85对BnSKIP基因家族2个成员以及AtSKIP进行核酸水平多重比对。结果显示，芸薹属3个物种的6条SKIP基因之间具有很高的同源性，基因组序列的一致性为91.8％～99.5％，编码区序列的一致性为98.1％～100％。而且它们与AtSKIP也具有较高的同源性，基因组序列的一致性达到69.8％～72.4％，编码区序列的一致性高达78.8％～79.4％。芸薹属属内SKIP之间的一致率明显高于芸薹属SKIP基因与拟南芥SKIP同源基因之间的一致率。

(2)BnSKIP家族蛋白的进化关系和二级结构分析

Geneious Pro 4.8.5比对分析表明，BnSKIP家族2个蛋白与来自白菜和甘蓝的两个SKIP蛋白具有最高的同源性。BnSKIP-1与Bra015687和Bol027574的一致性分别为99.0％和98.0％，而BnSKIP2与上述两个蛋白的一致性分别为98.2％和98.9％，由此可以推测白菜和甘蓝融合形成甘蓝型油菜的过程中，BnSKIP-1很可能由白菜Bra015687进化而来，而BnSKIP-2可能来自甘蓝的Bol027574。BnSKIP-1和BnSKIP-2与同为十字花科的拟南芥AtSKIP分别具有85.4％和86.2％的一致性，与单子叶植物水稻OsSKIPa的一致性也可达到70.2％和70.9％。但BnSKIP-1和BnSKIP-2与小鼠(Mus musculus)MmSKIP(EDL02956)一致性仅有42.2％和42.4％。动植物SKIP蛋白的长度比较也发现，植物SKIP蛋白长为589-613个氨基酸残基，而动物SKIP要短很多，只有531-555个氨基酸残基，缺失的残基主要分布在C末端。

采用MEGA 5.2软件对BnSKIP与其他物种的SKIP蛋白以NJ法构建了系统发育树，结果如图3所示。从图中可以看出，BnSKIP-1与Bra015687、BnSKIP-2与Bol027574分别聚类在一起，然后与亲缘关系很近的盐水芹和山萮菜SKIP蛋白形成十字花科的一个分支，AtSKIP与玉山筷子芥和荠菜SKIP形成十字花科的另一个分支，它们一起形成了十字花科SKIP家族蛋白分支。然后，它们再与苜蓿和大豆等SKIP聚类形成了双子叶SKIP蛋白分支。来自单子叶植物和低等植物的SKIP与双子叶SKIP一起形成了植物SKIP类群。动物与植物SKIP类群有着显著的区别，并分为了3个大的分支，由小鼠、牛和斑马鱼等SKIP蛋白构成的脊索动物SKIP蛋白分支，由文昌鱼和囊舌虫SKIP蛋白组成的后口动物SKIP分支，红火蚁、意蜂和赤拟粉甲SKIP蛋白形成的原口动物SKIP分支。由此可以看出，本研究克隆的BnSKIP基因家族成员编码蛋白与其他生物同源基因构建的系统发育树与物种的进化关系十分吻合，暗示SKIP蛋白在动植物中的生物学功能可能比较保守，因此可以推测BnSKIP蛋白很可能具有其他植物SKIP蛋白相似的功能。

利用SOPMA对BnSKIP家族蛋白的二级结构预测，结构如图4所示。结果表明，BnSKIP的二级结构非常相似，随机卷曲占氨基酸总数的43.37％-43.93％，α螺旋占氨基酸总数的31.15％-31.91％，其它是一些延伸链和β转角。AtSKIP与BnSKIP家族两个蛋白的二级结构相似。

实施例3、BnSKIP基因家族的组织器官特异性表达及诱导表达检测

根据BnSKIP-1和BnSKIP-2的基因序列设计检测不同组织器官BnSKIP家族总体及2个BnSKIP基因成员的荧光定量引物，同时以UBC21为内参，具体引物见表2所示。

表2、不同组织器官BnSKIP家族总体及2个BnSKIP基因成员的荧光定量引物

然后采用荧光定量RT-PCR检测了BnSKIP基因家族在甘蓝型油菜12个不同组织器官中的总体表达及2个BnSKIP基因的成员特异表达，结果如图5所示。结果表明BnSKIP基因及其家族成员在上述组织器官中均有表达，且具有相似的组织特异性。经过qRT-PCR检测发现BnSKIP基因家族及成员BnSKIP-1在55d种子中的表达量最高，其次是花，接着是15d种子、蕾、叶、30d种子、45d种子、根、荚果皮、下胚轴、茎，在子叶中表达量最低。成员BnSKIP-2仍旧在55d种子中的表达量最高，其次是花，但其表达量均比BnSKIP基因家族及成员BnSKIP-1稍低，而在下胚轴和子叶中的表达量却比BnSKIP基因家族及成员BnSKIP-1稍高，具体表达量高低依次为下胚轴、15d种子、30d种子、子叶、叶、45d种子、蕾、根、荚果皮、茎。

采用定量RT-PCR检测甘蓝型油菜BnSKIP基因家族非生物胁迫和激素诱导表达特征，结果如图6所示。从图6可以看出，BnSKIP基因家族的总体表达受PEG6000、甘露醇、高温、NaCl和ABA处理诱导表达上调，而不同成员对不同处理的响应并不一致。当PEG处理至12h时SKIP基因表达量才明显上升，但BnSKIP、BnSKIP-1和BnSKIP-2在各处理时间表达量差异不明显。甘露醇处理12h后，只有BnSKIP和BnSKIP-2明显上调表达，说明在BnSKIP基因家族中BnSKIP-2对甘露醇胁迫处理更为敏感。在高温胁迫处理条件下，BnSKIP、BnSKIP-1和BnSKIP-2在胁迫处理0.5h后均显著下调表达，而处理6h后表达量迅速上调。在NaCl处理条件下，所有的BnSKIP基因家族成员表现出相似的表达模式，均表现为诱导上调表达，且随着胁迫处理时间的增加，基因诱导表达量也不断上升。以激素ABA处理油菜植株后，BnSKIP基因家族在叶片中也表现出单一的上升趋势，但两个成员间有比较明星的诱导表达上调程度差异，BnSKIP-2的上调表达倍数显著高于另一个成员BnSKIP-1。另一种与植物病害密切相关的激素SA对BnSKIP基因家族也有明显的诱导作用，两个成员间也表现出明显的差异，即BnSKIP-1的诱导表达上调程度显著高于另一个成员。这些结果表明，BnSKIP基因家族在油菜抵御外界胁迫环境，提高油菜抗性方面具有重要的作用，且两个家族成员间表现出明显的诱导表达模式分化，说明这两个成员可能在应对不同的逆境胁迫环境时具有不同的分工，从而进一步提高油菜的抗逆性。

实施例4、BnSKIP基因家族的应用

(1)BnMAPK基因家族成员正义片段的克隆

采用甘蓝型油菜中油821混合总cDNA为模板，采用引物组合SKIP1-F+SKIP1-R和SKIP2-F+SKIP2-R分别扩增BnSKIP基因家族BnSKIP-1和BnSKIP-2全长cDNA序列。将其回收，与pGEM T-easy连接，转化DH5α，挑选PCR阳性的单克隆菌液测序，结果显示，BnSKIP-1和BnSKIP-2的长度为2168bp和2214bp，与该基因的全长cDNA一致，没有突变。

(2)BnSKIP基因家族成员正义转化植物表达载体的构建

为了获得BASTA筛选标记的正义转化植物表达载体pCAMBIA2301M1B，我们首先从pBI121载体上以EcoRI和HindIII双酶切GUS表达盒，将其连接到pCAMBIA2301载体上，形成pCAMBIA230G表达载体。然后以引物BASTA-F：5’-aagcttggatctgataatttatttgaaaattcataagaaaagcaaacg-3’(SEQ ID NO.24)和BASTA-R：5’-aagctttgagatttttcaaatcagtgcgcaagacg-3’(SEQ ID NO.25)从pFGC5941载体上扩增出两端均人工添加HindIII酶切位点的BASTA表达盒，将其正向连接到HinIII酶切的pCAMBIA230G载体上，得本研究采用的平台载体pCAMBIA2301M1B。采用完全双酶切平台载体pCAMBIA2301M1B回收开环的载体骨架，结果如图7所示；同时以XbaI+SacI完全双酶切方式将BnSKIP-1和BnSKIP-2从重组T-载体质粒上切下并回收，结果如图8所示。利用T₄DNA聚合酶，将目的基因分别与载体骨架进行粘性末端的标准连接，形成正义植物表达载体pC2301M1B-BnSKIP-1和pC2301M1B-BnSKIP-2(简称OX-BnSKIP-1和OX-BnSKIP-2)，目标基因由CaMV35S启动子驱动，后接NOS终止子，形成表达盒。将其转化DH5α，得到抗Kan的克隆子，分别经各引物组合进行PCR检测和XbaI+SacI完全双酶切鉴定，如图9所示，阳性克隆子提取质粒转化根癌农杆菌LBA4404，PCR阳性克隆子即为工程菌株。

(3)农杆菌介导的正义超量植物表达载体OV-BnSKIP-1转化甘蓝型油菜

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。甘蓝型油菜典型黑籽品种中油821种子在清水中浸泡1～2h后，用75％乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用0.1％升汞浸泡15min，无菌水多次冲洗干净，然后接种于MS固体培养基(MS粉4.41g/L+Phytagel 2.6g/L+蔗糖30.0mg/L，pH5.8，灭菌锅温热灭菌；不加Phytagel即为液体培养基)上，在25℃、2000Lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8天左右无菌苗的下胚轴切成长约0.5～1.0cm的小段，接种到预培培养基MSp(MS培养基+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+1.0mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D))上预培养3天。

-80℃保存的工程菌株在加有100.0mg/L Kan+20.0mg/L Str+40.0mg/L Rif的LB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2天，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次；5000rpm、10min室温离心收集菌体，用浸染培养基MSm(MS液体培养基+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)+1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+100μM乙酰丁香酮(AS))调节细菌浓度至OD₆₀₀约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5-10min，期间间歇性轻轻摇荡，然后将小胚轴段在灭菌纸上吸干多余的菌液，接种到共培培养基MSc(MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D+50μM AS)中，23.5℃暗培养48小时。用杀菌液体培养基MSk(MS液体培养基+1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+500mg/L头孢霉素(Cef))浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基MSi(MS固体培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L2,4-D+500mg/L Cef+15ppm Basta)中培养，约2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基MSd(MS固体培养基+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L玉米素(ZT)+5.0mg/L AgNO₃+500mg/L Cef+15ppm Basta)中培养14天以上，诱导愈伤组织分化出小芽，再转接到茎分化培养基MSs(MS固体培养基+3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ZT+500mg/L Cef+10ppm Basta)中培养至长出小茎，再转接到长茎培养基MSe(MS固体培养基+0.05mg/L 6-BA+500mg/L Cef+10ppmBasta)中培养至长完整的茎片，再转接到生根培养基MSr(MS固体培养基+2mg/L萘乙酸(NAA))中培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土(质量比为1:1:1)混合物的盆钵中，按温室盆栽进行管理，最终获得10株再生植株。同时，以无Basta筛选压的相同组培条件下获得的中油821再生植株为非转基因阴性对照。

提取再生植株的叶片基因组总DNA，采用F35S3ND+RNOS5ND、F35S3ND+SKIP-52、F35S3ND+SKIP-52这3对引物组合进行PCR检测，检测结果如图10所示。F35S3ND和RNOS5ND引物序列如下，其余见表1所示；F35S3ND：5’-ggaagttcatttcatttggagag-3’(SEQ ID NO.26)；RNOS5ND：5’-tgccaaatgtttgaacgatcggg-3’(SEQ ID NO.27)。

结果显示，在3种引物组合的检测下，OX-BnSKIP-1正义表达载体转基因植株均成功扩出与阳性对照(泳道10，OX-BnSKIP-1质粒为模板)一样大小的条带，而OX-BnSKIP-2正义表达载体转基因植株均未扩出与阳性对照相同大小的条带，且阴性对照植株(中油821)无条带，OX-BnSKIP-1正义表达载体的转基因植株均为阳性植株。

(4)转基因植株性状干旱胁迫处理条件下的表型观察和生理指标测定

在人工气候培养箱中(16h光照/8h暗处理)种植油菜苗，当幼苗长至4-6片真叶时，进行12天旱处理，结果如图11所示。从图11可以看出，持续的干旱胁迫处理下对照植株ZY821植株叶片明显萎蔫并完全发生了卷曲，叶柄发生了弯曲且周围出现了发黄的枯萎叶片。而转基因植株的叶片较为正常，叶片卷曲不明显，这可能是由于转基因植株体内相应的抗逆机制在起作用，也表明BnSKIP1基因在油菜干旱胁迫中具有重要作用。

将阳性转基因植株和对照植株在人工气候箱中培养长至4片真叶时，分别取干旱胁迫处理0d、4d、8d、12d、恢复浇水3d后的叶片进行生理指标测定。丙二醛(malondiadehyde，MDA)含量测定结果如图12所示。结果显示，干旱胁迫0d和4d时，编号为G72-2、G44-12转基因植株中丙二醛含量最低，且都达到显著差异水平；干旱胁迫8d时，编号为G44-1转基因植株丙二醛含量最少，约为50nmol/g；干旱胁迫12d时，对照中油821的丙二醛含量越来越高，而转基因植株的丙二醛含量相对稳定；恢复浇水3d时，丙二醛含量都升高，转基因植株的丙二醛含量上升不明显。丙二醛是质膜过氧化的主要产物，其含量高低反映着质膜过氧化程度，OX-BnSKIP-1正义表达载体的转基因阳性植株叶片的丙二醛含量变化不明显，说明BnSKIP-1基因的过量表达对提高油菜抗旱能力具有重要作用。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力测定结果如图13所示。结果显示，干旱胁迫0d时，对照和转基因植株的SOD活性基本一致，此时植物体内没有过多的自由基存在；干旱胁迫4d时，SOD活性均上升，但是编号为G72-2、G44-12的转基因植株SOD活性达显著高于对照；干旱胁迫8d时，3个转基因植株的SOD活性都达到了最高，说明体内合成SOD增多，以清除体内增多的自由基；干旱胁迫12d时，酶活性有所下降，但是转基因植株的SOD活性还是明显高于对照植株。结果说明，持续的干旱胁迫导致体内的自由基不断积累，过量表达BnSKIP-1基因能提高SOD活性和自由基清除能力，为维持油菜在干旱胁迫条件下的正常生长具有重要作用。脯氨酸含量测定结果，如图14所示。结果表明，0d时脯氨酸含量很低且对照和转基因株系的含量几乎相等；随着干旱胁迫处理时间的增加，脯氨酸含量缓慢增加，在干旱处理12天时候达到了最大值，转基因阳性植株的脯氨酸含量显著高于对照；恢复浇水后，脯氨酸的含量有所降低，说明干旱胁迫条件下过量表达BnSKIP-1基因可提高转基因植株体内脯氨酸的合成能力，使植株积累更多的脯氨酸，提高油菜细胞质内的渗透调节能力，增强油菜对外界干旱胁迫环境的适应能力。

表型鉴定和生理指标测定结果表明甘蓝型油菜BnSKIP基因家族与植株的抗旱性密切相关，过量表达后会提高植物适应干旱胁迫环境的能力，是油菜抗逆品种改良的新资源。

最后说明的是，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，但并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。这里特别申明，应用形式上的如下改变也都必然属于本发明的精神和范围所覆盖：

1、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括来甘蓝型油菜的其它SKIP等位基因的序列，还包括来自于这个物种的其它亚种、生态型或品种的SKIP基因序列，尽管它们与序列表中所列的核苷酸序列可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括与它们在连续80bp及以上有96.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的用于甘蓝型油菜以外，还可以应用于甘蓝型油菜亲本物种。

4、本发明中的基因和其片段，除了象优先实施例中所举的采用pCAMBIA2301M1B进行载体构建以外，还以采用其它载体来进行载体构建；本发明中的载体构建物，除了象优先实施例中所举的采用根癌农杆菌LBA4404介导的下胚轴转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。

Claims (6)

1.甘蓝型油菜BnSKIP-1基因，其特征在于：所述甘蓝型油菜BnSKIP-1基因全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示，基因组DNA如SEQ ID No.12所示。

2.含有甘蓝型油菜BnSKIP-1基因截短片段的重组表达载体，其特征在于：所述甘蓝型油菜BnSKIP-1基因截短片段如SEQ ID No.14第1~2168位所示。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA2301M1B 载体的35S启动子和NOS终止子之间连入SEQ ID No.14所示第1~2168位；所述pCAMBIA2301M1B 载体由以下方法制备：用EcoRI和HindIII限制性内切酶切下pBI121载体的GUS表达盒，连入pCAMBIA2301的EcoRI和HindIII之间，得pCAMBIA230G；然后用SEQID NO.24和SEQ ID NO.25所述序列扩增pFGC5941载体的BASTA表达盒，经HindIII酶后正向连入pCAMBIA230G的HindIII酶位点处，得pCAMBIA2301M1B载体。

4.含有权利要求2~3任一项所述重组表达载体的转化体。

5.权利要求1所述甘蓝型油菜BnSKIP-1基因在改良植物抗旱能力中的应用，其特征在于：所述植物为油菜。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为甘蓝型油菜。