CN105087587B

CN105087587B - 花生Δ12脂肪酸脱氢酶AhFAD2‑2A基因的启动子及其应用

Info

Publication number: CN105087587B
Application number: CN201510575980.2A
Authority: CN
Inventors: 张新友; 石磊; 苗利娟; 黄冰艳; 齐飞艳; 秦利; 刘华; 董文召; 汤丰收; 高伟; 藏秀旺; 张忠信
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2035-09-11
Also published as: CN105087587A

Abstract

本发明公开了Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2‑2A基因启动子（P _AhFAD2‑2A）及其应用，属于生物技术领域。该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中所示。本发明从花生中克隆出花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2‑2A 基因启动子，利用该启动子构建重组表达载体，然后将所述表达载体利用农杆菌介导的方法转化拟南芥，启动下游重组基因在种子、根和花药中表达，在其它组织中不表达，是一个组织特异性启动子，因此可将其应用于转基因工程中，使得目的基因表达产物在一定器官或组织中积累，增加组织中的表达量，发挥更好效果，同时避免植物自身能量的浪费，因此在基因工程育种及转基因研究中具有重要应用价值。

Description

花生Δ12脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子，同时还涉及AhFAD2-2A基因启动子的制备方法及其应用。

背景技术

花生是世界上最重要的经济作物之一，在世界食用油消费及消遣食品中占有举足轻重的地位。籽仁含油量一般为46%-57%，其中油酸、亚油酸是最重要的组份，二者含量之和一般占80%以上，两者均为不饱和脂肪酸，分别含有1个和2个不饱和键。油酸含量或油酸／亚油酸比值（O／L）是衡量花生耐贮藏性及品质的重要生化指标，该值愈大，花生耐贮藏性愈好，其品质愈高。从对人体健康方面考虑，亚油酸的氧化产物具有导致动脉粥样化的潜在危险，同时还产生难闻的气味和腐败恶臭的不适口感，油酸在降低收缩压、保护低密度脂蛋白、降低有害胆固醇、维持有益胆固醇（高密度脂蛋白）和减缓动脉粥样硬化等方面发挥重要作用。而我国花生品种的油酸/亚油酸的比值普遍偏低，大果品种一般在1.3左右，小果品种一般在1.0左右。

Δ¹²脂肪酸脱氢酶（delta 12-fatty acid desaturase, FAD2）是负责向油酸中引入第二个双键生成亚油酸的关键酶，决定了油籽中油酸和亚油酸的比例。花生中存在2个同源非等位FAD2基因（AhFAD2-1A和AhFAD2-1B），这2个基因在编码区的DNA 序列高度同源（99%），分别来源于花生区组A基因组和B基因组。另外，在花生基因组中还存在一些FAD2的假基因。FAD2基因结构和表达水平的变化是导致花生高油酸性状产生的原因。高油酸天然突变体F435的AhFAD2B基因起始密码子后第442位核苷酸有一个碱基A插入，导致移码突变，使翻译提前终止。高油酸突变体M2-225和C458分别是在AhFAD2B基因起始密码子后997bp和665bp处存在MITE插入，导致基因功能丧失。AhFAD2A基因在448个碱基出现G→A突变，导致高油酸性状产生。Jung等研究证实，控制高油酸性状的ol1位点和ol2位点分别编码AhFAD2A和AhFAD2B基因，花生高油酸性状的产生是由于AhFAD2A和AhFAD2B 基因同时突变，导致其编码的酶蛋白活性降低或功能丧失所致。在棉花、油菜、大豆、美国黑提葡萄、亚麻芥、洋葱中，FAD2都是以多个成员的形式存在。Chi等在花生中克隆了FAD2-2基因，该基因可以将酿酒酵母的内源油酸转化为亚油酸。阐明这些FAD2基因及其假基因启动子的功能，对于研究FAD2的功能、进化模式及改良花生脂肪酸组份及品质具有重要意义。目前对FAD2基因的研究主要集中在基因编码区的功能研究上，对该基因启动子的研究鲜有报道。

启动子包含多种重要顺式作用元件参与基因的转录，参与调控下游基因的表达，使得植物能够适应外界环境的变化及自身生长发育的需要。因此对植物启动子的研究有助于了解基因表达模式及其调控机理。随着分子生物学的发展和基因工程研究的需要，人们分离了大量的启动子，并对它们进行了鉴定，获得了一大批有应用前景的启动子，按照启动子的表达模式可分为三类：第一类是组成型启动子，这类启动子在各个器官、组织、不同的发育阶段和各种环境下都有转录活性；第二类是组织特异性启动子，这类启动子仅在特定的细胞、组织和发育阶段具有转录活性；第三类是诱导型启动子，这类启动子在特定的生物或非生物信号诱导下具有转录活性。目前植物基因工程中广泛应用的是组成型启动子，它们驱动目的基因在植物各个组织和整个发育阶段都表达，这造成了物质和能量的浪费，增加了植物的代谢负担，有时候影响植物的发育，甚至引起植物形态的改变。因此采用特异性启动子取代组成型启动子，使外源基因能够特异性的表达，是植物基因工程的重要内容。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2-2A的启动子P _AhFAD2-2A。

本发明的另一个目的：提供一种操作简单、结果稳定可靠的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2-2A启动子P _AhFAD2-2A的制备方法。

本发明的再一个目的：提供一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。

本发明还有一个目的：提供一种花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2-2A启动子P _AhFAD2-2A在种子、根和花药中的应用。

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种分离的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A，其序列是下列核苷酸序列之一：

（a）序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（b）在严谨条件下能与（a）的核苷酸序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列；

（c）与（a）或（b）的核苷酸序列具有90%以上的同源性，并且具有所述启动子功能的核苷酸序列。

一种花生P _AhFAD2-2A启动子的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）利用SDS裂解法提取基因组DNA，所用引物为：

P _AhFAD2-2AS：5＇- CGGGGTACCGAGCCTATATTTGAGATATGCAATG-3＇；

P _AhFAD2-2AA：5＇- GACATCTAGA AGGAGAAGGTGTGACGGAG-3＇；

（2）以基因组DNA为模板，以P _AhFAD2-2AS、P _AhFAD2-2AA为引物进行PCR扩增，反应体系为25 μL，包括：1×PCR buffer、MgCl₂ 1.5 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、Pfu Taq酶1.5单位、模板30 ~ 100 ng，体系中每种引物浓度均为0.5 mol/L；

扩增过程为：95℃ 预变性1 min；94℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min；

（3）PCR产物经质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片段；按回收片段、pMD18-T载体3:1的摩尔比混合，加入5个单位的T₄ DNA连接酶，10×反应缓冲液2.5 μL，用无菌水补充体积至25 μL，16℃连接过夜，获得连接液；

（4）用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，将连接液涂布于含有氨苄青霉素 50mg / L的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，挑选白斑，进行菌落PCR检测，将阳性重组子接种于含氨苄青霉素 50 μg/mL的LB液体培养基，37℃ 200 r/min振荡培养过夜，用小量碱法提取质粒，SalⅠ/ XbaⅠ 双酶切1 μg质粒，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测；检测正确的阳性重组克隆，将目的片段连入pMD18-T载体，获得载体pMD18-P _AhFAD2-2A ，即得到所述的P _AhFAD2-2A启动子。

所述的花生P _AhFAD2-2A启动子的制备方法，其中LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠和8 g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000 mL；然后分装于500 mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴ Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

4、如权利要求2所述的花生P _AhFAD2-2A启动子的制备方法，其特征在于，其中LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000 mL，然后分装于500 mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴ Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A的重组载体。

所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A的重组载体的构建方法，该方法包括以下步骤：

首先用SalⅠ/XbaⅠ双酶切克隆载体pMD18-P _AhFAD2-2A，同时用SalI / XbaI 双酶切pBI-P _AhSAD-GUS质粒；酶切反应在37℃培养箱中进行，反应4~6小时后用质量体积比1%的琼脂糖胶电泳检测；

将克隆载体pMD18-P _AhFAD2-2A酶切下的3 Kb的片段和pBI-P _AhSAD-GUS酶切下的10 Kb的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收；按3 Kb片段、10 Kb片段的摩尔浓度3:1的比例混合，加入T4 DNA连接酶5个单位、10×反应缓冲液2 μL，用无菌水补充体积至20 μL，16℃过夜；

用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR检测，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证正确的重组质粒，命名为pBI-P _AhFAD2-2A。

所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A在种子中的应用。

所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A在花药中的应用。

所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A在根中的应用。

本发明的积极有益效果（优点）：

1、本发明的启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位，可应用于植物基因工程研究和花生的转基因研究中。

2、本发明的启动子能够调控下游GUS基因表达，并通过组织化学分析，获得具有种子、根和花药中表达功能的花生启动子。

3、本发明克隆到花生来源的P _AhFAD2-2A。从改善种子的营养品质、改良根发育、转基因安全性防控等方面考虑，这种启动子具有应用潜力。用P _AhFAD2-2A替换pBI-P _AhSAD-GUS质粒上的P _AhSAD启动子序列，构建pBI-P _AhFAD2-2A重组植物表达载体，其中的GUS基因受P _AhFAD2-2A的调控。通过转基因实验证明，该启动子在种子、根和花药中高强度驱动GUS基因的表达以及在其它组织中完全不驱动GUS基因表达，可以用此启动子代替CaMV35S强启动子来驱动，如可以通过构建含有该启动子驱动增加种子营养成份或油脂成份基因的载体，转化受体植株，人工创造营养更加丰富的种子；可以通过构建含有该启动子驱动的某些改善根发育的基因，提高作物的抗旱抗逆能力；或引起花药败育的基因的载体，转化受体植株，人工创造雄性不育材料，应用在杂交育种生产中；或控制转基因植物通过花粉飘逸造成的转基因的逃逸；或通过启动子驱动某些提高花粉营养成分的基因，改善花粉营养等。因此该启动子在基因工程育种和转基因安全领域具有重要的应用价值。

4、本发明的基因启动子P _AhFAD2-2A制备方法，操作简单、结果稳定可靠，易于实施；本发明提供了一种含有该启动子核苷酸序列植物的重组载体，该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。通过该载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。

附图说明

图1 为本发明中的一种AhFAD2-2A基因的5´RACE电泳图。

泳道1代表AhFAD2-2A 5´RACE；泳道M代表500 bp ladder的核酸Marker。

图2为本发明中的一种PCR扩增P _AhFAD2-2A片段电泳图。

泳道1为PCR扩增结果；泳道M代表500 bp ladder的核酸Marker。

图3为本发明中的一种构建的pBI-P _AhFAD2-2A载体示意图。

图4为本发明中的一种构建的pBI-P _AhFAD2-2A载体的酶切验证图。

泳道M代表500 bp ladder的核酸Marker；泳道1为KpnI / XbaI双酶切后的效果图。

图5为一种转化载体pBI-P _AhFAD2-2A的部分转基因拟南芥植株PCR鉴定图。

泳道M代表500 bp ladder的核酸Marker；泳道P代表pBI-P _AhFAD2-2A质粒的PCR扩增结果；泳道CK代表野生型拟南芥的PCR扩增结果；泳道1-10代表部分阳性株的PCR扩增结果。

图6 为一种P _AhFAD2-2A驱动GUS的转基因植株的组织化学染色结果。

A：1日苗（无色）；B：3日苗（根蓝色）；C：7日苗（根蓝色）；D：10日苗（根蓝色）；E：叶片和茎（无色）；F：花序（花药蓝色、其它无色）；G：花药（蓝色）；H：幼嫩角果（幼胚蓝色）；I：成熟角果（胚芽端蓝色）。

具体实施方式

以下实施例可以更好地理解本发明，但所述实施例并不表示对本发明的任何限制。

实施例1：一种分离的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A及其制备方法

1、花生AhFAD2-2A基因转录起始位点的确定：

根据RACE试剂盒（SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit，购自Clontech公司，货号：634941）操作说明，所用引物如表1，以花生叶片RNA为模版合成first-strand（第一链）cDNA，步骤如下：

取1.0 - 2.75 μL RNA，1.0 μL 5ˊCDS Primer A，加dd H₂O 补齐至3.75 μL；72℃温浴3 min，42℃冷却2 min，加入1 μL SMARTer ⅡA oligo，加入5.25 μL混合液（含5×first-strand（第一链）buffer 2.0 μL、1.0 μL DTT、1.0 μL dNTPs mixture、0.25 μLRNase Inhibitor以及1.0 μL SMARTScribe Reverse Transcriptase），42℃温浴90 min，72℃ 10 min终止反应，获得first-strand cDNA模板的储存液。加入100 μL EDTA稀释，得到first-strand cDNA模板的工作液；

以first-strand cDNA模板的工作液为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR以GSP1和UPM为引物，体系如下：10×buffer（含MgCl₂）5 μL，dNTPs mixture（组分中浓度各2.5mM/L）1.0 μL，GSP1（浓度10μM/L）2.5 μL，UPM（浓度10μM/L）5.0 μL，Taq 酶（5U/μL）0.2 μL，first-strand cDNA模板的工作液2.5 μL，无菌水补至50 μL。反应程序如下：94℃预变性1min；98℃变性10 s，72℃延伸2 min，共7个循环；98℃变性10 s，68℃延伸2 min，共 33个循环；72℃延伸10 min。

第二轮PCR：以第一轮PCR的反应产物50倍的稀释液作为模板，以GSP2和NUP为引物进行扩增，反应体系如下：10×buffer（含MgCl₂）5μL，dNTPs mixture（浓度各2.5mM/L）1.0μL，GSP2（浓度10μM/L）2.5 μL，NUP（浓度10μM/L）2.5 μL，Taq 酶（5U/μL）0.2 μL，模板溶液1.0 μL，无菌水补至50 μL，反应程序同第一轮PCR。PCR产物用1.0%的（质量体积比，以下相同）琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果如图1。

凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技北京有限公司，以下相同）纯化回收后，连接到pMD18-T载体（购自TaKaRa公司，以下相同），转化DH5ɑ菌株的感受态细胞（购自大连宝生物工程有限公司，以下相同），转化后的感受态均匀涂在氨苄青霉素LB固体培养基（50 mg/L）上，培养16小时后挑取阳性菌斑，并在氨苄青霉素LB液体培养基（50 mg/L）中扩繁，提取质粒并经酶切验证后测序，经测序后和基因组序列比对，两者完全同源，证明确定了花生AhFAD2-2A基因起始密码子ATG上游转录的起始位点区域。

表1 确定AhFAD2-2A基因转录起始位点区域所用引物

2、一种分离的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A，其序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

花生P _AhFAD2-2A启动子的制备方法，包括以下步骤：

（1）利用SDS裂解法提取基因组DNA

本发明所用花生（Arachis hypogeae L.）供试材料播种于大田，田间正常管理。利用SDS裂解法（J.萨姆布鲁克. D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南（第三版）科学出版社）提取基因组DNA。

所用引物为：

P _AhFAD2-2AS：5＇- CGGGGTACCGAGCCTATATTTGAGATATGCAATG-3＇；

P _AhFAD2-2AA：5＇- GACATCTAGA AGGAGAAGGTGTGACGGAG-3＇；

（2）以基因组DNA为模板，进行PCR扩增

反应体系为25 μL，内含：1×PCR buffer（含MgCl₂）、dNTP 0.2 mmol/L、Pfu Taq酶1.5单位、模板约100 ng，体系中引物浓度为0.5 mol/L。

反应步骤为：95℃ 预变性1 min；94℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min。

（3）PCR产物经1.0%（质量体积比）琼脂糖凝胶检测（图2），凝胶回收试剂盒回收目的片段。按回收片段：载体（0.3 pmo1回收片段：0.1 pmol载体）= 3:1的比例混合样品，加入T₄ DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液2.5 μL，用无菌水补充体积至25 μL，16℃连接过夜，获得连接液。

（4）冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞。将连接液涂布于含有氨苄青霉素 50 mg/ L的LB固体培养基（LB固体培养基配方如下：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10g氯化钠、8 g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升，然后分装于500毫升三角瓶中，121℃、6.859×10⁴ Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用）平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑3个，做菌落PCR检测（反应体系为25 μL，内含：1×PCR buffer、MgCl₂ 1.5 mmol / L、dNTP 0.2 mmol / L、引物浓度为0.5 mol / L，Pfu酶1.5单位，用灭菌牙签挑取少量菌斑做模版，根据具体情况设置循环参数）；将阳性重组子接种于含氨苄青霉素 50 μg/mL的LB液体培养基（LB液体培养基配方如下：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000 mL；然后分装于500 mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴ Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用），37℃ 200 r/min振荡培养过夜，小量碱法（J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南（第三版）科学出版社）提取质粒，SalⅠ /XbaⅠ 酶切质粒1 μg，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。检测将目的片段正确连入pMD18-T载体的阳性重组克隆，得到P _AhFAD2-2A启动子。

为了确保载体中启动子的序列信息，以M13F/M13R（M13F：5＇-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3＇；M13R：5＇-GTAAAACGACGGCCAGT-3＇）为引物，将pMD18-P _AhFAD2-2A进行测序，分析结果，获得了P _AhFAD2-2A，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

实施例2：花生P _AhFAD2-2A植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株 EHA105（购于上海沪尚生物科技有限公司）的转化

构建重组载体，是将质粒pBI-P _AhSAD-GUS（质粒pBI-P _AhSAD-GUS，河南省农业科学院经济作物研究所保存，下同）上的P _AhSAD启动子序列用克隆得到P _AhFAD2-2A片段替换获得。

为完成此目的，首先用SalⅠ / XbaⅠ双酶切克隆载体pMD18-P _AhFAD2-2A，同时用SalⅠ/ XbaⅠ 双酶切pBI-P _AhSAD-GUS质粒；酶切反应在37℃培养箱中进行，约反应4 ~ 6小时后，用1%（质量体积比，下同）的琼脂糖胶电泳检测。

将克隆载体pMD18-P _AhFAD2-2A酶切下的约3 Kb的片段和pBI-P _AhSAD-GUS酶切下的约10Kb的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。按照pMD18-P _AhFAD2-2A酶切下的约3 Kb的片段和pBI-P _AhSAD-GUS切下的约10 Kb的片段(150 ng 3 Kb的片段：50 ng 10 Kb的片段) =3:1的比例（摩尔浓度比）混合样品，加入T4 DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液2 μL，无菌水补充体积至20 μL，16℃连接，过夜，获得连接液。

冻融法转化连接液至DH5ɑ菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素（50 μg/mL）的固体LB培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证正确的重组质粒，命名为pBI-P _AhFAD2-2A；构建成植物表达载体pBI- P _AhFAD2-2A（图3、图4）。

利用冻融法将pBI-P _AhFAD2-2A转入根癌农杆菌EHA105，用卡那霉素（50 μg / mL）和利福平（50 μg/mL）双抗性平板筛选，48小时后挑斑，菌落用PCR检测验证，挑取阳性菌斑，保存菌株，命名为pBI-P _AhFAD2-2AEHA105。

其中的冻融法步骤如下：（1）取0.2 mL农杆菌EHA105感受态，于冰水中缓慢融化；（2）加入约2 μg 重组质粒DNA,轻轻混匀，冰浴30 min后,投入液氮速冻5 min，然后37℃水浴5 min，融化细胞；（3）加入800 μL不含抗生素的LB液体培养基，28℃轻摇培养4 ~ 5h；（4）12000 rpm离心30 s,去上清,细胞重悬于0.2 mL的LB培养基中；（5）将培养物均匀涂布在含Rif（50 mg / L）、Str（50 mg / L）和Kan（50 mg / L）的琼脂板上，28℃培养2天，待平板上出现转化子后挑菌，进行PCR检测。

实施例3： P _AhFAD2-2A植物表达载体pBI-P _AhFAD2-2A在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选

参照文献中的方法进行拟南芥转化（Zhang X.R, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature, 2006, 1: 1-6）。制备含有植物表达载体pBI-P _AhFAD2-2A的根癌农杆菌EHA105菌液，在转化拟南芥前一天，将pBI-P _AhFAD2-2AEHA105转入含有卡那霉素50 μg / mL、利福平50 μg/ mL的LB液体培养基200 mL中，28℃、220 r/min过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEKOL 1300）于276纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值在1.6 ~ 2.0之间时取出。室温（20 ~ 25℃，下同）以4000 g离心10 min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖溶液中（质量体积比）。将浑浊的蔗糖溶液倒入直径为15 cm的培养皿中，转化前加入终浓度为0.02%（体积比）的Silwet L-77（购自北京五洲元业科贸中心），混匀。把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，15秒后取出植株花序。转化后的植株用黑色塑料袋包好，放在植物生长箱中培养。

第二天将塑料袋揭开，隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，将种子在培养箱或日光下干燥3 ~ 5天。将转化收获的T0代种子用70%（体积比）的酒精和0.01%（质量比）的升汞分别消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次（5~7次），均匀地吹打到含卡那霉素（50 mg / L）的MS固体筛选培养基表面（MS固体筛选培养基组成：MS大量元素母液100mL；MS微量元素母液10 mL；MS有机母液10 mL；MS铁盐10 mL；肌醇10 mL；蔗糖30 g；用1MNaOH调pH至5.8，8 g琼脂粉，定容至1 L，121℃，6.859×10⁴ Pa下高压消毒15分钟，备用。各种母液配方见表2）。4℃避光放置3 ~ 5天后，转入植物生长培养箱【光周期16（白天）/8（黑暗）小时，温度：白天22℃，黑夜20℃】培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。

当叶片长到足够大时（3 ~ 4叶期），取少许绿苗叶片，提取DNA，进行PCR阳性检测，反应体系为25 μL，内含：1×PCR buffer，MgCl₂ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L、引物浓度为0.5 mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100 ng，

所用引物为：

P _AhFAD2-2AS：5＇- CGGGGTACCGAGCCTATATTTGAGATATGCAATG-3＇；

P _AhFAD2-2AA：5＇- GACATCTAGA AGGAGAAGGTGTGACGGAG-3＇；

根据具体情况设置循环参数，结果表明获得了转基因阳性苗。

表2 MS培养基母液配方

将获得的转基因阳性苗进行培养，待绿苗长出两片真叶后，将其移栽到蛭石中，待植株长出花序后，取一片真叶用SDS方法提取基因组DNA，做PCR鉴定。PCR鉴定时采用的引物序列为P _AhFAD2-2AS和P _AhFAD2-2AA；

PCR反应体系如下：基因组DNA模板1 μL (约50 ng)、10 × Taq酶反应缓冲液2uL、25 mM MgCL₂ 1.2 uL、2 mM dNTP 1.5 uL、10 uM引物各 0.2 uL、0.3单位Taq酶，加无菌水至20 μL。

反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸2 min，32个循环，72℃延伸5 min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明：P _AhFAD2-2A植物表达载体pBI-P _AhFAD2-2A的T-DNA区段已经成功转入拟南芥（图5），共获得30株阳性苗。

实施例4：花生P _AhFAD2-2A启动子的功能分析

本发明首次克隆得到P _AhFAD2-2A的序列，并对其进行了功能分析。从实施例3中，采用拟南芥转化及PCR检测步骤中筛选得到的阳性苗T1代，自交收获种子（即T2代）。取T2代10个株系的不同时期组织进行GUS染色。

T2代取染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液中，抽真空5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸溶液（体积比为1:1）进行脱色，直至叶片变为无色，之后用50%的酒精漂洗3-5次，体式显微镜（OLYMPUS SZX16）拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，取嫩叶、成熟叶片、开过的花朵、未开的花蕾、不同时期的角果及幼胚，开花后的幼胚用解剖针在显微镜下取出。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。其中GUS染液的组成为：X-gluc 0.5 mg / mL，磷酸缓冲液 50 mmol / L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5 mmol / L，EDTA 10 mmol / L，Triton-x-100 0.001%（体积比），甲醇 20%（体积比）。

染色结果发现（表3、图6）：在拟南芥的整个生长过程中，只有种子、根和花药被染成蓝色在其它组织中未出现蓝色。由此可见，该启动子驱动的GUS基因主要在种子、根和花药中表达，其它组织中不表达。

实验结果表明，花生P _AhFAD2-2A启动子具有如下生物学功能：该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的种子、根和花药中表达，在其它组织中不表达。P _AhFAD2-2A调控下的GUS基因具有一定时空表达特性，这说明P _AhFAD2-2A具有驱动下游报告基因GUS在受体植物中表达的功能。在该启动子的调控下，GUS 基因能够主要在转基因植株的种子、根和花药中精细表达，而在其它组织中完全不表达。

这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全（改良种子营养成份、食用、改良根发育、安全性防控）中具有应用价值。如利用该启动子构建含有该启动子驱动增加种子营养成份或油脂成份基因的载体，转化受体植株，人工创造营养更加丰富的种子；如可以通过构建含有该启动子驱动的某些改善根发育的基因，提高作物的抗旱抗逆能力，或是引起花药败育的基因的载体，转化受体植株，人工创造雄性不育材料，应用在杂交育种的生产，或是控制转基因植物通过花粉飘逸造成的转基因的逃逸，或是通过启动子驱动某些提高花粉营养成分的基因，改善花粉营养等。可应用于植物基因工程和转基因植株的安全防控领域。

表3 P _AhFAD2-2A转基因拟南芥T2代株系的GUS染色统计表

注：Y表示蓝色，N表示无色。

Claims

1.一种分离的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A，其特征在于，其序列是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述的花生P _AhFAD2-2A启动子的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）利用SDS裂解法提取花生基因组DNA，所用引物为：

P _AhFAD2-2AS：5＇- CGGGGTACCGAGCCTATATTTGAGATATGCAATG-3＇；

P _AhFAD2-2AA：5＇- GACATCTAGA AGGAGAAGGTGTGACGGAG-3＇；

（2）以基因组DNA为模板，以P _AhFAD2-2AS、P _AhFAD2-2AA为引物进行PCR扩增，反应体系为25 μL，包括：1×PCR buffer、MgCl₂ 1.5 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、Pfu Taq酶1.5单位、模板30~ 100 ng，体系中每种引物浓度均为0.5 mol/L；

（4）用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，将连接液涂布于含有氨苄青霉素 50 mg /L的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，挑选白斑，进行菌落PCR检测，将阳性重组子接种于含氨苄青霉素 50 μg/mL的LB液体培养基，37℃ 200 r/min振荡培养过夜，用小量碱法提取质粒，SalⅠ/ XbaⅠ 双酶切1 μg质粒，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测；检测正确的阳性重组克隆，将目的片段连入pMD18-T载体，获得含有花生P _AhFAD2-2A启动子的载体pMD18-P _AhFAD2-2A。

3.如权利要求2所述的花生P _AhFAD2-2A启动子的制备方法，其特征在于，其中LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠和8 g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000 mL；然后分装于500 mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴ Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

4.如权利要求2所述的花生P _AhFAD2-2A启动子的制备方法，其特征在于，其中LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000 mL，然后分装于500 mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴ Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

5.含有权利要求1所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A的重组载体。

6.权利要求5所述的含有花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A的重组载体的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

首先用SalⅠ/XbaⅠ双酶切权利要求2中所述的载体pMD18-P _AhFAD2-2A，同时用SalI / XbaI双酶切pBI-P _AhSAD-GUS质粒；酶切反应在37℃培养箱中进行，反应4~6小时后用质量体积比1%的琼脂糖胶电泳检测；

将载体pMD18-P _AhFAD2-2A酶切下的3 Kb的片段和pBI-P _AhSAD-GUS酶切下的10 Kb的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收；按3 Kb片段、10 Kb片段的摩尔浓度3:1的比例混合，加入T4 DNA连接酶5个单位、10×反应缓冲液2 μL，用无菌水补充体积至20 μL，16℃过夜；

7.权利要求1所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A在驱动目的基因在花生的种子中表达的应用。

8.权利要求1所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A在驱动目的基因在花生的花药中表达的应用。

9.权利要求1所述的花生Δ¹²脂肪酸脱氢酶AhFAD2-2A基因启动子P _AhFAD2-2A在驱动目的基因在花生的根中表达的应用。