CN105001317B - TuVIPP1蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TuVIPP1蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明实验证明，本发明从二倍体乌拉尔图小麦中克隆了TuVIPP1基因，并通过转基因互补拟南芥Atvipp1T‑DNA插入缺失突变体验证了该基因在内囊体发生中的关键作用，可以促进植物光合作用，使白化植物绿化。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种TuVIPP1蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
VIPP(vesicle-induceing protein in plastids，质体囊泡诱导生成蛋白)是一种叶绿体定位蛋白，据报道在衣藻和拟南芥叶绿体内膜、基质和内囊体膜上均有分布，vipp基因缺失突变体存在内囊体结构严重缺陷，不能光合自养等表型。在主要农作物中，VIPP基因的功能还未见研究报道。
近年来，利用模式植物(拟南芥)系统为手段，用来研究作物大豆、小麦等中的重要基因的研究策略得到科学家们广泛的应用。根本原因在于作物基因组复杂，要想研究其重要基因的功能周期长且工作难度大。因此以反向遗传和模式植物为研究策略，以分子生物学、遗传学、细胞生物等研究技术为研究手段的实验体系应育而生。
发明内容
本发明的目的是提供一种TuVIPP1蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白，命名为TuVIPP1蛋白，来源于小麦，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2的氨基酸序列残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子为如下1)4)中任一所述的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的核苷酸；
2)编码区为序列表中序列3所示的核苷酸；
3)在严格条件下与1)杂交且编码与上述蛋白具有相同功能蛋白的DNA分子；
4)与1)具有90％以上同源性且编码与上述蛋白具有相同功能蛋白的DNA分子。
上述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。
本发明的实施例中，重组载体将序列表中序列3所示的DNA分子插入pCAMBIA1300载体的EcoRI和PstI酶切位点得到的载体，命名为TuVIPP1OE-pCAMBIA1300。序列表中序列3所示的DNA分子包括启动子CaMV35S、基因TuVIPP1和终止子OCS，其中，启动子CaMV35S为序列表中序列3自5’末端第1-1427位核苷酸、基因TuVIPP1为序列表中序列3自5’末端第1428-2429位核苷酸、终止子OCS为序列表中序列3自5’末端第2430-3207位核苷酸。
上述的蛋白、上述DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在调控植物光合作用和/或使植物开花和/或使植物结实和/或使植物产生内囊体膜结构和/或使白化植物变为绿化植物中的应用也是本发明保护的范围。
上述植物或所述白化植物均为拟南芥纯合突变体Atvipp1(-/-)。
上述的蛋白、上述DNA分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在培育具有如下1)-3)中至少一种特征的转基因植物中的应用也是本发明保护的范围：1)绿化表型；2)开花和/或结实；3)产生内囊体膜结构。
本发明的另一个目的是提供一种培育开花和/或结实的转基因拟南芥的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将上述的DNA分子转入杂合突变体Atvipp1(+/-)拟南芥中，得到转基因拟南芥；
2)将转基因拟南芥和杂合突变体Atvipp1(+/-)播种培育后代，选取转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代；
所述转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代具有如下A-C中至少一种表型：
A、所述转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代为绿化植物；
B、所述转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代能开花和/或结实；
C、所述转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代产生内囊体膜结构。
Atvipp1基因型通过如下方法鉴定：
AtTuV1OE-f和AtTuV1OE-f扩增798bp TuVIPP1基因；
AtVIPP1-f和AtVIPP1-r扩增669bp的野生型AtVIPP1条带；
AtVIPP1-r和pCSA110LB3扩增525bp T-DNA插入片段；
株系仅有525bp，为(-/-)AtVIPP1基因型；
株系有669bp与525bp，为(+/-)AtVIPP1基因型；
株系仅有669bp，为(+/+)AtVIPP1基因型。
株系有798bp TuVIPP1基因，为转基因植物。
本发明的实验证明，本发明从二倍体乌拉尔图小麦中克隆了TuVIPP1基因，并通过转基因互补拟南芥Atvipp1T-DNA插入缺失突变体验证了该基因在内囊体发生中的关键作用，可以促进植物光合作用，使白化植物绿化。
附图说明
图1为TuVIPP1 PCR产物电泳
图2为突变体MS平板上生长7天的幼苗表型观察
图3为突变体播种2周表型观察
图4为突变体植株PCR鉴定电泳图
图5为TuVIPP1OE-pFGC5941载体结构示意图
图6为TuVIPP1OE-pCAMBIA1300载体结构示意图
图7为T1代转基因植株PCR检测
图8为T2代转基因植株PCR检测
图9为转TuVIPP1拟南芥的表型鉴定
图10为野生型Col-0植株叶绿体结构
图11为纯合突变体Atvipp1(-/-)叶绿体结构
图12为纯合突变背景下的转TuVIPP1植株叶绿体结构
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、TuVIPP1的克隆与测序分析
乌拉尔图小麦(Triticum urartu)品种G1812(Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticum urartu。Hong-Qing Ling等，Nature、496卷、7443 期、页码87-90。)的10天幼苗取叶片100mg，使用全式金公司EasyPure Plant RNA kit(Code#ER301-01)和TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix(Code#AT311-02)按操作指南提取总RNA，RT-PCR获得TuVIPP1cDNA全长，具体如下：
1、反转录
以提取的总RNA为模板，按照如下反转录体系进行，得到cDNA。
反转录体系为：
Total RNA 5ul
Oligo-dT 1ul
RNase-free Water 2ul
离心管混匀上述溶液，65℃5分钟，冰浴2分钟，继续加入以下溶液，
2X TS Reaction Mix 10ul
TransScript RT/RI Enzyme Mix 1ul
gDNA Remover 1ul
轻轻混匀，置42℃反应30分钟，85℃ 5分钟终止反应，4℃ 10分钟。
取1ul反转录产物作为模板进行后续PCR反应。
2、PCR扩增TuVIPP1片段
克隆TuVIPP1所用引物为：
TuVIPP1-F:5’-TTTCCATGGCAACAATGCTCCTCTCGGTGCGCCGCCT-3’
TuVIPP1-R:5’-GCGCGCGGATCCGCTAGCTTAATAATCGTTGGCCTTCTCCC-3’
F端与R端引物分别引入NcoI和BamHI酶切位点；
采用全式金公司 FastPfu DNA Polymerase(Code#AP221-12)扩增TuVIPP1全长片段，反应体系如下：
PCR程序为：
得到1002bp的PCR产物(图1)。
3、TuVIPP1 cDNA序列测定
使用全式金pEASY-Blunt Cloning kit(Code#CB101-01)，按操作指南将1002bp的PCR产物连入pEASY-Blunt载体，转化Trans-T1感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒为模板，用M13F、M13R引物双向测序，上述PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，命名为TuVIPP1，其编码的蛋白命名为TuVIPP1，其氨基酸序列为序列表中序列 2。
pEASY-Blunt-TuVIPP1为将序列1所示的TuVIPP1基因插入pEASY-Blunt载体得到的载体。
实施例2、TuVIPP1在提高植物光合作用中的应用
一、拟南芥Atvipp1 T-DNA插入突变体Atvipp1(+/-)的鉴定
拟南芥Atvipp1 T-DNA插入突变体Atvipp1(+/-)编号Sail_5_F07，购自NASC(TheEuropean Arabidopsis Stock Centre，仅VIPP1基因缺失，其余基因与野生型一致)。本突变体在3，4外显子之间有T-DNA片段插入，使VIPP1基因的表达受到完全抑制产生半致死的表型。为了实现实验的可靠性和真实性，购买回来的拟南芥突变体需要进一步在分子水平和宏观(表型)水平对其进行鉴定。
1、表型鉴定突变体Atvipp1(+/-)
取适量干燥的拟南芥突变体Atvipp1(+/-)和野生型拟南芥col-0，购自NASC(TheEuropean Arabidopsis Stock Centre)。种子于1.5ml离心管中，按水：30％次氯酸钠水溶液体积比9:1配置表面消毒液。将种子浸泡在消毒液中消毒15min。之后在超净台里倒掉消毒液，用无菌水清洗6次。将消毒好的种子均匀平铺在MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基平板上。铺板之后，用Parafilm封口膜密封培养皿，4℃下处理48小时，转入光照培养箱，生长10天后，将幼苗移至土壤中生长。土壤用营养土和蛭石按2:1比例混匀使用，培养条件为：光照强度：100umolm-2s-1；相对湿度： 50-70％；温度：20-22℃；光周期：16小时光照/8小时黑暗。MS培养基配方(1L) 为：MS粉(PhytoTechnology Laboratories，Prod No：M519)4.43g，蔗糖20g，琼脂粉8g，加水至1L，用NaOH调pH值至5.6-5.8。
在MS平板上生长7天，观察表型，如图2所示，野生型col均为绿苗，Atvipp1(+/-)突变体有约1/4为白化苗，即纯合突变体Atvipp1(-/-)。
突变体Atvipp1(+/-)幼苗土壤播种2周，如图3所示，部分幼苗白化，生长停滞 (箭头显示)，其为纯合突变体Atvipp1(-/-)继续培养，无法开花；部分幼苗正常生长与野生型拟南芥无显著差异。纯合突变体Atvipp1(-/-)在MS平板上生长4周，结果如图3所示，可以看出，纯合突变体Atvipp1(-/-)白化。
上述结果表明，纯合突变体只能在含糖的培养基上生长，完全白化，无法开花，杂合突变体Atvipp1(+/-)可以进行传代。
2、分子鉴定杂合突变体Atvipp1(+/-)因部分杂合突变体Atvipp1(+/-)与野生型拟南芥col-0植株后代在表型上无明显差异，需PCR鉴定。
采用CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取杂合突变体Atvipp1(+/-)白化后代、杂合突变体Atvipp1(+/-)绿化后代与野生型拟南芥col-0植株基因组DNA。
用鉴定T-DNA插入所需引物：
AtVIPP1-f:5’-CGCTGAGAGTGAATGTGTTG-3’
AtVIPP1-r:5’-GACTTTCGTCGTTTAAGGGC-3’
pCSA110LB3：5’-TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC-3’
其中AtVIPP1-f与AtVIPP1-r配合PCR产物为669bp野生型AtVIPP1条带，pCSA110LB3与AtVIPP1-r配合PCR产物为525bp T-DNA插入条带，只产生前者为野生型，只产生后者为纯合插入突变体，两者都有为杂合突变体，选择杂合突变体进行后续的转基因互补。
使用全式金EasyTaq DNA polymerase进行PCR检测：
反应体系为：
PCR程序为：
结果如图4所示，Col为野生型col-0对照，Pale为杂合突变体Atvipp1(+/-)白化后代，Green为杂合突变体Atvipp1(+/-)绿化后代，可以看出，野生型拟南芥col-0 只有单一的野生型条带，白化苗只有T-DNA插入的条带，即为纯合突变体 Atvipp1(-/-)，绿苗中以红色字体标出的植株均有两条条带，为杂合突变体 Atvipp1(+/-)。
二、TuVIPP1在提高植物光合作用中的应用
通过转基因的方法以小麦TuVIPP1互补上述经过分子鉴定的拟南芥杂合突变体Atvipp1(+/-)，以验证TuVIPP1在叶绿体中的功能。
1、重组载体TuVIPP1OE-pCAMBIA1300的构建
pEASY-Blunt-TuVIPP1用NcoI和BamHI酶切，得到1013bp的TuVIPP1片段，将其与经过同样酶切的pFGC5941载体(Biovector，105801)骨架连接，得到重组载体，送去测序，该重组载体为将序列表中序列1所示的TuVIPP1插入pFGC5941载体的NcoI 和BamHI酶切位点间得到的载体，命名为TuVIPP1OE-pFGC5941质粒(图5)，如图5 所示，TuVIPP1OE-pFGC5941质粒中的TuVIPP1两端分别是pFGC5941自身的CaMV35S 启动子和OCS终止子。这一构建为最终构建TuVIPP1OE-pCAMBIA1300提供基础。
由于TuVIPP1OE-pFGC5941质粒上携带的筛选标记为BlpR，即除草剂Basta抗性，与所用的T-DNA插入突变体上所携带的筛选标记相同，无法用于后期转基因植株的筛选，故选用EcoRI和PstI酶切回收CaMV35S promoter-TuVIPP1OE-OCS teminator片段(序列3)，连入pCAMBIA1300的EcoRI，PstI位点，
具体如下：
用EcoRI和PstI酶切TuVIPP1OE-pFGC5941质粒，回收3207bp的酶切产物，与经过同样酶切的pCAMBIA1300载体(北京天恩泽，60908-1220)连接，得到重组载体，经过测序，该重组载体为将序列表中序列3所示的DNA分子插入pCAMBIA1300载体的 EcoRI和PstI酶切位点得到的载体，命名为TuVIPP1OE-pCAMBIA1300(图6)。
序列表中序列3所示的DNA分子包括启动子CaMV35S、基因TuVIPP1和终止子OCS，其中，启动子CaMV35S为序列表中序列3自5’末端第1-1427位核苷酸、基因TuVIPP1 为序列表中序列3自5’末端第1428-2429位核苷酸、终止子OCS为序列表中序列3 自5’末端第2430-3207位核苷酸。
上述酶切体系如下：
37℃酶切4小时，电泳，割胶回收，连接，连接体系如下：
所用内切酶与连接酶均为NEB公司产品，片段回收使用Axygen公司Axyprep DNAGel Extraction Kit(#AP-GX-50)。
2、转TuVIPP1拟南芥的获得
将重组载体TuVIPP1OE-pCAMBIA1300转入农杆菌GV3101中，得到重组菌 GV3101/TuVIPP1OE-pCAMBIA1300，用AtTuV1OE-f/AtTuV1OE-r引物进行菌落PCR验证，得到798bp的为阳性。
将阳性GV3101/TuVIPP1OE-pCAMBIA1300对突变体Atvipp1(+/-)进行浸花法转化，具体如下：
将拟南芥突变体Atvipp1(+/-)幼苗移栽到土壤中4周左右，在开始抽薹后，剪掉第一次的抽薹，使其长出更多的分支和花序，约6天后，剪去已开的花和荚果，进行农杆菌悬浮液浸染。挑取PCR鉴定为阳性的农杆菌单菌落接种250ml LB，摇菌培养至OD600至0.8，4000rpm离心15分钟收集菌体，倒掉上清，加入250ml渗透培养基重悬，用1ml移液器吸取悬浮液滴在拟南芥植株的花序上，确保浸染所有花序，完成后用黑色塑料袋覆盖植株，保持高湿黑暗16-24小时后转正常光照培养。
渗透培养基配方为：
1/2 MS
5％ sucrose
0.02％ silwet L-77(Sigma)
pH5.5-5.7
植株在光照培养箱培养8周后收种子，种子置37℃温箱彻底干燥后，在含30 μg/ml潮霉素B的MS平板上筛选转化子，在潮霉素MS平板上筛选出的抗性植株移至土中种植，为再生植株。
对再生植株提取RNA，反转录为cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：
AtTuV1OE-f：TTCGCATATCTTCTCGGCCC
AtTuV1OE-r：TCCCTGTCTCGAGGAGTAGC
得到798bp的为T1代转TuVIPP1拟南芥。
用上述AtVIPP1-f，AtVIPP1-r，pCSA110 LB3引物对T1代转TuVIPP1拟南芥进行基因型鉴定，每个株系分别用如下引物对扩增：
AtTuV1OE-f和AtTuV1OE-r，扩增798bp TuVIPP1基因；
AtVIPP1-f和AtVIPP1-r扩增669bp的野生型AtVIPP1条带；
AtVIPP1-r和pCSA110 LB3扩增525bp T-DNA插入片段；
株系有798bp与525bp，为(-/-)AtVIPP1基因型的纯合T1代转TuVIPP1拟南芥；
株系有798bp、669bp与525bp，为(+/-)AtVIPP1基因型的杂合T1代转TuVIPP1 拟南芥；
株系有798bp与669bp，为(+/+)AtVIPP1基因型的纯合T1代转TuVIPP1拟南芥。
结果如图7所示，每个株系从左到右：AtVIPP1-f和AtVIPP1-r扩增产物(检测野生型AtVIPP1是否存在)、AtVIPP1-r和pCSA110 LB3扩增产物(检测T-DNA插入)、 AtTuV1OE-f和AtTuV1OE-r扩增产物(检测转化TuVIPP1)，可见TV13，TV17，TV18 为(+/-)AtVIPP1基因型的杂合T1代转TuVIPP1拟南芥，TV14为(-/-)AtVIPP1基因型的纯合T1代转TuVIPP1拟南芥。
将(+/-)AtVIPP1基因型的杂合T1代转TuVIPP1拟南芥播种得到T2代转TuVIPP1 拟南芥TV18-6,TV18-10，TV13-11，TV13-13，TV27-1，TV27-5，TV27-9，用上述 AtVIPP1-f，AtVIPP1-r，pCSA110 LB3组成的3组引物对分别进行基因型鉴定，结果如图8所示，TV18-6、TV18-10、TV13-11、TV13-13、TV27-1、TV27-5、TV27-9均为 (-/-)AtVIPP1基因型的纯合T2代转TuVIPP1拟南芥。
3、转TuVIPP1拟南芥的表型鉴定
1)结实表型
将(-/-)AtVIPP1基因型的纯合的T2代转TuVIPP1拟南芥TV18-6、TV13-11、TV27-5与野生型拟南芥col-0播种生长。在萌发后5周观察，结果如图9所示，TV18-6、 TV13-11、TV27-5与野生型拟南芥表型一致，能够正常生长开花、结实，且为绿化苗；而前面鉴定的纯合突变体Atvipp1(-/-)不能开花且为白化性状；可见TuVIPP1可以互补AtVIPP1的功能。
2)透射电子显微镜观察转TuVIPP1拟南芥的内囊体结构
为确定TuVIPP1在内囊体结构生成中的作用，对突变体和转基因植株进行电镜切片观察。
取生长4周的(-/-)AtVIPP1基因型的纯合的T2代转TuVIPP1拟南芥TV18-6、纯合突变体Atvipp1(-/-)和野生型拟南芥Col-0叶片，2.5％戊二醛固定，1％锇酸染色，电镜样品制备与观察均在中国科学院微生物研究所电镜室投射电子显微镜平台进行，按投射电镜使用通则操作，经染色，包埋，负染，切片。
结果如图10-12所示，野生型Col-0叶绿体结构紧密，内部可见明显多层堆积的内囊体膜结构(图10)；纯合突变体Atvipp1(-/-)叶绿体结构松散，叶绿体膜向外膨胀呈气球状，内部放大未见内囊体膜结构(图11)；在纯合插入突变背景下的转TuVIPP1 拟南芥叶绿体恢复紧密结构，内部有明显的内囊体膜结构发生(图12)；说明TuVIPP1 通过引导内囊体生成互补Atvipp1插入突变的表型，TuVIPP1在内囊体生物发生过程中起关键作用。
Claims (7)
1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1)或2)所述的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的核苷酸；
2)编码区为序列表中序列3所示的核苷酸。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。
6.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在提高植物光合作用和/或促进植物开花和/或促进植物结实和/或促进植物产生内囊体膜结构和/或促进植物绿化中的应用。
7.一种培育开花和/或结实的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：
1)将权利要求2或3所述的DNA分子转入杂合突变体Atvipp1(+/-)拟南芥中，得到转基因拟南芥；
2)将转基因拟南芥和杂合突变体Atvipp1(+/-)播种培育后代，选取转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代；
所述转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代具有如下A-C中至少一种表型：
A、所述转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代为绿化植物；
B、所述转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代能开花和/或结实；
C、所述转基因拟南芥Atvipp1(-/-)基因型的后代产生内囊体膜结构。
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