CN104513825A - 一种小麦耐盐基因TaNAS1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦耐盐基因 TaNAS1 ，该基因的核苷酸序列的全长如SEQ ID NO:1所示，该基因的cDNA和gDNA的编码序列如SEQ ID NO:1中第52位至第1053位所示；本发明还公开了所述基因 TaNAS1 以及表达载体在培育耐盐植物特别是拟南芥中的应用。本发明利用现有的植物基因工程技术，首次克隆得到了小麦耐盐基因 TaNAS1 ，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，该转基因拟南芥植株具有较强的耐盐能力，这为农作物耐盐新品种的研究和培育提供了良好的遗传材料。

Description

一种小麦耐盐基因TaNAS1及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体地说是一种小麦耐盐基因TaNAS1及其应用。

背景技术

土壤盐渍化是人类面临的生态危机之一，土壤的盐渍化问题日益威胁着人类赖以生存的有限的土地资源，盐胁迫已经成为全世界范围内影响农业生产的最重要的环境胁迫因子。因此，如何提高植物的耐盐性成为农业育种人员的重要研究课题；分离克隆耐盐基因、培育耐盐新品种和提高农作物的耐盐性能已经成为现代作物育种研究工作的关键技术。小麦是世界上最重要的粮食作物之一，种植面积、总产量及总贸易额均居粮食作物之首。克隆小麦耐盐基因、利用转基因改良植物技术将耐盐基因转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因小麦新品种并用于在盐碱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。

近年来，科学家们利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转化和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力得到提高。因此，克隆小麦耐盐基因并将其转化和应用，在获得耐盐高产小麦新品种的研究中具有极其重要的意义。目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的基因，但有关NAS类基因在植物耐盐过程中的作用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种首次从小麦中分离出的耐盐基因TaNAS1，将该基因连接到表达载体pCAMBIA1300上，利用农杆菌浸染法转入拟南芥中，获得了生长发育较好、耐盐性能较高的转基因拟南芥，为农作物耐盐新品种的研究和培育提供了基础资源。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种小麦耐盐基因TaNAS1，该基因具有如SEQ ID NO : 1所示的核苷酸序列，分子量大小为1120 bp；

或其cDNA的编码序列具有如SEQ ID NO : 1中第52至第1053位所述的核苷酸序列；

或其gDNA的编码序列具有如SEQ ID NO : 1中第52至第1053位所述的核苷酸序列。

本发明克隆所述TaNAS1基因的上游引物NAS1-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示、下游引物NAS1-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示。

本发明所述的小麦耐盐基因TaNAS1位于小麦4D染色体上。

由上述的小麦耐盐基因TaNAS1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示。

本发明还同时提供了一种重组质粒，所述质粒为插入了如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列或含有SEQ ID No.1所述序列的pCAMBIA1300载体，该重组质粒为pCAMBIA1300-TaNAS1。此外，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以用于本发明，本发明优选pCAMBIA1300作为载体。

本发明提供的小麦耐盐基因TaNAS1在提高植物耐盐性中的应用。其中所述植物为普通小麦或拟南芥。本发明所述的基因可广泛用于选育耐盐农作物新品种。

将本发明所述基因TaNAS1导入植物拟南芥细胞，植物拟南芥就可以获得耐盐的能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaNAS1的植物表达载体pCAMBIA1300- TaNAS1进行加工，如可以加入选择标记（GUS等）或者具有抗性的抗生素标记物（潮霉素、卡那霉素或庆大霉素等）等。

本发明所用科农9204为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定；2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037。

本发明利用现有的植物基因工程技术，首次克隆得到了小麦耐盐基因TaNAS1，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，该转基因拟南芥植株具有较强的耐盐能力，这为农作物耐盐新品种的研究和培育提供了良好的遗传材料。

附图说明

图1为小麦基因TaNAS1的cDNA序列及gDNA序列的扩增结果。M为DNA MarkerIII（天根生化科技有限公司，北京）。

图2为小麦基因TaNAS利用中国春缺体-四体的定位结果。

图3为转TaNAS基因拟南芥阳性植株的分子检测结果。

图4为盐胁迫下转TaNAS基因拟南芥株系种子萌发及生长图。

图5为盐胁迫下转TaNAS基因拟南芥株系种子发芽率状况图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1 克隆基因TaNAS1的cDNA

1、提取小麦Total RNA

（1）将科农9204的组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

（2）待液氮挥发干，立即转移到2ml 的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen 公司的Trizol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使其充分裂解，室温放置5分钟；

（3）加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；在4℃下，12000 rpm离心15分钟；

（4）小心吸出上层水相，加入到干净的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(上层水相与异丙醇的体积比为1:1)，充分混匀，在-20℃下，沉淀30 min；在4℃下，12000 rpm离心10 min，小心弃去上清液，留沉淀；

（5）将沉淀用1 ml的75% 乙醇洗涤，在4℃下，8000 rpm离心10 min，收集RNA沉淀；

（6）用75%的乙醇洗涤一次RNA沉淀；

（7）去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，当RNA略显透明，加入50 μl的RNase-free水充分溶解，可放于-80℃下长期保存，备用；

（8）用紫外分光光度计及质量浓度为1%的Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

2、cDNA反转录

按照RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0试剂盒(TaKaRa,DRR019A)的说明书进行；首先进行第一步反转录反应，以500 ng RNA为模板进行反转录，按照所述说明书指示在反应体系中依次加入由MgCl₂、10×RT buffer、RNase Free dH₂O、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase、Oligo dT Primer和Total RNA组成的反应体系共10 μL。反应程序为：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。

3、克隆和序列测定

（1）以cDNA为模板，在5’UTR和3’UTR设计基因特异引物，引物序列分别为：

NAS1-F1：5’-GCTCTAGACTCCATCAGCCACTCTCCAC-3’（如SEQ ID NO : 3所示），

NAS1-R1：5’-CGGGATCCGCAGGCGATCAAGCAGCTAG-3’（如SEQ ID NO : 4所示）；

（2）PCR反应体系(共20 μL)：

2×Taq PCR MasterMix               10 μL

Primer NAS1-F1                    0.5 μL

Primer NAS1-R1                    0.5 μL

Template cDNA                     1 μL

ddH₂O                            8 μL

（3）PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 sec，58℃退火30 sec， 72℃延伸1 min15s，30循环/min；72℃延伸7 min；20℃保存，扩增得到的特异扩增条带（见图1）；

回收PCR产物连接pEASY-Blunt cloning vector（全式金生物技术有限公司）进行测序，扩增得到的PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID NO : 1，其分子量大小为1120 bp，其起始密码子到终止密码子的大小为1002 bp，该PCR产物的基因命名为TaNAS1，基因TaNAS1编码的蛋白为TaNAS1，编码该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示。

实施例2 TaNAS1基因组gDNA全长克隆

（1）gDNA提取：按照植物gDNA提取试剂盒说明书(天根生化科技有限公司，北京)方法提取科农9204小麦gDNA。

（2）以科农9204gDNA为模板，在5’UTR和3’UTR设计基因特异引物，

NAS1-F1       5’-GCTCTAGACTCCATCAGCCACTCTCCAC-3’；

NAS1-R1      5’-CGGGATCCGCAGGCGATCAAGCAGCTAG-3’；

进行PCR扩增，扩增条件同实例1扩增cDNA的操作步骤。将得到的特异扩增条带（见图1），连接pEASY-Blunt cloning vector并测序，得到了TaNAS1在科农9204中的全长gDNA序列，序列大小为1120bp，从起始密码子到终止密码子大小为1002 bp。

由于实施例中cDNA的开放阅读框大小为1002 bp，其gDNA从起始密码子到终止密码子的大小亦为1002 bp，可见，TaNAS1基因的结构中无内含子，其cDNA和gDNA的编码序列相同，均如SEQ ID NO : 1中第52位到第1053位共1002bp所述的核苷酸序列，自5’端的第52至54位核苷酸为起始密码子ATG，自5’端的第1053至1055位核苷酸为终止密码子TGA。

实施例3 TaNAS1基因在小麦染色体4D上的定位

（1）中国春缺体-四体系gDNA提取：提取方法同实例2中步骤（1）所述。

以1 μL中国春缺体-四体系DNA作为模板，通过PCR对TaNAS1基因进行染色体定位，扩增引物和PCR条件同实例1中3的步骤（1）和（2）。

根据内参Actin的扩增情况作为中国春的缺体-四体系材料扩增的阳性对照。

引物序列为： 

actin-F  5’-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’，

actin-R  5’-GAACTTCCACTGAGAACAACATTACC-3’；

以一套普通小麦品种中国春的缺体-四体系材料的gDNA为模板，用TaNAS1特异引物进行PCR扩增，对基因进行染色体定位，结果显示，TaNAS1除在缺失染色体4D的缺体-四体系中无特异条带外，在其余缺体-四体系中均可扩增出很亮的特异条带，因此，TaNAS在缺失染色体4D的缺体-四体系中1 Kb特异扩增该条带缺失，从而将该基因定位于小麦4D染色体上，扩增条带图谱如图2所示。

实施例4 重组质粒pCAMBIA1300- TaNAS1的获得

（1）用限制性内切酶Xba I和Bam HI对由实例1得到的1120bp的PCR产物（TaNAS1基因）进行双酶切，其双酶切体系为XbaⅠ1ul，BamHⅠ1ul，10×bufferK 1ul，PCR产物 5ul，ddH₂O 12ul），得TaNAS1基因的酶切产物；

（2）用内切酶Xba I和Bam HI对质粒pCAMBIA1300双酶切，其双酶切体系：XbaⅠ1ul，BamHⅠ1ul，10×bufferK 1ul，质粒5ul，ddH₂O 12ul，获得pCAMBIA1300的酶切产物；

（3）分别将TaNAS1基因的酶切产物和载体用限制性内切酶在37℃下酶切3-5 h，之后65℃ 20 min使限制性内切酶失活。将目的片段TaNAS1基因的酶切产物与载体pCAMBIA1300的酶切产物按8：1的摩尔比，同时加入1 μL T4 DNA ligase和2 μL 10×T4 DNA ligase buffer，加水至20 μL；4℃过夜连接；获得重组质粒pCAMBIA1300- TaNAS1，后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（天根生化科技有限公司，北京），鉴定重组质粒后即得到带有目的基因的双源表达载体。

（4）重组质粒的鉴定：用菌落PCR法筛选有插入片段的克隆，具体操作如下：

A. 挑取转化后白色菌落在平板上划短线，37℃培养至菌线可见时，即可进行菌落PCR反应。

B. 用牙签刮取少量的菌体转入20 μl 含适当引物的PCR体系中，进行PCR反应。PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 10 μL , NAS1-F1 1 μL, NAS1-R1 1μl, 菌体，ddH₂O 8 μL ，PCR反应程序： PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸1 min15s，30循环/min；72℃延伸7 min；20℃保存；

C. PCR产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有1120bp分子量大小的片段，验证载体为正确的构建，鉴定重组质粒后即得到带有目的基因的植物表达载体。

将重组质粒送去测序，结果为该质粒为将SEQ ID NO : 1所述的自5’末端第1-1120位核苷酸插入pCAMBIA1300的XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，如此得到的载体我重组质粒，该重组质粒命名为pCAMBIA1300- TaNAS1。

实施例5 将重组质粒转入农杆菌GV3101感受态

（1）培养农杆菌GV3101：挑取农杆菌单菌落接种于3 mL YEB(60 mg/L rif)液体培养基中，28℃摇培过夜。取500 μL接种于50 mL YEB(60 mg/L rif)液体培养基中，28℃摇培至OD600为0.6；将菌液转入50 mL离心管中，冰浴30 min；4℃，5000g，离心5 min；弃上清，沉淀用10 mL 0.15 mol/L的NaCl重悬；4℃，5000g，离心5 min；弃上清，沉淀用1 mL 20 mmol/L的CaCl₂重悬；每管100 μL/管分装；液氮冷冻5 min；-70℃保存。

（2）重组质粒的转入：将10 μL实施例4制备的重组质粒pCAMBIA1300- TaNAS1加入100 μL农杆菌GV3101感受态中，混匀；依次冰浴30 min，液氮冷冻3-5 min，37℃水浴5 min；加入1 mL YEB液体培养基，28℃缓慢摇培2-4 h；4℃，5000 rpm，离心5 min；弃部分上清，剩余上清重悬菌体后涂于YEB（60 mg/L rif）固体培养基上，28℃培养2-3天。

（3）菌体PCR鉴定，挑阳性克隆得到重组农杆菌，其具体鉴定步骤同实例4中步骤（4）所述。

实施例6 转基因拟南芥的筛选及获得

（1）拟南芥的种植：将野生型拟南芥种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括质量浓度为7.5%的次氯酸钠和质量浓度为0.01%的Triton-X 100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5-6次，点播于MS平板上，于4℃春化2-3天；然后移植到营养钵中（营养土与蛭石的体积比为1:1），23°C培养，16/8 h光周期，光强30-40μmolm^-2 s^-1；待植株开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展；在剪枝后的4-6天内，进行转化；

（2）转化：于试管中YEB液体培养基摇培重组农杆菌，28℃过夜。按1:100的比例将过夜摇培的重组农杆菌扩培于100 mL YEB液体培养基中，至OD600约为1.0；室温，5500g，离心10 min集菌；将菌体重悬于转化介质中，调OD600约为0.8；将含有重组农杆菌的转化介质倒入适当容器中，将选择好的拟南芥倒置其上（转化前将角果及已完全开放的花蕾剪去，仅留下刚刚露白及幼嫩的花蕾），浸泡5 min；取出拟南芥，侧卧放在干净的塑料盆中，并用黑色薄膜覆盖避光保湿恢复培养16-24小时；揭开薄膜，将拟南芥置于光下，正常培养；

（3）阳性植株的筛选：T₀代种子用质量浓度为7.5%的次氯酸钠溶液（包括7.5%的次氯酸钠和0.01% Triton-X100）消毒后，点播在MS选择培养板(25 mg/L潮霉素)上；于4℃下春化2-3天；移入培养室中培养；培养10天，挑选潮霉素抗性植株（长出真叶1-2对，根伸长至培养基中）并移栽到营养钵中；培养直至种子成熟；同样方法筛选T₁代种子得到T₂代植株；并在T₂代植物中挑选抗性比为3:1的单拷贝插入独立株系，并获得纯合T₃代株系OE1、OE2和OE4；

（4）转TaNAS1基因的拟南芥分子检测：对上述获得的OE1、OE2和OE4进行转基因拟南芥的分子检测，以转化株系的gDNA为模板，使用基因特异引物进行基因组PCR，鉴定阳性克隆，其扩增引物和PCR条件同实例1中3的步骤（1）和（2）；结果见图3。

（6）从图3中阴性为哥伦比亚野生型拟南芥基因组为模板的阴性对照；OE1、OE2和OE4分别表示三个转基因株系。数据表明转基因株系OE1、OE2和OE 4和阳性对照扩增出了目标大小条带，而阴性对照没有扩增出条带。

实施例7 转化植株耐盐性鉴定

将野生型拟南芥WT和T₃代单拷贝纯合拟南芥株系OE1、OE2和OE 4的种子用7.5%次氯酸钠溶液（包括质量浓度为7.5%的次氯酸钠和质量浓度为0.01%的Triton-X 100）消毒15分钟，然后用无菌水漂洗5-6次，点播于含200mmol/L的NaCl的MS平板上，于4℃春化2-3天，23℃培养，16/8h光周期，光强30-40μmolm^-2 s^-1；以同样条件无盐胁迫为空白对照，观察植株生长情况。植株长势情况结果见图4。图中4a表示空白对照种子萌发的状况，4b表示在200 mmol/L的NaCl盐胁迫下转基因拟南芥株系OE1、OE2和OE4与野生型拟南芥（WT），从图中的对比可以明显看出转入小麦耐盐基因TaNAS1的拟南芥生长明显具有很强的耐盐性能。

对空白对照及盐胁迫下野生型（WT）和转基因拟南芥OE1、OE2和OE 4种子萌发率做统计，其萌发率以种子露出小白芽为依据，培养15天后统计，统计结果如图5，从数据结果显示转TaNAS1基因拟南芥植株在含盐培养基中的萌发率显著高于野生型，表明转TaNAS1基因的转基因拟南芥的耐盐能力明显增加。

Claims (7)

1.一种小麦耐盐基因TaNAS1，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。

2.一种小麦耐盐基因TaNAS1，该基因的cDNA和gDNA的编码序列如SEQ ID NO : 1中第52位至第1053位所述的核苷酸序列。

3.一种由权利要求1所述的小麦耐盐基因TaNAS1编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO : 2。

4.根据权利要求1所述的小麦耐盐基因TaNAS1，其特征是，克隆所述TaNAS1基因的上游引物NAS1-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示、下游引物NAS1-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示。

5.根据权利要求1所述的小麦耐盐基因TaNAS1，其特征是，所述基因位于小麦4D染色体上。

6.一种重组质粒，插入了如权利要求1所述SEQ ID No:1的核苷酸序列或含有SEQ ID No:1所述核苷酸序列的pCAMBIA1300载体。

7.一种小麦耐盐基因TaNAS1在提高植物拟南芥耐盐性中的应用。