CN101955521B - 植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为MtCAS31，来源于截型苜蓿A17(Medicago truncatula)，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明筛选到一个脱水素基因MtCAS31对于培育耐盐、耐干旱的转基因豆科作物具有重要价值。

Description

植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

环境中生物因素和非生物因素严重制约着植物的生长发育，其中高盐、干旱、低温、臭氧、辐射及重金属等非生物胁迫已成为主要的影响因素，这些非生物胁迫造成粮食作物减产量高达50％。植物通过长期的进化，形成了一系列完善的逆境胁迫应答机制，包括细胞水平的耐受和植株整体水平的协同应答。

脱水素(dehydrin)是植物的一种晚期发育丰富蛋白(Late embroygenesisabundant protein，LEA)。在植物种子成熟晚期大量存在。国内外的各种实验已证明脱水素蛋白参与了植物抗逆的过程。有科学家将小麦脱水素基因DHN5转入到拟南芥中，转基因植株的抗逆性大大增加。此实验说明脱水素蛋白直接参与到了植物抗逆的过程中。在提高作物对环境胁迫的分子育种中，在将脱水素蛋白导入到植物体内可以直接提高植物的抗逆性。

由于具有基因组小、染色体数为2×8(2n＝16)、生长期短、自花授粉、根瘤固氮、遗传转化效率高、与豆科主要作物亲缘关系较近等特点，截型苜蓿被选作豆科模式植物。研究表明，非生物胁迫(比如盐胁迫)会影响植物的结瘤，从而影响固氮，因此截型苜蓿的有些脱水素蛋白可能同时参与非生物胁迫和结瘤，这一点与拟南芥存在很大差异。基于以上特点，截型苜蓿成为研究豆科植物的热点。

目前的研究尽管获得了许多耐逆相关基因，但是，这些基因大多来自拟南芥、烟草等模式生物。由于在种属差异，拟南芥的耐逆基因转化其他植物，可能因为没有相应的信号传递通路，而不能提高转基因植物的抗盐能力。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白质，命名为MtCAS31，来源于截型苜蓿A17(Medicagotruncatula)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

上述序列2由312个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。

所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第40-978位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述与植物耐逆性相关蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述与植物耐逆性相关蛋白质的DNA分子。

序列表中的序列1，由986个核苷酸组成，编码区为序列1的自5’末端的第40-978位核苷酸，自5’末端的第1-10位核苷酸是BglII酶切位点和保护碱基，第13-39位核苷酸是MYC标签序列，第979-986位核苷酸是BglII的酶切位点及保护碱基。

含有所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。

所述重组表达载体为将所述的编码基因插入载体pCAMBIA1302的BglII酶切位点之间得到的重组表达载体。

扩增所述的编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的方法是将所述的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

所述编码基因是通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥，如columbia生态型拟南芥。

本发明的实验证明，本发明从豆科模式植物截型苜蓿中筛选到一个脱水素基因MtCAS31，通过农杆菌转化法将MtCAS31导入拟南芥，经过潮霉素初筛、分子检测、萌发期盐胁迫和后期干旱胁迫等手段，筛选到抗盐和抗干旱能力显著提高的转基因拟南芥株系。本发明对于培育耐盐、耐干旱的转基因豆科作物具有重要价值。

附图说明

图1为载体pCAMBIA1302-MtCAS31构建流程图

图2为T₂代转基因拟南芥的分子水平检测

图3为T₃代转基因拟南芥180mM NaCl胁迫下的萌发率统计图

图4为T₃代转基因拟南芥15％(质量百分含量)PEG-8000胁迫下的萌发率统计图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

截型苜蓿A17(Medicago truncatula A17)：由自法国INRA BRC-MTR(BiologicalResource Centre for the model species Medicago truncatula L.)赠予。(该种子向公众免费赠予。)

columbia生态型拟南芥(哥伦比亚生态型拟南芥(columbia stain of Arabidopsisthaliana as genetic background)：购自salk公司。

农杆菌EHA105记载在抗生素抑制农杆菌的效果及对条斑紫菜生长发育的影响，王萍等，水产科学，2009，28(7)，中，公众可以从中国农业大学获得。

实施例1、MtCAS31基因的克隆

1、设计特异性引物对(MtCAS31_5’和MtCAS31_3’)，由Invitrogen公司合成。

MtCAS31_5’：5’-TAAGATCTGGAACAGAAGTTGATTTCCGAAGAAGACCTCATGTCTCAATATCAACAAGG-3’(序列3)；

MtCAS31_3’：5’-GAAGATCTCTAGTGTCCTTGTCCATGTCCAG-3’(序列4)。

2、提取截型苜蓿A17(Medicago truncatula)整株植物的RNA，反转录为cDNA；

3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1的特异性引物对MtCAS31_5’和MtCAS31_3’进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

4、将步骤3的PCR扩增产物进行测序。

测序结果为，该PCR产物的基因的序列为序列表中的序列1，序列1由986个核苷酸组成，编码区为序列1的自5’末端的第40-978位核苷酸，自5’末端的第1-10位核苷酸是BglII酶切位点和保护碱基，第13-39位核苷酸是MYC标签序列，第979-986位核苷酸是BglII的酶切位点及保护碱基。将该基因命名为MtCAS31，该基因编码的蛋白命名为MtCAS31，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2所示，序列2由312个氨基酸残基组成。

5、将上述PCR产物插入pMD18 T-simple载体(购自TaKaRa生物工程公司)，得到载体pMD18T-simple-MtCAS31，测序，结果为载体pMD18T-simple-MtCAS31为将序列表中的序列1插入pMD18T-simple载体得到的载体。

实施例2、转基因拟南芥的获得和功能研究

一、转基因拟南芥的获得

1、重组载体(pCAMBIA1302-MtCAS31)的构建

构建过程如图1所示。

(1)用限制性内切酶BglII单酶切载体pMD18T-simple-MtCAS31，回收小片段。

(2)用限制性内切酶BglII单酶切pCAMBIA1302(购自Center for theApplication of Molecular Biology to International Agriclture，www.cambia.org)，回收载体骨架。

(3)将步骤(1)的小片段与步骤(2)的载体骨架连接，得到连接产物，将该连接产物转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pCAMBIA1302的BglII酶切位点之间得到的重组载体，将该质粒命名为pCAMBIA1302-MtCAS31。

2、转基因拟南芥的获得

(1)农杆菌感受态细胞的制备

挑取农杆菌EHA105单菌落接种于100mlYEB液体培养基中，220rpm、28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0.15M的CaCl₂水溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃、5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含10％甘油(体积百分含量)和0.15M CaCl₂的水溶液，轻轻悬浮；得到农杆菌悬浮液(EHA105感受态细胞)，分装于无菌eppendorf管中，每管200μl，于液氮中速冻1min，冻存于-70℃。

(2)pCAMBIA1302-MtCAS31转化农杆菌EHA105

取1μg上述得到的pCAMBIA1302-MtCAS31加入200μl EHA105感受态细胞中，混匀，静止5min；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml YEB液体培养基，28℃、150rpm振荡培养4h；5000rpm离心3min，弃上清，加入0.1ml YEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50μg/ml卡那霉素和50p g/ml利福平的YEB固体平板上，28℃培养约48h，得到转化子。将转化子进行菌液PCR鉴定，鉴定所用引物如下：

5’引物：5’-ATGTCTCAATATCAACAAGG-3’；

3’引物：5’-CTAGTGTCCTTGTCCATGTCCAG-3’。

结果显示得到约980bp的片段，证明pCAMBIA1302-MtCAS31已经成功转入EHA105中。再将PCR鉴定阳性的转化子提取质粒，送去测序，结果为该质粒为pCAMBIA1302-MtCAS31，进一步证明，将载体pCAMBIA1302-MtCAS31已经成功转入EHA105中，将含有pCAMBIA1302-MtCAS31的转化子命名为重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1302-MtCAS31。

(3)转化拟南芥

①将重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1302-MtCAS31接种于10ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养过夜；

②转化前一天以1∶50比例(体积比)接种于200ml含相同抗生素的YEB培养基中，扩大培养至OD600为1.2-1.6，5,000rpm、15min离心集菌，重悬于渗入缓冲液(由蔗糖、表面活性剂L-77和水组成；蔗糖的质量百分含量为5％蔗糖，L-77的体积百分含量为0.05％)，使OD600为0.8，即为重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1302-MtCAS31菌液；

③采用Foral dip法将农杆菌转化花蕾期的拟南芥：在columbia生态型拟南芥(columbia stain of Arabidopsis thaliana as genetic background)抽苔4-5cm时剪去顶端花序，使腋生花序生长，剪时伤口应位于最高的茎生叶上方，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透且将大的花蕾去掉，只保留未开放的小花蕾；转化时将拟南芥整株与花盆一起倒扣在盛有200ml重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1302-MtCAS31菌液的容器中浸泡2-3min，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代转MtCAS31拟南芥种子。

(4)转基因拟南芥的筛选和分子鉴定

①转基因拟南芥的筛选

T₁代转MtCAS31拟南芥种子播种于含80mg/L潮霉素的MS固体平板上，4℃春化3天，置22℃光照培养箱中培养7天，转化体表现为真叶呈深绿色，根深长至培养基中，将转化体移至不含抗生素的MS培养基中，6天后将绿色的幼苗转到土壤中繁种，收获的种子即为T₂代转MtCAS31拟南芥种子。

②DNA水平检测

将T₂代转MtCAS31拟南芥种子培育成植株，提取T₂代转MtCAS31拟南芥株系的基因组DNA为模板，以质粒p1302-MtCAS31为阳性对照，columbia生态型拟南芥(野生型)的基因组DNA为阴性对照，用如下引物进行PCR扩增：

5’引物：5’-ATGTCTCAATATCAACAAGG-3’；

3’引物：5’-CTAGTGTCCTTGTCCATGTCCAG-3’。

PCR体系(25.0μl)：10×Ex Taq PCR Buffer 2.5μl，dNTP(25mM)2.0μl，5’引物(5pmol/μl)1.0μl，3’引物(5pmol/μl)1.0μl，ExTaq酶(5U/μl)1.0μl，模板(1μg/μl)1.0μl，ddH₂O 16.5μl。

PCR程序为：第一轮：94℃变性5min；第二轮：94℃变性50sec，52℃复性50sec，72℃延伸1min，30个循环；第三轮：72℃延伸10min。

反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图2(a)所示，(a)为PCR扩增产物电泳图，3为1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp，1为阳性对照，2为阴性对照，4-6和8-13为PCR阳性植株，7为PCR阴性植株；可以看出，能扩增出MtCAS31基因特异条带(约939bp)的植株为PCR鉴定阳性T₂代转MtCAS31拟南芥植株，得到11个PCR鉴定阳性T₂代转MtCAS31拟南芥植株，其中两个株系命名为L3株系(T₂代转MtCAS31拟南芥)和L11株系(T₂代转MtCAS31拟南芥)。

③RNA水平检测

为了检测PCR鉴定阳性植株中MtCAS31基因是否得到转录，进行RT-PCR检测。Actin2为参比，检测Actin2基因的引物对如下：

5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；

5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。

a.Trizol法分别提取野生型、L3株系(T₂代转MtCAS31拟南芥)植株和L11株系(T₂代转MtCAS31拟南芥)植株的总RNA；

b.以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶(购自Promage公司)反转录RNA为cDNA；反转录反应体系(15.0μl)：RNA(1.0μg/μl)2.0μl，Oligd T2.0μl，RNA free H₂O至15.0μl；将上述混合物混匀后，短暂离心将之收集于管底，70℃温育5min，再立即置于冰上5min，再加入以下成分：5×M-MLV Buffer 5.0μl，dNTP1.5μl，RRI(40U/μl)0.65μl，RTase M-MLV(200U/μl)1.0μl，H₂O 1.85μl；将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，在42℃温育60min，70℃反应15min，取出置于冰上，离心后储存于-20℃。

c.以0.5μl反转录产物为模板进行PCR扩增，PCR体系及程序与步骤b相同。

反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图2(b)，(b)为阳性植株的RT-PCR扩增产物电泳图，可以看出，能扩增出MtCAS31基因特异条带(约939bp)的植株为RT-PCR阳性T₂代转MtCAS31拟南芥植株，进一步看出L3株系和L11株系确实为阳性T₂代转MtCAS31拟南芥植株。

将L3株系进行自交，得到T₃代种子，将其培育为T₃代转MtCAS31拟南芥植株L3。将L11株系进行自交，得到T₃代种子，将其培育为T₃代转MtCAS31拟南芥植株L11。

采用同样的方法将空载体pCAMBIA1302转入columbia生态型拟南芥(野生型)中，得到T₃代转空载体对照拟南芥。提取基因组作为模板，以5’引物和3’引物作模板，进行PCR鉴定，结果为没有目的基因MtCAS31。

二、转基因拟南芥的耐逆性鉴定

分别将columbia生态型拟南芥(WT)种子、L3株系拟南芥(T₃代转MtCAS31拟南芥种子)、L11株系拟南芥(T₃代转MtCAS31拟南芥种子)和转空载体对照拟南芥(T₃代转空载体拟南芥种子)进行盐胁迫实验和干旱胁迫实验，每个株系90粒种子。

1、盐胁迫实验

将各个株系的拟南芥种子分别种于含有180mM NaCl的MS培养基上，4℃春化72hr，光照培养7天，每天光照时间为16小时，光照强度为100μmol m^-2s^-1，进行萌发率计算(以根长1mm为萌发标准)。统计结果如图3所示，可以看出，columbia生态型拟南芥种子的萌发率是14.64％，L3种子的萌发率为38.18％，L11种子的萌发率为50.00％，转空载体对照拟南芥种子的萌发率与columbia生态型拟南芥结果无显著差异。L3拟南芥和L11拟南芥种子的萌发率显著高于columbia生态型拟南芥和转空载体对照拟南芥，表明MtCAS31基因增加了拟南芥的抗盐能力。

2、干旱胁迫实验

在培养基中添加PEG-8000可以模拟干旱胁迫。将拟南芥种子种于含有15％(质量百分含量)PEG-8000(Amresco，cas：25322-68-3)的MS培养基上，4℃春化72hr，光照培养7天，每天光照时间为16小时，进行萌发率计算(以根长1mm为萌发标准)。统计结果如图4所示，可以看出，columbia生态型拟南芥种子的萌发率是54.55％，L3种子的萌发率为72.41％，L11种子的萌发率为86.11％，转空载体对照拟南芥种子的萌发率与columbia生态型拟南芥结果无显著差异。L3拟南芥和L11拟南芥种子的萌发率显著高于columbia生态型拟南芥和转空载体对照拟南芥，表明MtCAS31基因增加了拟南芥的抗旱能力。

Claims (2)

1.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；

所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因如下1)或2)所示的基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第40-978位核苷酸所示的DNA分子。

Images