CN102146128B - 植物耐逆性相关蛋白MtMYB1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白MtMYB1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为MtMYB1，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明筛选到的一个盐诱导后表达量显著上调的转录因子MtMYB1，将该基因导入经济作物苜蓿等豆科作物将对培育耐盐耐干旱的转基因豆科作物有重要价值。

Description

植物耐逆性相关蛋白MtMYB1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种植物耐逆性相关蛋白MtMYB1及其编码基因和应用。

背景技术

在非生物胁迫条件下，高等植物细胞会积极地调动体内的防卫系统，从感知到信号传导，到信号传递到细胞核的转录因子，转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达，合成新的蛋白、代谢发生转变，抗逆性渗透调节物质积累等变化，最终达到提高植物抗逆性的目的。环境中生物因素和非生物因素严重制约着植物的生长发育，其中高盐、干旱、低温、臭氧、辐射及重金属等非生物胁迫已成为主要的影响因素，这些非生物胁迫造成粮食作物减产量高达50％。植物通过长期的进化，形成了一系列完善的逆境胁迫应答机制，包括细胞水平的耐受和植株整体水平的协同应答。刺激信号由细胞膜上的受体感知，激活PLC，水解PIP2产生IP3和DAG。细胞质中Ca⁺浓度上调，将信号被Ca⁺受体感知。Ca⁺受体激活下游蛋白激酶、蛋白磷酸酶，通过磷酸化和去磷酸化调节转录因子的表达，或直接激活转录因子表达。一个转录因子能调控下游多个同源响应基因，进一步调节效应蛋白的功能。通过逆境信号传递通路的一系列级联反应，把刺激信号不断传递和放大，最终做出应答反应。

由于具有基因组小、染色体数为2×8(2n＝16)、生长期短、自花授粉、根瘤固氮、遗传转化效率高、与豆科主要作物亲缘关系较近等特点，截型苜蓿被选作豆科模式植物，成为研究豆科植物的热点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白质，命名为MtMYB1，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。

上述序列2由272个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码所述蛋白的基因也是本发明保护的范围。

所述基因为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由819个核苷酸组成，其中1-819位核苷酸为编码区，第817-819位是终止密码子。

含有所述基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。

所述重组表达载体为将所述的基因插入载体pCAMBIA1302的Nco I和Spe I酶切位点之间得到的载体。

扩增所述的基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆的转基因植物的方法。

本发明提供的方法是将所述的基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

所述编码基因是通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥，如columbia生态型拟南芥。

本发明的实验证明，本发明筛选到的一个盐诱导后表达量显著上调的转录因子MtMYB1，将该基因导入拟南芥，经过潮霉素初筛、分子检测、盐胁迫和干旱胁迫等手段，筛选到抗盐和抗干旱能力提高的转基因拟南芥株系，将该基因导入经济作物苜蓿等豆科作物将对培育耐盐耐干旱的转基因豆科作物有重要价值。

附图说明

图1为MtMYB1在酵母中的转录活性分析

图2为MtMYB1在洋葱表皮中的亚细胞定位分析

图3为载体pCAMBIA1302-MtMYB1构建流程图

图4为T₁代转基因拟南芥的分子水平检测

图5为T₃代转基因拟南芥的分子水平检测

图6为T₃代转基因拟南芥NaCl胁迫下的萌发率统计图

图7为T₃代转基因拟南芥生长后期干旱胁迫下的存活率统计图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

截型苜蓿(Medicago truncatula)A17：购自法国INRA BRC-MTR：BiologicalResource Centre for the model species Medicago truncatula L.。

拟南芥(Arabidopsis thaliana，columbia-o生态型，以下称为野生型拟南芥。)：购自salk公司。

农杆菌EHA105记载在抗生素抑制农杆菌的效果及对条斑紫菜生长发育的影响，王萍等，水产科学，200928(7)，中，公众可从中国农业大学获得。

实施例1、MtMYB1基因的克隆

1、MtMYB1基因的获得

在盐胁迫截型苜蓿A17后的芯片筛选中发现这一表达量显著上调的基因，为了研究这一基因在非生物胁迫中的功能，截型苜蓿A17的4周龄苗浇250mMNaCL水溶液一小时，提取RNA，反转录得到cDNA，以截型苜蓿A17的cDNA为模板，以MtMYB1_5’和MtMYB1_3’为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，将PCR产物插入pMD18T-simple载体(购自TaKaRa生物工程公司)，得到重组载体，测序结果表明，该PCR产物具有序列表中序列1的核苷酸，该PCR产物的基因命名为MtMYB1，该基因的编码区为序列表中序列1自5’端第1-819位所示的核苷酸，该基因编码的蛋白命名为MtMYB1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，将含有该基因的重组载体命名为pMD18T-simple-MtMYB1。

由Invitrogen公司合成特异性引物对：

MtMYB1_5’：5’-ATGGCAAGAACTCCTTCTTGTGACAAAAAA-3’(序列3)；

MtMYB1_3’：5’-TCAACTCCAAATATCCTTGTCATATACTAT-3’(序列4)。

也可人工合成序列1，采用相同的方法构建得到pMD18T-simple-MtMYB1。

2、酵母系统中MtMYB1的转录活性分析

以pMD18T-simple-MtMYB1为模板，用分别含有EcoR I和Sal I酶切位点的引物5’-GAATTCATGGCAAGAACTCCTTCTTG与3’-GTCGACTCAACTCCAAATATCCTTGT进行PCR扩增，得到PCR产物。将该PCR产物经EcoR I和Sal I酶切，回收片段，与经过同样酶切的载体pBDGAL4(Liao Y，Zou HF，Wang HW，Zhang WK，Ma B，Zhang JS，Chen SY(2008)Soybean GmMYB76，GmMYB92，and GmMYB177 genes confer stress tolerance intransgenic Arabidopsis plants.Cell Res 18：1047-1060，公众可从中国农业大学获得)连接，将连接产物转化酵母菌株YRG2(Liao Y，Zou HF，Wang HW，Zhang WK，Ma B，Zhang JS，Chen SY(2008)Soybean GmMYB76，GmMYB92，and GmMYB177 genesconfer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.Cell Res 18：1047-1060，公众可从中国农业大学获得)，将转化产物涂布在缺色氨酸的SD培养基中，生长的即为阳性克隆。同时转化pGAL4(作为CK+，载体来源与pBDGAL4相同，记载在Liao Y，Zou HF，Wang HW，Zhang WK，Ma B，Zhang JS，Chen SY(2008)SoybeanGmMYB76，GmMYB92，and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenicArabidopsis plants.Cell Res 18：1047-1060，公众可从中国农业大学获得)、pBDGAL4空载体(作为CK-)到酵母菌株YRG2。

将阳性克隆涂在同时缺色氨酸、组氨酸的培养基平板上生长。同时利用X-Gal对β-半乳糖苷酶酶活性检测。结果如图1所示，其中SD/-Trp-His为同时缺色氨酸、组氨酸的SD培养基、SD/-Trp培养基为缺色氨酸的SD培养基，CK+为转有pGAL4的酵母，CK-为转有pBDGAL4的酵母，阳性克隆能在SD/-Trp-His培养基平板上生长，X-Gal对β-半乳糖苷酶酶活性检测呈阳性。说明，MtMYB1具有转录激活活性。

3、在洋葱表皮中MtMYB1的亚细胞定位分析

扩增MtMYB1基因全长开放阅读框(ORF)，引物分别含有Xho I和Kpn I酶切位点，即5’-CTCGAGGATGGCAAGAACTCCTTCTTG与3’-GGTACCCACTCCAAATATCCTTGTCAT；扩增片段插入到载体E3025(靳静晨，烟草中依赖于NAD<’+>的山梨醇脱氢酶基因的克隆及功能的初步，河南农业大学2008届硕士学位论文，2008，28-32，公众可从中国农业大学获得)的相应位点上，得到融合质粒。

利用基因枪的方法将融合质粒轰击洋葱表皮，以空载体E3025(含有GFP基因)作为对照，在共聚焦显微镜下观察，结果如图2所示，说明MtMYB1定位于细胞核。

实施例2、转MtMYB1拟南芥的获得及其功能研究

1、pCAMBIA1302-MtMYB1组成型高效表达载体的构建

Invitrogen公司合成分别含有Nco I和SPe I酶切位点的特异性引物对：

5’-CCATGGCAAGAACTCCTTCTTGTGACAAAAAA-3’(序列5)

5’-ACTAGTTCAACTCCAAATATCCTTGTCATATA-3’(序列6)

以pMD18T-simple-MtMYB1为模板，以序列5所示的DNA分子和序列6所示的DNA分子为引物，扩增得到含有Nco I和Spe I酶切位点的片段，该片段与经同样酶切过的载体pCAMBIA1302(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriclture，www.cambia.org)连接，连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pCAMBIA1302的NcoI和Spe I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pCAMBIA1302-MtMYB1，该质粒的详细构建见图3。

2、农杆菌EHA105/pCAMBIA1302-MtMYB1的获得

1)EHA105感受态细胞的制备

挑取农杆菌EHA105单菌落接种于100ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃，5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含10％甘油的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮；农杆菌悬浮液分装于无菌eppendorf管中，每管200μl于液氮中速冻1min，冻存于-70℃，得到EHA105感受态细胞。

2)表达载体转化农杆菌EHA105

取1μg上述获得的表达载体pCAMBIA1302-MtMYB1加入到200μlEHA105感受态细胞中，混匀，静止5min；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml YEB液体培养基，28℃150rpm振荡培养4h；5000rpm离心3min，弃上清，加入0.1ml YEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50μg/ml Kan和50μg/ml利福平的YEB固体平板上，28℃培养约48h，得到转化子。

将转化子进行菌液PCR鉴定，引物为序列5所示的DNA分子和序列6所示的DNA分子，得到827bp的片段为阳性克隆。将阳性克隆提取质粒测序，测序结果进一步证明为阳性克隆，载体pCAMBIA1302-MtMYB1已经成功转入农杆菌中，将阳性克隆命名为EHA105/pCAMBIA1302-MtMYB1。

3、转MtMYB1拟南芥的获得

将EHA105/pCAMBIA1302-MtMYB1接种于10ml含50μg/mlKan和50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜；转化前一天以1∶50比例浓度接种于200ml含相同抗生素的YEP培养基中扩大培养至OD₆₀₀为1.6，5000rpm，10min离心集菌，重悬于渗入缓冲液(新制的5％蔗糖溶液)，使OD₆₀₀为0.8；可采用Foral dip法将农杆菌转化花蕾期的野生型拟南芥。可以在拟南芥抽苔5cm时剪去顶端花序，促使腋生花序生长，以得到更多的花序，剪时伤口应位于最高的茎生叶上方，约5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透且将已经开放的花朵去掉，只保留未开放的小花蕾；转化时将拟南芥整株与花盆一起倒扣在盛有菌液及0.05％Silwet L-77的容器中浸泡1.5-2min，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，黑暗培养16小时，再直立花盆恢复正常的光照培养，得到T₀代转MtMYB1拟南芥，从T₀代转MtMYB1拟南芥收获种子，即为T₁代转MtMYB1拟南芥的种子。

4、转MtMYB1拟南芥的筛选

1)潮霉素筛选

收获T₁代转MtMYB1拟南芥的种子后，播种于含80mg/L Hyg+的MS固体平板上，4℃春化72小时，置22℃全日照光照培养箱中正置培养5天，观察表型，转化体表现为真叶呈深绿色，且明显高于非转化体，获得了5个T₁代转基因株系。将筛选到的转化体移至不含抗生素的MS培养基中复壮，4天后将绿色的幼苗转到土壤中繁种，收获T₂代转MtMYB1拟南芥种子。同样的方法筛选T₂代，得到T₃代转MtMYB1拟南芥种子，播种，得到5个株系T₃代转MtMYB1拟南芥。

2)分子检测

提取T₁代转拟南芥的基因组DNA，并以其作为模板，用序列5所示的DNA分子和序列6所示的DNA分子为引物，得到827bp的目的片段，说明获得了MtMYB1转基因拟南芥。

采用同样的方法将空载体pCAMBIA1302转入野生型拟南芥中，得到T₁代转空载体拟南芥种子，播种T₁代转空载体拟南芥，提取基因组DNA，用序列5所示的DNA分子和序列6所示的DNA分子为引物，没有目的片段，说明得到的为T₁代转空载体拟南芥，从T₁代收获T₂代种子，从T₂代植株收获T₃代种子，从T₃代种子播种，得到T₃代转空载体拟南芥。

反应体系：

PCR反应程序为：第一轮：94℃变性5min；第二轮：94℃变性45sec，43℃复性50sec，72℃延伸1min，30个循环；第三轮：72℃延伸10min。反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果。以野生型拟南芥和T₁代转空载体拟南芥为对照。

结果如图4所示，为MtMYB1基因PCR扩增产物电泳图。WT为未转化的拟南芥PCR产物(阴性对照，野生型拟南芥)，1-1、1-2、1-4、1-5、1-6为转基因拟南芥PCR产物。从图中看出，与野生型拟南芥(WT)相比，编号为1-1、1-2、1-4、1-5、1-6的T₁代转MtMYB1拟南芥得到827bp的PCR产物，证明其含有MtMYB1基因。野生型拟南芥和T₁代转空载体拟南芥结果无显著差异。

RT-PCR检测：为了检测PCR阳性植株中MtMYB1基因是否得到转录，进一步进行RT-PCR检测。用Trizol法提取PCR鉴定阳性的编号为1-1、1-2、1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥的总RNA，以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶(购自Promage公司)反转录RNA为eDNA，以野生型拟南芥(WT)和T₃代转空载体拟南芥为阴性对照。内参基因Actin2的引物为5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG和3’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC。

反转录反应体系：

将上述混合物混匀后，短暂离心将之收集于管底，72℃温育5min，再立即置于冰上5min，再加入以下成分：

将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，在42℃温育60min，70℃反应15min，取出置于冰上，离心后储存于-20℃。

以0.5μl反转录产物为模板进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件如前。

结果如图5所示，WT为未转化的拟南芥RT-PCR产物(阴性对照，野生型拟南芥)，1-1、1-2、1-4、1-6为T₃代转MtMYB1拟南芥RT-PCR产物，Actin2为参比。与野生型拟南芥(WT)相比，编号为1-1、1-2、1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥中MtMYB1基因得到表达。野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥结果无显著差异。

5、转MtMYB1拟南芥的耐逆性研究

将经上述编号为1-1、1-2、1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥进行功能检测，检测方法如下：

1)萌发期盐胁迫实验：

编号为1-1、1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥和对照(野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥)种子分别种于含有150mM NaCl的MS培养基上，4℃春化72小时，光照(16h光/8h暗)培养，温度22℃，第7天统计萌发数，进行萌发率计算。每个株系各40株。

萌发率的计算公式为萌发率＝萌发数/总数。

萌发率计算结果如图6所示，编号为1-1、1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥和野生型拟南芥的萌发率分别为0.8917、0.9833、0.9333、0.4667；

野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥结果无显著差异。

2)干旱实验：

编号为1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥和对照(野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥)种子分别种于MS培养基上，4℃春化72小时，光照(16h光/8h暗)培养7天，温度22℃，转移到培养土(营养土∶蛭石＝1∶1)，光照(16h光/8h暗)培养，温度22℃，正常浇水3周后，干旱处理(不浇水)2周，复水4天后拍照，并计算存活率，每个株系各30株。结果如图7B所示，

编号为1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥和野生型拟南芥的存活率分别为0.44、0.33和0.00；

野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥结果无显著差异。

以一直正常浇水的编号为1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥和野生型拟南芥种子采用完全相同的条件培养，作为对照，拍照如图7A所示，进一步看出，编号为1-4、1-6的T₃代转MtMYB1拟南芥耐干旱。

Claims (13)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是序列表中序列1所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将权利要求2或3所述基因插入pCAMBIA1302的多克隆位点得到的载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

7.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

8.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

9.扩增权利要求2或3所述基因的全长的引物对，所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。

10.一种培育耐逆的转基因植物方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。

12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

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