CN102766618A

CN102766618A - 水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102766618A
Application number: CN2012101639047A
Authority: CN
Inventors: 彭新湘; 张建军; 张婵; 杨国珍; 陈燕
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: CN102766618B

Abstract

本发明公开了水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明的水稻OsICL蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该蛋白的一种编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明的水稻OsICL蛋白的编码基因可以插入到植物表达载体的多克隆位点制备成重组表达载体，进一步构建转基因植物，研究发现，导入该基因的水稻在抗冷和抗铝性能方面都有明显提高。本发明的OsICL蛋白及其编码基因有助于研究水稻抗铝和抗冷的分子机制，对生产上培育具有耐铝和抗冷的水稻品种，或是通过转基因的方法改良其他对铝和冷敏感作物的抗性具有很大的应用价值。

Description

水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

水稻是我国最主要的粮食作物之一，其播种面积、总产和单产均居粮食作物首位。水稻冷害是目前水稻育种和生产上的一个难题，苗期冷害导致秧苗黄叶、生长迟钝、卷叶，甚至死亡，不仅严重影响早稻的产量，还会影响晚稻的生产计划（詹庆才等，水稻苗期耐冷性QTLs的分子定位. 湖南农业大学学报, 2003, 29: 7-11）；我国东北和西南地区，较大低温灾害多数发生在水稻孕穗期和花期，导致不育率的急剧上升和产量的大幅度下降，对水稻生产带来更大的损失（王连敏等，寒地水稻耐冷基础的研究Ⅲ花期低温对水稻结实的影响. 中国农业气象, 1997, 18: 9-11）；据不完全统计，我国每年因低温冷害损失稻谷约50亿公斤（陈大洲等，东乡野生稻抗寒基因的利用与前景展望. 江西农业学报, 1998, 10:65-68）。铝毒是酸性土壤中限制植物生长的最主要的限制因素（Kochian et al., How do crop plants tolerate acid soils? Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency. Annu Rev plant Biol. 2004, 55: 459-493；von Uexkull, Mutert, Global extent, development and economic impact of acid soils. In: Date RA, Grundon NJ, Raymet GE, Probert ME,eds. Plant-Soil Interactions at Low pH: Principles and management. Dorrecht, The Neth: Kluwer Academic, 1995, pp.5-19.）。全世界酸性土壤总面积达39.5亿hm²，占世界可耕地土壤的40％，主要分布于热带、亚热带及温带地区（Kochain, Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance of wheat in plants. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1995, 46: 237-260）。更令人担忧的是，日趋严重的酸沉降问题还在不断加剧土壤的酸化，以致其范围和强度仍在增加（张健，铝毒害与森林衰退研究评述. 世界林业研究, 1999, 12(2): 28-30；刘菊秀，酸沉降对森林生态系统影响的研究现状及展望. 生态学杂志, 2003, 22(5): 113-117）。因此，铝毒和冷害已成为影响作物生产最为严重的问题之一，水稻抗铝和抗冷相关基因的克隆和研究，不但对阐明水稻抗铝和抗冷机理具有重要的意义，同时对用于其它敏感作物的分子改良具有较高的应用价值。

一般认为，水稻的耐冷性是由多基因控制的数量性状，在多基因的调控下完成复杂的适应性反应。目前，已有部分水稻耐冷基因被克隆，如能抑制冰晶形成和生长的抗冻蛋白AFP（Wang et al., The dual effect of antifreeze protein on cryopreservation of rice (Oryza sativa L.) embryogenic suspension cells. Cryo letters, 2001, 22: 175-182），胚胎发生晚期丰富蛋白LEA(张妍等, 转LEA3基因水稻的抗性分析. 河北农业大学学报, 2005,28: 33-36)，冷相关蛋白和分子伴侣蛋白（Cui et al., A proteomic analysis of cold stress responses in rice seedlings. Proteomics, 2005, 5: 3162-3172），这些基因表达产物均是与植物耐冷性直接相关的功能性蛋白；而另外一些耐冷基因如CBF转录因子（Lissarre et al., Cold-responsive gene regulation during cold acclimation in plants. Plant Signaling and Behavior, 2010,5: 948-952）、钙依赖性蛋白激酶（Ludwig et al., CDPK-mediated signalling pathways: specificity and cross-talk. J Exp Bot, 2004, 55: 181-188）、细胞分裂蛋白激活激酶（Jonak et al., Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signalling. Curr Opin Plant Biol. 2002, 5: 415-424）等则为调控性蛋白，调控冷信号传导、耐冷基因表达、相关蛋白和酶活性提高水稻的抗冷性。

另外，近年已从植物中分离克隆到不少铝毒响应基因（杨志敏和汪瑾，植物耐铝的生物化学与分子机理. 植物生理与分子生物学学报, 2003, 29(5): 361-366；刘强等，植物适应铝毒胁迫的生理及分子生物学机理. 应用生态学报, 2004, 15(9): 1641-1649；Mao et al., Identification of aluminum-regulated genes by cDNA-AFLP in rice (Oryza sativa L.): Aluminum-regulated genes for the metabolism of cell wall components. J Exp Bot. 2004, 55(394): 137-143；Zhang et al., Identification of aluminum-responsive genes in rice cultivars with different aluminum sensitivities. J Exp Bot. 2007, 58(8): 2269-2278），但抗铝相关的基因很少，目前只确定从小麦、大麦和高粱中克隆到3个抗铝基因，分别为ALMT1，HvAACT1和SbMATE（Sasaki et al., A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. Plant J. 2004, 37: 645-653；Furukawa et al., An aluminum-activated citrate transporter in barley. Plant Cell Physiol.2007, 48(8): 1081-1091；Magalhaes et al., A gene in the multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family confers aluminum tolerance in sorghum. Nature Genetics. 2007, 39: 1156-1161），它们分别编码苹果酸和柠檬酸通道蛋白，通过增加苹果酸和柠檬酸的分泌提高抗铝的能力；在水稻中，STAR1（sensitive to Al rhizotoxicity 1）和STAR2相互作用形成一个细菌型ABC通道蛋白复合体（ATP binding cassette transporter），该复合体可以特异运输尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）修饰细胞壁，通过掩盖细胞壁上铝结合位点提高水稻的抗铝性（Huang et al., A bacterial-type ABC transporter is involved in aluminum tolerance in rice. Plant Cell. 2009, 21: 655-667）。

异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase, ICL）在植物、原生动物、藻类、真菌分布在乙醛酸循环体中，而在细菌中则存在于细胞质中。Xu等（Xu et al., Inducible antisense suppression of glycolate oxidase reveals its strong regulation over photosynthesis in rice. J Exp Bot, 2009, 60(6): 1799-1809）研究发现：当光呼吸途径的乙醇酸氧化酶活性供给不足时，ICL受到显著的诱导，乙醛酸循环体可被激活，引起乙醛酸的含量以及下游基因和代谢物的变化，补充光呼吸中乙醛酸的不足，从而维持细胞的稳定状态。Appanna（Appanna et al., The metabolism of aluminum citrate and biosynthesis of oxalic acid in Pseudomonas ?uorescens. Current Microbiology. 2003, 47(1): 32-39）研究荧光假单胞菌在Al³⁺大量存在时，ICL被大量诱导，草酸等酸性物质大量生成，以此缓解Al³⁺对菌株的毒害。已有的研究表明：ICL参与植物或微生物对非生物胁迫的反应，通过提高ICL的酶活性或激起下游反应增强对非生物逆境的抗性。

目前，没有报道OsICL与水稻抗冷和抗铝性有关。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种稻OsICL蛋白。

本发明的另一目的是提供上述稻OsICL蛋白的编码基因。

本发明的又一目的是提供上述稻OsICL蛋白的编码基因在制备转基因植物中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

水稻OsICL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且功能与SEQ ID NO:1所示序列相同的序列。

上述水稻OsICL蛋白的编码基因。该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。或在严格条件下可与SEQ ID NO:2杂交并且编码上述水稻OsICL蛋白的DNA分子，所述的严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1% SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗杂交膜一次。或者与SEQ ID NO:2的序列有90%以上的同源性（优选95%以上同源性），并且编码上述水稻OsICL蛋白的DNA分子。

上述水稻OsICL蛋白的编码基因的启动子，序列如SEQ ID NO:3所示；或严格条件下可与SEQ ID NO:3所示的DNA 分子杂交且具有启动子功能的DNA分子，上述的严格条件是：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1% SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗杂交膜一次。

一种表达载体，是由上述水稻OsICL蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成。

作为一种优选方案，该表达载体还包括启动子，该启动子为增强型启动子、组成型启动子、组织特异型启动子或诱导型启动子，花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子（Pubi）等，他们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用。

此外，使用本发明的的基因构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或者转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或是邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和其实密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构区域。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可以产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因（如GUS基因、荧光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除秀剂基因）等。

以上所述任意一种表达载体，所述的植物表达载体优选为pCAMBIA3301 、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI121，或其他衍生植物表达载体。

所述水稻OsICL蛋白在制备提高植物抗铝和抗冷性药剂中的应用。

所述水稻OsICL蛋白的编码基因在制备抗铝和抗冷性转基因植物中的应用。

携带有本发明的水稻OsICL蛋白的编码基因的植物表达载体可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或是组织中。被转化的宿主植物可以是水稻或其它作物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

实验结果表明，转OsICL基因植株表现对铝毒和低温的抗性明显增强，其蛋白质和编码基因对水稻抗铝和抗冷性的调控具有重要的实际意义，在实际应用中可以将OsICL基因转入不同的水稻品种中以培育更加理想的水稻栽培品种或者转入到其他感铝和感冷的作物提高抗性。OsICL蛋白及其编码基因在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1. 水稻OsICL的扩增产物电泳结果，泳道M为分子量标记DL2000（购自TAKARA）；泳道1-3为目的基因。

图2. 重组OsICL的过量表达载体酶切鉴定电泳结果，泳道M为分子量标记DL2000（购自TAKARA）；泳道1，4和5为含OsICL的植物重组表达载体质粒，泳道2和3为空载体质粒。

图3. 重组OsICL的过量表达载体转化农杆菌后稳定性检测结果，泳道M为分子量标记DL2000（购自TAKARA）；泳道1-6为含OsICL的植物重组表达载体质粒。

图4. 经农杆菌介导得到的转化植株分化及生根，A：继代培养中的愈伤组织，B：筛选中的愈伤组织，C：预分化中的抗性愈伤组织，D：预分化中的抗性愈伤组织转为绿点，E：分化出幼苗，F：生根壮苗培养基中生长的幼苗。

图5. 半定量RT-PCR分析转基因植株中OsICL的表达，WT为野生型植株中花11；3-1和3-2为OsICL过量表达植株。

图6. Western Blot分析转基因植株中OsICL的表达，WT为野生型植株中花11；3-1和3-2为OsICL过量表达植株。

图7. 转基因植株与对照植株中ICL的活性检测，WT为野生型植株中花11；3-1和3-2为OsICL过量表达植株。

图8. 转基因植株的抗铝性鉴定，WT为野生型植株中花11；3-1和3-2为OsICL过量表达植株，CK为对照处理；Al为1mmol/L AlCl₃处理，A为1mmol/L AlCl₃处理4天；B为1mmol/L AlCl₃处理12天。

图9. 转基因植株的抗冷性鉴定，WT为野生型植株中花11；3-1和3-2为OsICL过量表达植株，抗冷性鉴定：转基因植株发芽后木村B培养至4叶期，平均温度12.8℃-18.8℃，湿度约80-90%，pH为4.5-5.0，冷处理26天。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步解释本发明，实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成.

实施例1OsICL基因的获得

根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的关于该基因的cDNA序列设计引物，引物序列如下：（46-1852bp）

OsICLF1: tcttggttatcatgtcct（SEQ ID NO:4）；

OsICLR1: gctccttggctgaagtcc（SEQ ID NO:5）。

以粳稻品种中花11号（购自广东省农科院）2周的幼苗淹水2天的水稻叶片cDNA为模版，以OsICLF1和OsICLR1为引物，常规PCR扩增OsICL基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段大约1800bp，回收并纯化该DNA片段，克隆到pMD18-T载体（购自TAKARA公司）上，获得pMD18-T-OsICL载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。

根据实施例1所得OsICL基因的核苷酸序列设计引物对OsICLF2和OsICLR2，并在引物两端分别引入限制性内切酶HindIII 和SpeI识别位点和保护碱基，引物序列如下：

OsICLF2: ggccgaagctttcttggttatcatgtcct (SEQ ID NO:6，下划线为限制性内切酶HindIII识别位点)；

OsICLR2: tatatactagtgctccttggctgaagtcc (SEQ ID NO:7，下划线为限制性内切酶SpeI识别位点)。

以pMD18-T-OsICL载体DNA为模版，在引物OsICLF2和OsICLR2的引导下，用常规PCR方法扩增OsICL基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化大约1800bp左右的DNA片段，将该片段克隆到pMD18-T载体（购自TAKARA公司）上，获得新的重组载体命名为pMD18-T-OsICL-E，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示，在其DNA两端引入了合适的酶切位点。

实施例2 遗传转化鉴定目标基因的功能

将OsICL基因克隆入植物过量表达载体pCAMBIA1380（购自澳大利亚CAMBIA公司）多克隆位点的HindIII和SpeI酶切位点之间，得到含有OsICL基因的植物表达载体，然后利用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11号的成熟胚的愈伤组织，方法如下述文献描述（Hiei et al, Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J. 1994, 6: 271-282），经过预分化、分化，得到12株转化植株，经过PCR鉴定，全部为阳性，PCR引物序列如下：

引物1： 5’- CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC -3'（SEQ ID NO:8）；

引物2：5’- TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA -3’（SEQ ID NO:9）；

PCR扩增条件为：94 ℃ 2 min；94℃ 30 sec，58 ℃ 30 sec，72℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。

经过PCR鉴定为阳性的转基因植株后，提取T1代转基因植株叶片基因组DNA进行Southern Blot检测插入基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后取100粒以上种子发芽后利用潮霉素进行筛选，若没有死亡则表明种子已经纯合；选择已经纯合的转基因种子和野生型水稻中花11种子萌发后，利用木村B营养液（调pH为4.8）培养水稻至4叶期，然后提取水稻RNA，检测总RNA浓度和完整度后再合成cDNA第一链，以水稻Actin作为内参基因，加入等量的cDNA模板，扩增Actin 和OsICL，等体积PCR产物上样后检测OsICL的表达，从图5 可以看出，在转基因植株根和叶片中OsICL的表达都得到较大的提高；所用PCR引物序列如下：

Actin-F: 5’- GACATTCAGCGTTCCAGCCATGTAT-3'（SEQ ID NO:10）；

Actin-R: 5’- TGGAGCTTCCATGCCGATGAGAGAA-3'（SEQ ID NO:11）；

ICL-F: 5’- GGTGGGGAACGGACAGGT-3'（SEQ ID NO:12）；

ICL-F: 5’- TTGCGGTCGTGGTAGAGC-3'（SEQ ID NO:13）；

PCR扩增条件为：94 ℃ 2 min；94℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，72℃ 1 min，25个循环；72 ℃ 5 min。

木村B营养液具体配方为：(NH₄)₂SO₄ (0.365mM), KH₂PO₄ (0.182 mM), KNO₃ (0.183 mM), K₂SO₄ (0.086 mM), Ca(NO₃)₂ (0.366 mM), MgSO₄ (0.548 mM), EDTA-Fe^Ⅲ (0.020 mM), MnCl₂ ^.4H₂O (0.091×10^-3 mM), ZnSO₄ ^.7H₂O (0.77×10^-3 mM), CuSO₄ ^.5H₂O (0.32×10^-3 mM), H₃BO₃ (0.0462 mM), (NH₄)₆Mo₇O₂₄ ^.4H₂O (0.145×10^-3 mM)。

利用上述培养至4叶期的水稻根和叶片提取总蛋白，定量后进行SDS-PAGE电泳，利用OsICL多克隆抗体进行Western Blot分析，结果如图6所示，转基因植株根和叶片中ICL在蛋白水平与野生型相比均有较大的上调，并且野生型植株均检测不到OsICL的表达。进一步测定水稻总蛋白中ICL的酶活性，转基因植株根和叶中ICL的酶活性也提高40倍和25倍（图7）。

通过以上实验，我们证实了OsICL不论是在核酸和蛋白表达水平，还是在酶活性上转基因植株均较野生型有较大提高。为了检验转基因纯合植株对铝毒和冷害的抗性，我们进一步对转基因纯合植株进行抗铝和抗冷性鉴定，抗铝性鉴定方法如下述文献描述（Xu et al, Differential resistance of two subtropical rice cultivars to aluminum toxicity. J Plant Nutrition, 2004, 27,1601-1609），具体如下：转基因纯合植株和野生型水稻植株中花11发芽后木村B培养液培养至4叶期，然后在人工气候箱中设置光照培养14小时（30℃）：暗培养10小时（25℃）、湿度约60-80%，铝毒(1mM AlCl₃)处理12天，pH为4.2，每3天换一次营养液；抗冷性鉴定方法如下：转基因纯合植株和野生型水稻植株中花11发芽后木村B培养液培养至4叶期，然后在人工气候箱中以平均温度12.8℃-18.8℃、湿度约80-90%、pH为4.5-5.0冷处理26天，每3天换一次营养液。

结果表明：转基因植株的抗铝和抗冷性明显增强。转化植株与对照植株相比，铝处理下转基因植株根的生长速率和相对生长量均较对照植株高（图8）；冷处理后转基因植株根和地上部的生长速率和生长量均较对照植株高（图9）。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 572

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Ser Pro Phe Ser Val Pro Ser Leu Ile Met Glu Glu Glu Gly

1 5 10 15

Arg Phe Glu Ala Glu Val Ala Glu Val Glu Ala Trp Trp Gly Thr Asp

20 25 30

Arg Phe Arg Leu Thr Lys Arg Pro Tyr Thr Ala Arg Asp Val Ala Leu

35 40 45

Leu Arg Gly Thr Leu Arg Gln Ser Tyr Ala Ser Gly Asp Met Ala Lys

50 55 60

Lys Leu Trp Arg Thr Leu Arg Ala His Gln Ala Asn Gly Thr Ala Ser

65 70 75 80

Arg Thr Phe Gly Ala Leu Asp Pro Val Gln Val Ala Met Met Ala Lys

85 90 95

His Leu Asp Thr Val Tyr Val Ser Gly Trp Gln Cys Ser Ser Thr His

100 105 110

Thr Ser Thr Asn Glu Pro Gly Pro Asp Leu Ala Asp Tyr Pro Tyr Asp

115 120 125

Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Phe Phe Ala Gln Leu Tyr His

130 135 140

Asp Arg Lys Gln Arg Glu Ala Arg Met Ser Met Ser Arg Ala Glu Arg

145 150 155 160

Ala His Glu Pro Tyr Val Asp Tyr Leu Lys Pro Ile Ile Ala Asp Gly

165 170 175

Asp Thr Gly Phe Gly Gly Ala Thr Ala Thr Val Lys Leu Cys Lys Leu

180 185 190

Phe Val Glu Arg Gly Ala Ala Gly Val His Leu Glu Asp Gln Ser Ser

195 200 205

Val Thr Lys Lys Cys Gly His Met Ala Gly Lys Val Leu Val Ala Val

210 215 220

Ser Glu His Val Asn Arg Leu Val Ala Ala Arg Leu Gln Phe Asp Ile

225 230 235 240

Met Gly Val Glu Thr Val Leu Val Ala Arg Thr Asp Ala Val Ala Ala

245 250 255

Thr Leu Ile Gln Thr Asn Val Asp Ala Arg Asp His Gln Phe Ile Leu

260 265 270

Gly Ala Thr Asn Pro Arg Leu Arg Asn Arg Ser Leu Ala Ala Val Leu

275 280 285

Ser Asp Ala Met Ser Ala Gly Lys Asn Gly Arg Glu Leu Gln Ala Ile

290 295 300

Glu Asp Glu Trp Leu Ala Thr Ala Gln Leu Lys Thr Phe Ser Asp Cys

305 310 315 320

Val Arg Asp Ala Ile Ala Ser Leu Asn Ala Thr Asp Ala Asp Lys Gln

325 330 335

Arg Lys Leu Gln Glu Trp Ser Ala Ala Thr Ser His Asp Lys Cys Val

340 345 350

Pro Leu Glu Gln Ala Arg Asp Ile Ala Ala Gly Leu Gly Val Thr Ser

355 360 365

Leu Phe Trp Asp Trp Asp Leu Pro Arg Thr Arg Glu Gly Phe Tyr Arg

370 375 380

Phe Arg Gly Ser Val Ala Ala Ala Val Val Arg Gly Arg Ala Phe Ala

385 390 395 400

Pro His Ala Asp Val Leu Trp Met Glu Thr Ser Ser Pro Asn Ile Ala

405 410 415

Glu Cys Thr Ala Phe Ala Glu Gly Val Arg Ala Ala Ser Pro Gly Ala

420 425 430

Met Leu Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn Trp Asp Ala Ser Gly

435 440 445

Met Thr Asp Ala Asp Met Ser Glu Phe Ile Pro Arg Val Ala Arg Leu

450 455 460

Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Phe His Ala Asp Ala

465 470 475 480

Leu Val Thr Asp Thr Phe Ala Arg Asp Phe Ala Arg Arg Gly Met Leu

485 490 495

Ala Tyr Val Glu Arg Ile Gln Arg Glu Glu Arg Ser Asn Gly Val Glu

500 505 510

Thr Leu Gln His Gln Lys Trp Ser Gly Ala Asn Phe Tyr Asp Arg Val

515 520 525

Leu Lys Thr Val Gln Gly Gly Ile Ser Ser Thr Ala Ala Met Gly Lys

530 535 540

Gly Val Thr Glu Glu Gln Phe Lys Gly Ser Trp Thr Gly Pro Gly Ser

545 550 555 560

Glu Ser Ser Ser His Val Leu Ala Lys Ser Arg Met

565 570

<210> 2

<211> 2154

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attcgctcta gccttcctca tcgttgacag tgcgtggcag tgtactcttg gttatcatgt 60

cgtcgccgtt ctccgtgcca tctctgatca tggaggagga agggcggttc gaggcggagg 120

tggcggaggt ggaggcgtgg tggggaacgg acaggttccg gctcaccaag cgcccctaca 180

cggcgcgcga cgtcgcgctc ctccgcggca cgctccggca gagctacgcc tccggcgaca 240

tggccaagaa gctgtggcgc acgctcaggg cgcaccaggc caacggcacg gcgtcgcgca 300

ccttcggcgc gctcgacccc gtccaggtcg ccatgatggc gaagcacctc gacaccgtct 360

acgtctccgg atggcagtgc tcgtcgacgc acacctcgac gaacgagccg ggccccgacc 420

tcgccgacta cccctacgac accgtcccca acaaggtcga gcacctcttc ttcgcccagc 480

tctaccacga ccgcaagcag cgggaggcgc gcatgtcgat gtccagggcg gagcgcgcgc 540

acgagccgta cgtggattat cttaagccca tcatcgccga cggcgacacc gggttcggcg 600

gcgccacggc caccgtcaag ctgtgcaagc tgttcgtcga gcgcggggcg gccggggttc 660

acctcgagga ccagtcgtcg gtgaccaaga agtgcgggca catggcgggg aaggtgctcg 720

tcgccgtctc cgagcatgtc aaccgcctcg tcgccgcgcg gctccagttc gacatcatgg 780

gcgtcgagac cgtcctcgtc gcgcgcaccg acgccgtcgc cgccacgctg atccagacca 840

acgtcgacgc gcgcgaccac cagttcatcc tcggcgcgac caacccgcgc ctcaggaacc 900

ggagcctcgc cgccgtcctc tccgacgcca tgtcggcggg caagaacggc agggagctcc 960

aggccatcga ggacgagtgg ctcgccacgg cgcagctcaa gaccttctct gactgcgtca 1020

gggacgccat cgcgagcctc aacgccaccg acgccgacaa gcagcgcaag ctccaggagt 1080

ggagcgccgc caccagccac gacaagtgcg tgcccctcga gcaggcgcgc gacatcgccg 1140

cgggcctcgg cgtcacatcc ctgttctggg actgggacct gccgagaaca cgggaggggt 1200

tctaccgctt ccgcggctcc gtcgcggcgg ccgtcgtccg cggccgcgcg ttcgcgccgc 1260

acgccgacgt gctctggatg gagacgtcga gccccaacat cgccgagtgc acggcgttcg 1320

ccgagggcgt gagggcggcg agcccgggcg cgatgctggc gtacaacctc tcgccgtcct 1380

tcaactggga cgcctccggc atgacggacg ccgacatgtc ggagttcatc ccgcgcgtgg 1440

cgaggctggg gtacgtgtgg cagttcatca cgctcgccgg gttccacgcc gacgcgctcg 1500

tcacggacac gttcgcccgc gacttcgcgc ggcgcggcat gctggcgtac gtggagagga 1560

tccagaggga ggagaggagc aacggcgtgg agacgctgca gcaccagaag tggtcgggcg 1620

ccaacttcta cgacagggtg ctcaagaccg tgcagggtgg catctcctct accgccgcca 1680

tgggcaaagg agttactgaa gagcagttca agggctcatg gacagggcct ggaagtgaga 1740

gcagcagcca tgttcttgcc aaatccagga tgtgatgagg attattcaga ggaaaatttt 1800

aaacagttga aatttatgta ataaaagcca ctctggactt cagccaagga gccttgatac 1860

tttacagact gaactacagc acgcacggat caactaatta catatagtta cagtatatat 1920

gaatgattga gttatgactc aaaatggaac aatcagtttg gggtaaaatg taattgatct 1980

gtgagtttat cacagaaagt attttttgca cctagatgca aaaattgggc acatacagta 2040

ctgttatgca tttacagaga attctcaagt tcataaaaga agtgtttgca aatgaattat 2100

ttagtaaaaa ctttttttct ctttcttgat aatgtatatt gcccaaattt atct 2154

<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtatctgc atatagttaa tgcaataaag ctgtgatgcc cctccctatc cgtgttcatc 60

tactatatga ttgtgtgcat gagatcgtcg tcttctactc cggatcagcg aataggccac 120

tagttattta acaattatgt catcttcgca aacttttgga gaagataatt tgttttgaaa 180

cgagaactac gacgagccga acatcatcct ctgcctccat caaaccctgc ctcacatgag 240

cacccaccag tgcctatagc aggttggcac gaggagctga tctgagctcc catctgaacc 300

tgacagcgag acgggcatcg aagctgttgc agaattctga aggatcaaca acaagcaagc 360

gcatgctgca cgcatgcatg tttcttctcg atgtaaggcc gcgccgcctc ccttgtccct 420

ggcgatggcg attccggctt ttctcccgtt caccgctgtt ggggcgcctg cgctgacggc 480

gaccgcctag cgcgcgcgca gccgcagcct cgatcttctt gtggtctttg atgcagcaac 540

aagaagctac ggcactctcc tctgcgtgac gccaccgtac gtttcgttgg aaacgatcgg 600

aacggaacgg tgccgtgtgc gggagaaacg gttaggatga cagcagcaac agccaggcgc 660

cagcgagcga gcgagcgagc ctactgatgt ggacgataaa caccagagga acgtacgtcc 720

ccgttccatc cgtcgcagcc cattcggcca atccttatcc ggtcgttaga gtagttgata 780

ggtgttccgg ccgccggccc aatcctacct ggtttgactc acgcagtcat gggcctaatt 840

gcagcccttt ggttccaact tacaaattgc aatattttac aactgtttgc atgtttctat 900

ttttttaata atagaactca ttctgatttt gcttttgaaa taaaaagata caaccaatta 960

ttatagaggt tgtatgatga acgactgtaa attttacaat cacaatttat tagaaaacaa 1020

gaaatttact aagaatacca cctttaaagt atagactatt tttatctatg gttggcgaga 1080

atatgcataa ccattttttt tctctaacgg cttacaagtt ctatatagtt cttgtcttaa 1140

accgaaaaca gaatctccaa aatcaacaat taattatagt ttcgattgaa tttcacacac 1200

atcactatag gcgggtaacg tcaaaccgaa aagaataaca ccatagagca acagagctgt 1260

aaatcaatga ttcgctcaaa tcttgctaac gttgtagcca tcaaaacgac gctaaggacg 1320

cccctgaact ctggaatctg aactcgagcg gttttctcat ggctctcagt gccggtgtgg 1380

gatcgtggtt gtgtgtgtga ttgcagaaaa aaaaaaatcc tatccattat ccatacgttt 1440

ttctccacat cactcgccgg ccggtcagtg ttcgcagttt gctttgctca gaactaatcg 1500

gaggagaata aacatgtacg caaccgatgc gagcttatgt gcaaccagag ctaaccacag 1560

ctaccttcca aaacgcgccc gatccaactc ttgtcctcgc gcgaaaccga tcaaaatccc 1620

ggacgccacc gccggctctc gcgtacgtac gtggcgacca taactcgccg ttgcagccat 1680

ctcactgcag tgtaccctgc aacatgccaa ttaacctcca agataagcat ccatcgatcc 1740

accgctggat caaccgcagc gcgcgagaga tcgatcaacg tacgtaacgc catgcaccgt 1800

agccaccaag ttccatgcat gcaccgatgc acgagtgatc gagtgagtga tctgatcgag 1860

taataagttg caggtttctg gacgccatcg ctcggtataa atacggcgtt ttctgcaggc 1920

gaagcagcca aggcatgcat gcacattcgc tctagccttc ctcatcgttg acagtgcgtg 1980

gcagtgtact cttggttatc 2000

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttggttat catgtcct 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctccttggc tgaagtcc 18

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggccgaagct ttcttggtta tcatgtcct 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tatatactag tgctccttgg ctgaagtcc 29

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgaactcac cgcgacgtct gtc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tagcgcgtct gctgctccat aca 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacattcagc gttccagcca tgtat 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggagcttcc atgccgatga gagaa 25

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggtggggaac ggacaggt 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgcggtcgt ggtagagc 18

Claims

1.水稻OsICL蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述水稻OsICL蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述水稻OsICL蛋白的编码基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求2或3所述水稻OsICL蛋白的编码基因的启动子，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种表达载体，其特征在于由权利要求2或3所述水稻OsICL蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成。

6.根据权利要求5所述表达载体，其特征在于该表达载体还包括启动子，其特征在于启动子为增强型启动子、组成型启动子、组织特异型启动子或诱导型启动子。

7.根据权利要求5所述表达载体，其特征在于所述植物表达载体为pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI121。

8.权利要求1所述水稻OsICL蛋白在制备提高植物抗铝和抗冷性药剂中的应用。

9.权利要求2所述水稻OsICL蛋白的编码基因在制备抗铝和抗冷性转基因植物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述转基因植物为转基因水稻。