CN101358193B

CN101358193B - 水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用

Info

Publication number: CN101358193B
Application number: CN2008100487341A
Authority: CN
Inventors: 林拥军; 刘莉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2008-08-08
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2028-08-08
Also published as: WO2010015147A1; CN101358193A

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。从水稻中克隆到三个叶片衰老特异性诱导表达的启动子P_SAG39、P_SAG39-1600和P_SAG39-493，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示；所述启动子在成熟水稻叶片中有一定的表达，随着叶片衰老程度加深其表达量逐步变强，当叶片衰老程度到达晚期时表达活性达到顶点。本发明还公开了这三个启动子及其相应表达载体的制备方法，以及通过农杆菌介导的转基因方法导入水稻的应用。

Description

水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和水稻分子育种技术领域，具体涉及到一个叶片衰老特异诱导表达的水稻启动子的克隆及其在转基因水稻中的应用。

背景技术

水稻是人类最重要的粮食作物之一。虽然目前杂交稻的推广暂时解决了人类的粮食危机，但是目前生产上广泛使用的一些优良杂交稻组合存在着一个重要的缺陷：生育后期叶片易早衰，导致光合能力降低，库大源不足，造成结实率低、充实度不良的问题。叶片是植物进行光合作用，吸收水和CO₂产生能量的重要场所，也是植物体合成氨基酸、抗氧化剂、各种营养物质的工厂。一只叶片衰老，其光合能力将显著下降，因而作物的产量很大程度上受到叶片衰老的影响。如果在生殖生长中后期，叶片能够保持较长时间的健康持绿状态，能尽量持久地保持光合能力，并且增强它在籽粒充实期间的营养物质输出能力，改善籽粒充实度，提高产量有重要的意义。

植物自身细胞核基因如何调控衰老进程，其中的分子机制尚不明确。传统的方法往叶片上喷洒激素如细胞分裂素，或是在作物结实期适当追加氮肥，都可一定程度的延缓衰老。随着生物技术的发展，在培育持绿性水稻的策略中，采用分子遗传调控的手段来延缓叶片衰老是一条经济有效且保护环境的措施。这主要是基于激素生理学，运用转基因手段，增强细胞分裂素在植物体内表达来延缓衰老。细胞分裂素是植物衰老调节研究最多的一种天然激素。细胞分裂素调控植物细胞分裂和分化，控制植物生长发育的多种进程，茎和芽的生长、营养信号的传导、增加作物产量等。细胞分裂素能够抑制核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶等的活性，能延缓核酸、蛋白质、叶绿体等的降解并且促使营养物质向应用部位移动。异戊二烯合成酶基因IPT编码调节细胞分裂素合成的关键限速酶，利用从根癌农杆菌中分离的IPT基因，人们在叶片抗衰老基因工程研究中开展了大量的工作，培育了一些持绿性植物(Smigocki，Cytokinin content and tissuedistribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene.Plant Mol Biol，1991，16：105-115；Li等，Genome-wide transcription analyses in rice using tiling microarrays.Nat Genet，2006，38：124-129；Gan and Amasino，Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin.Science，1995，270：1966-1967；McKenzie，Controlled Cytokinin Production in Transgenic Tobacco Using a Copper-InduciblePromoter.Plant Physiol，1998，116：969-977；Lin等，Cultivating rice with delaying leaf-senescence by P_SAG12-iptgene transformation.Acta Bot Sin，2002，44：1333-1338；Chang等，Overproduction of Cytokinins in PetuniaFlowers Transformed with P_SAG12-IPT Delays CorollaSenescence and Decreases Sensitivity to Ethylene.PlantPhysiol，2003，132：2174-2183；Huynh等，Regulation of flooding tolerance of SAG12：ipt Arabidopsis plants bycytokinin.J Exp Bot，2005，56：1397-1407；Calderini等，Delay of leaf senescence in Medicago sativa transformedwith the ipt gene controlled by the senescence-specific promoter SAG12.Plant Cell Reports，2007，26：611-615)。在这些研究中，早期利用的是表达量比较高的组成型启动子，如CaMV35S启动子或玉米Ubiquitin启动子，结果显示组成型过量表达IPT的转基因植株均表现为细胞分裂素含量增加，叶片衰老延迟，同时植株的生长发育形态也发生了许多不正常的变化，如叶片变小、叶型变圆，顶端优势丧失，不能形成根或形成的根不能伸长等，后来利用热激启动子Phsp70和铜诱导型特异启动子，发现转基因植株的侧芽和叶片数都明显增多。直到利用拟南芥衰老特异基因SAG12的启动子表达IPT转化烟草，取得了比较理想的效果，转基因烟草叶片和花的衰老明显延迟，开花数提高60％，种子产量提高50％，生物学产量提高40％。转化拟南芥、矮牵牛等同样达到延缓衰老的效果，开花数目亦有所增加，并且抗涝、抗旱性有所增强。但是该体系在水稻这个禾本科植物中的应用受到物种差异的影响，只起到了持绿的效果，没有增加光合产物。找到一个水稻来源的启动子在特定时期特定组织中高效特异的表达细胞分裂素将对培育持绿性高产水稻具有重要作用和意义。

计算机和网络技术的发展给生物信息学的研究注入新的活力，大量数据库的建立为启动子的预测及鉴定带来方便，2008年建立了最新的真核启动子的数据库(Yamamoto and Obokata，ppdb：a plant promoterdatabase.Nucleic Acids Res，2008，36：D977-981)。克隆启动子并通过报告基因来定性或定量的分析启动子活性的技术很成熟。人们已经成功分离并验证了大量组成型或特异型表达的启动子，通过缺失分析、酵母单杂交、凝胶阻滞实验、DNase I足迹实验等技术鉴定了启动子DNA上反式作用蛋白结合的位点，探明一批对组织或时空表达起调控作用的顺式作用元件(Khodakovskaya等，Enhanced cold tolerance in transgenictobacco expressing a chloroplast ω-3 fatty acid desaturase gene under the control of a cold-inducible promoter.Planta，2006，223：1090-1100；Cai等，Identification of novel pathogen-responsive cis-elements and their bindingproteins in the promoter of OsWRKY13，a gene regulating rice disease resistance.Plant Cell Environ，2008，31：86-96；Hua等，Analysis of rice genes induced by striped stemborer(Chilo suppressalis)attack identified apromoter fragment highly specifically responsive to insect feeding.Plant Mol Biol，2007，65：519-530；Saha等，Characterization of vascular-specific RSsl and rolC promoters for their utilization in engineering plants todevelop resistance against hemipteran insect pests.Planta，2007，226：429-442)。本发明就是利用有关分子生物学方法，从水稻日本晴BAC文库中克隆得到一个叶片衰老特异诱导表达的启动子，将该启动子基因融合报告基因GUS导入水稻植株中，验证其表达模式，鉴定特异性表达区段；构建该启动子驱动IPT基因的表达系统，筛选纯合转基因家系，证实表达该系统的转基因家系具有持绿性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，从水稻日本晴BAC文库中分离并鉴定出具有叶片衰老特异性的启动子，并将这些启动子用于水稻的基因工程改良，最终目的是提高水稻单产。为了便于利用，我们创建了P_SAG39、P_SAG39-1600和P_SAG39-493这3个包含了核心特异性区但总长度不同的启动子。将这些启动子构建的融合基因导入水稻，从而获得改良的持绿性增强的转基因水稻植株。

本发明是这样实现的：

从水稻日本晴BAC文库(Feng等，Sequence and analysis of rice chromosome 4.Nature，2002，420：316-320)中鉴定和克隆得到的叶片衰老特异表达的启动子，申请人将其命名为P_SAG39、P_SAG39-1600和P_SAG39-493。所述的启动子P_SAG39序列，它是序列表SEQ ID NO：1所示的序列。该启动子序列具有以下特征：通过利用该启动子所构建的P_SAG39-GUS载体驱动GUS报告基因在转基因水稻中的表达，发现该启动子在成熟的水稻叶片中有一定的表达，随着叶片衰老程度加深其表达量逐步变强，当叶片衰老程度到达晚期时表达活性达到顶点；用衰老诱导剂脱落酸(ABA)处理30分钟后，该启动子表达量明显上升，在2小时达到最高峰；该启动子在叶、茎、根、花、颖壳及未成熟种子的种皮、愈伤组织中表达，而在成熟种子及胚乳中不表达。利用启动子P_SAG39驱动IPT基因在转基因家系中表达，进一步研究转P_SAG39-IPT表达系统的阳性转基因水稻的叶片持绿性变化，发现持绿性增强，且这个表型与外源基因IPT的表达量是共分离的。所述的启动子P_SAG39-1600序列，它是序列表SEQ ID NO：3所示的序列，是由启动子P_SAG39截短的核心区1600bp的序列。所述的启动子P_SAG39-493序列，它是序列表SEQ ID NO：3所示的序列，是由P_SAG39-1600核心区进一步截断的493bp的序列。这两个区段不仅具有独立的启动基因表达的功能，而且在衰老的叶片中表达模式与P_SAG39相同。

本发明的具体步骤是：

首先用特异性引物以PCR的方法从日本晴BAC克隆OSJNBa0052O21上扩增得到一个被命名为P_SAG39的启动子候选片段，将该启动子P_SAG39候选片段与报告基因GUS编码序列构建成融合基因并装载到双元Ti载体上，装配成P_SAG39-GUS载体，再通过农杆菌介导的转基因方法，将候选片段构建的报告基因转入水稻受体中，获得转基因植株；通过组织化学染色及Northernblot分析，考察该启动子在叶片发育各时期的表达变化，进而验证和克隆该启动子。检测结果表明：在成熟的水稻叶片中有一定的表达，随着叶片衰老程度加深其表达量逐步变强，当叶片衰老程度到达晚期时表达活性达到顶点；用衰老诱导剂脱落酸处理30分钟后，该启动子表达量明显上升，在2小时达到最高峰；该启动子在叶、茎、根、花、颖壳及未成熟种子的种皮、愈伤组织中表达，在成熟种子及胚乳中不表达(如图5a、图5b和图9所示)。采用片段缺失的方法，我们构建了7个来源于P_SAG39的5′端缺失片段连接GUS表达载体，分析这7个片段的衰老特异性表达情况，结果显示：来源于该启动子的两个区段P_SAG39-1600和P_SAG39-493不仅具有独立的启动基因表达的功能，而且在衰老的叶片中表达量比在绿色成熟叶片中明显增强。然后用IPT基因替换掉P_SAG39-GUS载体上的GUS，装配成P_SAG39-IPT载体，同样用农杆菌介导的转基因方法，将候选片段构建的报告基因转入水稻受体中，获得转基因植株；繁殖并筛选了单拷贝插入的转基因纯合家系，通过RT-PCR方法检测IPT在转基因家系中是表达的，并且阳性转基因纯合家系的叶片持绿性增强。

本发明的优点在于：

(1)本发明鉴定了叶片衰老特异性表达的启动子P_SAG39及核心结构，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。

(2)本发明可以直接应用于水稻衰老特异诱导表达启动子的鉴定和克隆。

(3)本发明所提供的启动子P_SAG39、P_SAG39-1600和P_SAG39-493构建抗衰老相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗衰老性，受体植物包括水稻及其他作物例如玉米、小麦、棉花、油菜或番茄等。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1，公开了本发明克隆的的包括SAG39基因5’端部分编码序列的水稻叶片衰老特异诱导表达启动子的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子应用的核苷酸序列，长度为1637bp。

序列表SEQ ID NO：5是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子应用的核苷酸序列，长度为494bp。

图1：显示的是SAG39基因启动子区顺式作用元件。阴影显示的是基本启动子元件序列；双下划线序列为扩增SAG39基因启动子所用的引物序列；单下划线序列为预测的SAG39基因翻译起始位点；预测的转录起始位点加文本框表示，此处的碱基编号为+1；在其上游的序列编号为负，在其下游的序列编号为正；翻译起始位点ATG用阴影加文本框表示。

图2：表示双元载体pCAMBIA1301结构示意图。

图3：表示构建好的以pCAMBIA1301为骨架的表达载体。图中a显示融合GUS的表达载体(也代表了P_SAG39-1600或P_SAG39-493融合GUS的表达载体，这两个启动子酶切位点与载体上的相对位置与P_SAG39完全相同)；b显示P_SAG39融合IPT的表达载体。P_SAG39为SAG39启动子序列；EcoRI、BglII为将P_SAG39导入pCAMBIA1301时所用的限制内切酶位点；BglII、BstEII为将IPT导入P_SAG39-GUS所用的限制内切酶位点；LB、RB分别为pCAMBIA1301中T-DNA的左边界和右边界；Hpt为潮霉素抗性筛选基因；gusA为报告基因GUS(β-葡萄糖苷酸酶)；Nos polyA为胭脂碱合成酶基因多聚腺苷酸序列。

图4：显示的是P_SAG39-GUS转基因植株中外源片断的拷贝数情况。图中：M表示λ-ECoT14I；1～12表示转基因植株；CK表示野生型植株。

图5：显示的是GUS随着叶片衰老的表达变化情况和野生型植株中基因SAG39受到ABA诱导的表达情况。图中：FL表示成熟的完全伸展叶片；ES表示叶绿素含量达90％的早期衰老叶片；S1表示叶绿素含量达70％的早期衰老叶片；S2表示叶绿素含量达60％的中期衰老叶片；S3表示叶绿素含量达40％的晚期衰老叶片；CK表示ABA处理0分钟的野生型叶片对照。

图6：显示GUS在全长启动子和7个缺失启动子转化植株中的表达情况。图中：y表示绿色成熟叶片；s表示叶绿素含量大约40％的晚期衰老叶片；p39表示转P_SAG39-GUS的转基因植株；f06、f2、f5、f7、f10、f13、f16依次表示的是左引物位置为-62、-239、-493、-719、-1100、-1300、-1600构建融合基因的转基因植株。

图7：显示RT-PCR检测转基因T₂代纯合植株IPT基因表达量。图中：y表示绿色成熟叶片；s表示叶绿素含量大约40％的晚期衰老叶片；ZH11表示野生型中花11对照；ZT1-1、ZT2-1和ZT3-1分别表示3个转P_SAG39-IPT中花11的阳性纯合株系。

图8：P_SAG39-IPT转基因植株的持绿性检测。图中：a表示P_SAG39-IPT转中花11植株抽穗后叶片存活数目统计；b表示P_SAG39-IPT转中花11植株抽穗后倒三叶的持绿度。ZT1-1、ZT2-1和ZT3-1分别表示3个转P_SAG39-IPT中花11的阳性纯合株系；ZT1-2、ZT2-2、ZT3-2分别表示ZT1-1、ZT2-1和ZT3-1所对应的来自于同一个T0代单株的转基因纯合阴性株系。

图9：显示在转基因水稻不同组织中GUS组织染色情况(至少考察15株转基因植株)。图中：a表示叶片；b表示根；c表示茎杆；d表示花；e表示颖壳；f表示种皮；g表示种子；h表示愈伤组织。

图10：P_SAG39-IPT转基因株系ZT1-1和ZT1-2的单株在结实期的田间表型，左图是ZT1-2，右图是ZT1-1。

具体实施方式

实施例1：启动子P_SAG39候选片段的获得

利用生物信息学网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)软件BlastP(Gish等，Identification of proteincoding regions by database similarity search.Nature Genet.1993，3：266-272)搜索拟南芥叶片衰老特异性蛋白SAG12在水稻基因组的最高同源序列，发现其位于日本晴第4染色体的BAC克隆上，克隆号为OSJNBa0052O21，该同源基因编码的蛋白质在NCBI上的登陆号是CAD40026，我们将之对应的基因命名为SAG39，它编码半胱氨酸蛋白酶，与SAG12的蛋白质同源性高达56％。利用植物启动子预测软件TSSP(http://www.softberry.com/berry.phtml？topic＝case_study_plants)预测出SAG39的启动子序列位于ATG上游2.1Kb，将其命名为P_SAG39(见图1)。

实施例2：P_SAG39启动子候选片段和缺失片断的转化载体构建

(1)从日本晴BAC文库(Feng等，Sequence and analysis of rice chromosome 4.Nature，2002，420：316-320)中挑取克隆OSJNBa0052O21，活化培养后抽取其质粒为模板，设计表1的引物，通过PCR扩增全长启动子以及一系列5′缺失片段。PCR反应条件：94℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃2min，30个循环，72℃7min。7个5’缺失片段与全长启动子共用同一个右引物，它们的左引物在染色体上与基因转录起始点的相对位置是：-62、-239、-493、-719、-1100、-1300、-1600，根据其相对位置分别命名为P_SAG39-62、P_SAG39-239、P_SAG39-493、P_SAG39-719、P_SAG39-1100、P_SAG39-1300、P_SAG39-1600，在每条左引物5′端都引入EcoRI酶切位点，右引物5′端引入BglII酶切位点。

(2)收集PCR产物，加入1/10体积的NaAC(3M，pH 5.2)和2倍体积95％乙醇，沉淀DNA；用75％的乙醇洗涤沉淀，沉淀自然风干后加超纯水溶解。纯化产物经用EcoRI/BglII酶切。然后用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司生产)回收。同样EcoRI/Bgl II处理pCAMBIA1301，切除启动gus基因表达的35S启动子，将回收产物构建到酶切后的植物双元Ti质粒载体pCAMBIA1301(该载体商购自CAMBIA公司公开使用的载体，载体含有GUS报告基因)的多克隆位点上，使报告基因GUS在启动子候选片段的直接控制下表达。

(3)将上述构建好的载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105菌株(该菌株商购自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)，构成转化菌株。将构建好的Ti质粒载体通过农杆菌介导的方法(林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28(3)：294-300)转化水稻品种“中花11”。

(4)以质粒psg516(Gan等，Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin.Science.1995，270：1986-1987)为模板，设计引物p39ipt-F(5′cggaattcagatctatggatctgcgtctaattttcgg-3′)和p39ipt-R(5′-aggtaaccctaatacattccgaatggatgac-3′)扩增IPT基因，在左引物5′端引入BglII酶切位点，右引物5′端引入BstEII酶切位点(以下划线指出)，收集PCR产物，以上述同样的方法纯化回收后酶切，连接到P_SAG39-GUS载体中，构建成载体P_SAG39-IPT(图2b)。随后转入农杆菌菌株EHA105，通过农杆菌介导的方法(林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28(3)：294-300)转化水稻品种“中花11”(来自中国农业科学院作物研究所商业经营品种)。PCR反应条件：94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环，72℃7min。

实施例3：农杆菌介导的遗传转化

农杆菌介导的遗传转化方法主要参照本申请人华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28(3)：294-300)。转化受体为水稻品种″中花11″的成熟种子所诱导产生的胚性愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛选得到具有潮霉素抗性的愈伤，再经过分化、生根、练苗和移栽，得到转基因植株。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(按照10X浓缩液配制)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(按照100X浓缩液配制)

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 2.23g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.86g

硼酸(H₃BO₃) 0.62g

碘化钾(KI) 0.083g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.0025g

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

称取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同) 100毫升

N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

2，4-D贮存液(取上述制备好的) 2.5毫升

脯氨酸(Proline) 0.3克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100毫升

N6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

2，4-D贮存液 2.0毫升

脯氨酸 0.5克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5毫升

N6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.15克

蔗糖 5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5毫升

N6mix母液(100X) 0.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5毫升

维生素贮存液(100X) 1毫升

2，4-D贮存液 0.2毫升

CH 0.08克

蔗糖 2克

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25毫升

N6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.625毫升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25毫升

N6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

6-BA贮存液 0.5毫升

KT贮存液 0.5毫升

NAA贮存液 50微升

IAA贮存液 50微升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100毫升

N6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

6-BA贮存液 2毫升

KT贮存液 2毫升

NAA贮存液 0.2毫升

IAA贮存液 0.2毫升

CH 1克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50毫升

MSmix母液(100X) 5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5毫升

维生素贮存液(100X) 5毫升

蔗糖 20克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

3.1愈伤诱导

1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(1500-2000Lux)下培养，培养温度26℃。

3.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照(1500-2000Lux)下培养2-3周，培养温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

实施例4：利用Southernblot确定外源片段是否整合到水稻染色体组上，同时鉴定插入片断的拷贝数。

取转基因植株绿色幼嫩叶片抽提总DNA转膜，以GUS基因序列为探针进行Southern杂交，大样的总DNA提取采用CTAB法(Rogers and Bendich，Extraction of DNA from milligram amounts of fresh，herbariumand mummified plant tissues.Plant Mol Biol，1985，5：69-76)，转膜、Southern杂交参照Zhou等的方法(Zhou等，The defense responsive genes showing enhanced and repressed expression after pathogen infection in rice(Oryza sativa L).2002，Science China(Series C)，45：449-467)。Southern杂交所用的探针是双元载体pCAMBIA1301骨架上的潮霉素基因的部分序列，扩增这段探针的引物是：hpt-F(5′-atttgtgtacgcccgacagt-3′)和hpt-R(5′-ggatatgtcctgcgggtaaa-3′)。检测结果如图4所示，这13株全长启动子的转化单株中T-DNA插入位点都不一样，说明它们发生的转化事件都是独立的；其中1、3、7、9、11号单株是单拷贝插入的，对于后代分离转基因纯合株系非常有利。

实施例5：Northernblot方法分析启动子P_SAG39的时空表达特异性和响应ABA的情况

(1)在中花11分蘖期叶片生长从成熟到逐渐衰老的不同时期(FL，成熟的完全伸展叶片；ES，叶绿素含量达90％的早期衰老叶片；S1，叶绿素含量达70％的早期衰老叶片；S2，叶绿素含量达60％的中期衰老叶片；S3，叶绿素含量达40％的晚期衰老叶片)取叶片抽提总RNA，采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)，提取方法根据该TRIZOL试剂说明书。转模后以GUS基因序列的特异区段为探针进行Northern杂交，鉴定该基因的时空表达模式(见图5a所示)。用来扩增GUS探针的引物是：GUS-F(5′-gggcgaacagttcctgatta-3′)和GUS-R(5′-cgaaatattcccgtgcactt-3′)。

(2)对野生型中花11三叶期幼苗进行脱落酸(ABA，100μM)处理5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时的样品取叶片抽提总RNA转膜，以SAG39基因的特异区段序列为探针进行Northern杂交，鉴定该基因响应衰老诱导剂脱落酸的表达情况(见图5b所示)。用来扩增SAG39特异区段探针的引物是：SAG39-F(5′-acaatgaggctgcccttatg-3′)和SAG39-R(5′-aaaggctcacttgctcatgg-3′)。(3)以上的杂交结果显示：P_SAG39启动子的表达量是很高的，而且在成熟叶片中也表达，当叶片衰老程度到达晚期时表达活性达到高峰期，证明该启动子确实是叶片衰老特异性表达启动子。同时用衰老诱导剂ABA处理野生型中花11时，基因SAG39在30分钟后表达量明显上升，揭示该基因参与ABA信号转导途径。

实施例6：GUS组织染色法分析P_SAG39在各种组织中的表达模式

分别取载体P_SAG39-GUS(其核苷酸序列见序列表SEQ ID：1所示，附图3的结构图所示)遗传转化筛选得到的抗性愈伤组织或者转基因植株根、叶片、叶鞘、茎杆、颖壳、花、种子切成约0.5CM长度的适当大小，浸入约200μl的GUS染液，37℃过夜，然后用75％酒精脱色，观察是否有蓝色出现。染色液的配方参照Jefferson等报道的方法(Jefferson等，GUS fusions：beta-glucuronidase as a sensitive and versatilegene fusion marker in higher plants.EMBO J，1987，6：3901-3907)。结果表明：GUS报告基因在P39植株叶、茎、根、花、颖壳及未成熟种子的种皮、愈伤组织中表达，在成熟种子及胚乳中不表达(图9)，揭示该启动子可以应用于基因工程育种改良研究。

实施例7：利用一系列5′端缺失启动子分析控制衰老特异性的区段

取自然衰老条件下各段缺失启动子(来自于实施例6所示启动子全长的一部分，片段长度见实施例2)转基因植株的绿色叶片(y)和衰老叶片(s)进行Northern杂交，检测GUS的表达情况，探明启动子缺失一段后对其时空特异性活性的影响，RNA的抽提和杂交方法同实施例5。如图6所示，p39表示转P_SAG39的转基因植株，f06、f2、f5、f7、f10、f13、f16依次表示该缺失启动子的左引物位置为-62、-239、-493、-719、-1100、-1300、-1600。杂交结果显示：f5(即P_SAG39-493，该启动子的核苷酸序列见SEQ ID NO：5)和f16(即P_SAG39-1600，该启动子的核苷酸序列见SEQ ID NO：3)与全长启动子的表达模式一致，是衰老上升表达的，而f06、f2、f7、f10、f13没有显示衰老特异性，而且f5的表达强度与全长一样都是这一系列缺失启动子中最强的。这说明在f5下游可能存在着正向调控衰老特异性的顺式作用位点，而fc5上游可能存在抑制衰老特异性的位点，同时f5下游的-493至-239区段可能还含有一些对增强启动子表达起作用的顺式元件。推测f16的下游也可能存在着正向调控衰老特异性的顺式作用位点。

实施例8：鉴定转P_SAG39-IPT家系的持绿性

(1)筛选转基因纯合家系：利用Southern杂交的方法(参照实施例4)挑出外源片段插入是单拷贝的T₀代单株，T₁代分株系种植，种子成熟收获后，每个株系试验20单株，每个单株取50粒种子，去壳后消毒(消毒方法参照实施例3)，放在含50mg/L潮霉素的生根培养基上(该生根培养基的成分参见上述实施例3中9)进行发芽试验，7天后检查发芽情况。同时，以未转基因的种子进行同样的处理作对照。理论上，若消毒的种子在不加潮霉素的条件下具有100％的发芽活力，则在含潮霉素的生根培养基上，阳性纯合转基因单株的发芽率为100％，杂合转基因单株的发芽率为75％左右(如果该株系后代发生异常分离，则发芽率小于75％)，阴性纯合单株的发芽率为0％。因此，如果所接种的50粒种子全部发芽，则为转基因纯合阳性植株，如果部分发芽，则为杂合植株，如果全部不发芽，则为纯合阴性植株。我们筛选得到3个转基因纯合家系，T2代的纯合阳性植株分别命名为ZT1-1、ZT2-1、ZT3-1，它们所对应的来自于同一个T₀代单株的转基因纯合阴性株系命名为ZT1-2、ZT2-2、ZT3-2。

(2)检测外源基因的表达谱：取转基因植株ZT1-1、ZT2-1、ZT3-1的绿色叶片(y)和衰老叶片(s)抽提总RNA，参照Cai的方法(Cai，Isolation and Functional Characterization the pathogen-inducible andtissue-specific expression promoters.(Dissertation for Doctoral Degree).Wuhan：HuaZhong AgriculturialUniversity.2006)反转录成为单链cDNA作为模板，用引物ipt-F(5′-gcctctggtgaagggtatcat-3′)和ipt-R(5′-gcgatcccatgaatcaactta-3′)进行RT-PCR反应，鉴定IPT的表达量。结果显示，IPT基因在衰老混合样品中的表达量要高于绿叶混合样品，证明IPT基因确实在衰老特异性启动子P_SAG39驱动下表达，ZT1-1的表达量最强，而ZT2-1次之，ZT3-1较弱(见图7)。

(3)在抽穗后7、14、21、28、33、38、43、48、52、60天分别用叶绿素测定仪SPAD-502(Minolta CameraCo.，Japan)测定转基因植株倒三叶的叶绿素含量，验证叶片的持绿性发生变化；在抽穗后5、10、15、20、25、30、35、40、45、60天统计转基因植株的存活叶片数目，验证叶片的存活寿命受到影响。结果显示，3个转基因阳性株系倒三叶的持绿度SPAD值从抽穗后20天左右开始下降，而阴性株系从抽穗后14天已经开始下降，且下降速度明显快于阳性株系(图8a)；抽穗后25天阳性株系倒三叶仍是成熟绿叶，很少衰老，而阴性株系的倒三叶部分已经衰老甚至死亡(图8b)。如图10所示(左图是ZT1-2，右图是ZT1-1)，抽穗后转基因阳性株系ZT1-1的乳熟期比转基因阴性株系ZT1-2长。结合图7的结果说明，转P_SAG39-IPT基因植株的持绿性表型是与外源基因的表达量共分离的；同时我们也可以得出结论：转基因植株的持绿性增强确实是由IPT基因在衰老特异性启动子P_SAG39驱动下表达造成的。

表1 扩增启动子全长和缺失片段的引物设计

¹下划线的部分代表EcoRI的酶切位点。

²下划线的部分代表BglII的酶切位点。

序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用

<130>

<141>2008-07-14

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2056

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2056)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(2021)..(2056)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(2056)

<223>

<400>1

ataagagagg gaggcacacg gctgggaggc ctagctgctg agtctatccc cttccaatgg 60

cggcaacact agaggactca cagagcagcg acaaagatgg aggctcagtg tcggcggaag 120

gcttgaccac cgtggctcga cggggtggca tcgccagcgg agccctggac cactgaggca 180

ccgattgcag ggcgacgacg gagctgcgac gctggtggga gtatgcacaa ccagggcgag 240

acggggtagc ggcactggtg gaaaccctgg accaccagga tactgattgc ggtgacgacg 300

gcggcggaag tgcggatgat gacggatggt gcagcagcgt tcaaaggcgc ggcgacggcg 360

ttatcatgat taggggagcc accgcgggat tagcgcgatg gagccttggt ggtccacgcg 420

tggggaattt tgtgagttgc catggcgcga tttgtgtggc cgatggggaa gaccgcggct 480

ccggctgtgg aaggggacga tggcaacgta tgggcggcgg cgtccgggca gcggtggaag 540

ggtacgacgg cggcgtctgg gcggcggcgg aaggggacga cggcggcgtg cgccacgcga 600

ggaggagtga ggaggcgagg aggaggagag ggggagcgaa gcaaggggac gacggcggag 660

cggcgccacg cagggaggag cgaggaggcg aggaggaccg aggcggagtg gaggtagcag 720

cgacgacgct tgggagagag cgtcggatat gaggatttgt cgttgtggcg atgatgcgcg 780

acggattgaa tgcggcggag gcgaggtgcg cggcagagat ggcgcatgcg gagtaatcgc 840

gcgtggacgg tggagaggat aaggtcgcta taatcgttgg aatcggtgga gcgaggagga 900

tagcgaaacg aattagatga gatgagatgg tagatggacg gatgagatgg gaggaggtga 960

tttcacctgt aggattgcta gacacaactt atacttttta tattagtata gatagaccag 1020

agactgacag atgtgctctc tatgccctcc acctgctgct ggcccaaata tccaacagcg 1080

agagaacaaa atctacatta attttattac ggcaaggaga aattctcttt gattacatcg 1140

atttggtgga ctcatgtaga gttaaaagta ctctagtaat ttggttggga gtaacgttaa 1200

tctggttaat ttcgattaag agcaaccaaa atactgtatt ttctctctgt aaaaaaactc 1260

caaaaataca ttttttttaa tttgagaaac aacattacaa acgtagatac tcacaataca 1320

catacaccca tataaacgca catatacacc caacctttat tagcacctcg aaaagactga 1380

acttgtatat cttgagagtg ataaagttat ctctagcacc tcgttgttaa taagtacgtc 1440

gcctagaatt gaaaaaaata attagccgta aatacgagta ctcaaaatat attgtactcc 1500

atgttctatc tattatatgc aatacaacta ttttcagtta tgttatccta aattcgattg 1560

ccccaatgtg caaaactctc cataggataa acacatcact ctaatcctcc attacctatg 1620

ataaacacat tcattccgtg tgaaccacgt ctcatttagc cacacattca ccaaggcaaa 1680

tttggagcac tcaaattcca attttgtatt catattccca ttcaacaaac ccccacagca 1740

taatttaaaa tgtaggcgtc tgtgttctgc aggaaacgta cgtcctatgc acaataattt 1800

atttatacgc gtatatactt cacggctacg cagactgccg tttacacaga aacacaacat 1860

cgtacacgca ccgtatgtgc ttacataagt tcgtaccact gactatatat accaatgcat 1920

cctagttcca attcaccaaa ccaaaagcag agttcacaga agcagcagca gagcagcaac 1980

caacagcagc tggatcacag gtcacaaagc ctgatcgacc atg gcc atg gcc aag 2035

Met Ala Met Ala Lys

1 5

gct ctg ctc ttc gcc atc ctc 2056

Ala Leu Leu Phe Ala Ile Leu

10

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ala Met Ala Lys Ala Leu Leu Phe Ala Ile Leu

1 5 10

<210>3

<211>1638

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1638)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1638)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1603)..(1638)

<223>

<400>3

cgtggggaat tttgtgagtt gccatggcgc gatttgtgtg gccgatgggg aagaccgcgg 60

ctccggctgt ggaaggggac gatggcaacg tatgggcggc ggcgtccggg cagcggtgga 120

agggtacgac ggcggcgtct gggcggcggc ggaaggggac gacggcggcg tgcgccacgc 180

gaggaggagt gaggaggcga ggaggaggag agggggagcg aagcaagggg acgacggcgg 240

agcggcgcca cgcagggagg agcgaggagg cgaggaggac cgaggcggag tggaggtagc 300

agcgacgacg cttgggagag agcgtcggat atgaggattt gtcgttgtgg cgatgatgcg 360

cgacggattg aatgcggcgg aggcgaggtg cgcggcagag atggcgcatg cggagtaatc 420

gcgcgtggac ggtggagagg ataaggtcgc tataatcgtt ggaatcggtg gagcgaggag 480

gatagcgaaa cgaattagat gagatgagat ggtagatgga cggatgagat gggaggaggt 540

gatttcacct gtaggattgc tagacacaac ttatactttt tatattagta tagatagacc 600

agagactgac agatgtgctc tctatgccct ccacctgctg ctggcccaaa tatccaacag 660

cgagagaaca aaatctacat taattttatt acggcaagga gaaattctct ttgattacat 720

cgatttggtg gactcatgta gagttaaaag tactctagta atttggttgg gagtaacgtt 780

aatctggtta atttcgatta agagcaacca aaatactgta ttttctctct gtaaaaaaac 840

tccaaaaata catttttttt aatttgagaa acaacattac aaacgtagat actcacaata 900

cacatacacc catataaacg cacatataca cccaaccttt attagcacct cgaaaagact 960

gaacttgtat atcttgagag tgataaagtt atctctagca cctcgttgtt aataagtacg 1020

tcgcctagaa ttgaaaaaaa taattagccg taaatacgag tactcaaaat atattgtact 1080

ccatgttcta tctattatat gcaatacaac tattttcagt tatgttatcc taaattcgat 1140

tgccccaatg tgcaaaactc tccataggat aaacacatca ctctaatcct ccattaccta 1200

tgataaacac attcattccg tgtgaaccac gtctcattta gccacacatt caccaaggca 1260

aatttggagc actcaaattc caattttgta ttcatattcc cattcaacaa acccccacag 1320

cataatttaa aatgtaggcg tctgtgttct gcaggaaacg tacgtcctat gcacaataat 1380

ttatttatac gcgtatatac ttcacggcta cgcagactgc cgtttacaca gaaacacaac 1440

atcgtacacg caccgtatgt gcttacataa gttcgtacca ctgactatat ataccaatgc 1500

atcctagttc caattcacca aaccaaaagc agagttcaca gaagcagcag cagagcagca 1560

accaacagca gctggatcac aggtcacaaa gcctgatcga cc atg gcc atg gcc 1614

Met Ala Met Ala

1

aag gct ctg ctc ttc gcc atc ctc 1638

Lys Ala Leu Leu Phe Ala Ile Leu

5 10

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>4

Met Ala Met Ala Lys Ala Leu Leu Phe Ala Ile Leu

1 5 10

<210>5

<211>494

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(494)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(494)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(459)..(494)

<223>

<400>5

ccaatgtgca aaactctcca taggataaac acatcactct aatcctccat tacctatgat 60

aaacacattc attccgtgtg aaccacgtct catttagcca cacattcacc aaggcaaatt 120

tggagcactc aaattccaat tttgtattca tattcccatt caacaaaccc ccacagcata 180

atttaaaatg taggcgtctg tgttctgcag gaaacgtacg tcctatgcac aataatttat 240

ttatacgcgt atatacttca cggctacgca gactgccgtt tacacagaaa cacaacatcg 300

tacacgcacc gtatgtgctt acataagttc gtaccactga ctatatatac caatgcatcc 360

tagttccaat tcaccaaacc aaaagcagag ttcacagaag cagcagcaga gcagcaacca 420

acagcagctg gatcacaggt cacaaagcct gatcgacc atg gcc atg gcc aag gct 476

Met Ala Met Ala Lys Ala

1 5

ctg ctc ttc gcc atc ctc 494

Leu Leu Phe Ala Ile Leu

10

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>6

Met Ala Met Ala Lys Ala Leu Leu Phe Ala Ile Leu

1 5 10

Claims

1.一种适用于水稻的叶片衰老特异性表达的启动子P_SAG39，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

2.一种适用于水稻的叶片衰老特异性表达的启动子P_SAG39-1600，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO：3所示。

3.一种适用于水稻的叶片衰老特异性表达的启动子P_SAG39-493，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO：5所示。

4.权利要求1-3任一项所述的启动子在水稻改良中的应用。