WO2010015147A1 - 水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用 - Google Patents

水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用 Download PDF

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WO2010015147A1
WO2010015147A1 PCT/CN2009/000877 CN2009000877W WO2010015147A1 WO 2010015147 A1 WO2010015147 A1 WO 2010015147A1 CN 2009000877 W CN2009000877 W CN 2009000877W WO 2010015147 A1 WO2010015147 A1 WO 2010015147A1
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promoter
expression
gene
transgenic
rice
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PCT/CN2009/000877
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林拥军
刘莉
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华中农业大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8266—Abscission; Dehiscence; Senescence

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of plant genetic engineering and rice molecular breeding, and specifically relates to the cloning of a rice promoter specifically induced expression of leaf senescence and its application in transgenic rice. Background technique
  • Rice is one of the most important food crops for humans. Although the promotion of hybrid rice has temporarily solved the human food crisis, there are some important defects in some excellent hybrid rice combinations widely used in production: the early premature senescence of leaves during the late growth period leads to the decrease of photosynthetic capacity, and the lack of large sources. The problem of low seed setting rate and poor solidity.
  • the leaves are important places for plants to carry out photosynthesis, absorb water and co 2 to generate energy, and are also plants for the synthesis of amino acids, antioxidants and various nutrients in plants. Once the leaves are senescent, their photosynthetic capacity will decrease significantly, so crop yield is largely affected by leaf senescence.
  • the leaves are able to maintain a healthy and green state for a long period of time in the middle and late stages of reproductive growth, it is important to maintain photosynthetic capacity as long as possible, and to enhance nutrient output capacity during grain filling, improve grain plumpness, and increase yield. significance.
  • Cytokinins can inhibit the activity of ribonuclease, deoxyribonuclease, protease, etc., delay the degradation of nucleic acids, proteins, chloroplasts, etc., and promote the movement of nutrients to the application site.
  • the isoprene synthase gene/ ⁇ encodes a key rate-limiting enzyme that regulates cytokinin synthesis.
  • the present invention utilizes a molecular biology method to clone a leaf senescence-specific promoter from a rice Japanese BAC library, and introduces the promoter gene fusion reporter gene GUS into a rice plant to verify its expression pattern and identify specificity. Expression segment; The promoter-driven/gene expression system was constructed, and the homozygous transgenic family was screened to confirm that the transgenic line expressing the system was green. Summary of the invention
  • the object of the present invention is to overcome the deficiencies of the prior art, and to isolate and identify promoters with leaf senescence specificity from the BAC library of Nipponbare, and to use these promoters for genetic engineering improvement of rice, with the ultimate goal of improving rice yield. .
  • P SACI39, P SA «9. 16 00 and PSAG3W93 these three core contains specific area, but the total length of different promoters.
  • the fusion gene constructed by these promoters was introduced into rice to obtain an improved green-transgenic transgenic rice plant.
  • the present invention is implemented as follows:
  • the promoter of leaf senescence-specific expression was identified and cloned from the rice Japanese BAC library (Feng et al, Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature, 2002, 420: 316-320), and the applicant named it P SA G 39 , P SA c 39 . 16 o ⁇ ) and
  • the promoter sequence has the following characteristics:
  • the expression of the GUS reporter gene in transgenic rice is driven by the P SAC539- Gt/S vector constructed by the promoter, and it is found that the promoter has a certain expression in mature rice leaves,
  • the expression level of the leaf gradually increased after the senescence of the leaf was deepened.
  • the expression activity reached its peak.
  • abscisic acid (ABA) for 30 minutes, the expression of the promoter increased significantly and reached at 2 hours.
  • the promoter is expressed in the seed coat and callus of leaves, stems, roots, flowers, hulls and immature seeds, but not in mature seeds and endosperm.
  • the promoter P SAC;39 driving / ⁇ gene expression in the transgenic family further study the leaf greening change of the positive transgenic rice transgenic to the PSAC ⁇ -// ⁇ expression system, and found that the greenness was enhanced, and this phenotype was The amount of expression of the foreign gene / is co-segregated.
  • the promoter P SAG39 _ 16()( ) sequence which is the sequence shown in SEQ ID NO: 3 of the Sequence Listing, is a 1600 bp sequence of the core region truncated by the promoter P SAG39 .
  • Said promoter PSAG3 93 The sequence, which is the sequence shown in SEQ ID NO: 3 of the Sequence Listing, is it? The 5/ ⁇ 39-16()( ) core region is further truncated by the sequence of 493 1 ⁇ . These two segments not only have the function of independently initiating gene expression, but also have the same expression pattern as PSAG39 in senescent leaves.
  • a promoter fragment named PSAG39 was amplified by PCR from the Nipponbare BAC clone OSJNBa0052O21 by specific primers.
  • the promoter P SA (339 candidate fragment and the reporter GUS coding sequence were constructed into a fusion gene and Loading into a binary Ti vector, assembling into a P SAG39 -GC /S vector, and then transferring the reporter gene constructed by the candidate fragment into the rice receptor by Agrobacterium-mediated transgenic method to obtain a transgenic plant; Northern blot analysis was carried out to investigate the expression changes of the promoter at different stages of leaf development, and then the promoter was verified and cloned.
  • transgenic plants were obtained; the single-copy inserted transgenic homozygous family was propagated and screened, and the detection/ ⁇ was detected by RT-PCR method in the transgenic family, and the leaves of the positive transgenic homozygous family were enhanced in greenness.
  • the present invention identifies a promoter PSA (539 and core structure) specifically expressed by leaf senescence, and provides a new promoter-specific promoter resource for genetic engineering and molecular breeding.
  • the present invention can be directly applied to the identification and cloning of a rice-specific aging-inducible expression promoter.
  • the promoters P SAC339 , P SAG39 - 160 o and P SAG39 ⁇ 93 provided by the present invention construct an expression vector of an anti-aging-related gene to transform plants to enhance the anti-aging property of plants, including rice plants and other crops, for example. Corn, wheat, cotton, rape or tomato.
  • SEQUENCE LISTING SEQ ID NO: 1 a nucleotide sequence of a rice leaf senescence-specific-inducible expression promoter comprising a 5'-end partial coding sequence of the SAG39 gene is disclosed.
  • SEQ ID NO: 3 is a nucleotide sequence obtained from the cloning of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as another promoter, and has a length of 1637 bp.
  • SEQ ID NO: 5 is a nucleotide sequence obtained from the cloning of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as another promoter, and has a length of 494 bp.
  • Figure 1 shows the cis-acting element of the & 4GJi> gene promoter region.
  • the shade shows the basic promoter sequence; the double underlined sequence is the primer sequence used to amplify the SAG39 gene promoter; the single underlined sequence is the predicted gene translation initiation site; the predicted transcription start site is indicated by a text box.
  • the base number here is +1; the sequence number upstream of it is negative, and the sequence number downstream thereof is positive; the translation start site ATG is indicated by a shaded text box.
  • Figure 2 Schematic diagram showing the structure of the binary vector pCAMBIA 1301.
  • Figure 3 shows the constructed expression vector with pCAMBIA 1301 as the backbone.
  • a shows an expression vector for fusion Gt/S (also representing the expression vector of PSAG39-1600 or P S AG39>493 fusion GUS, the relative positions of the two cleavage sites on the vector Same as PSAG39);
  • b shows the expression vector for P SAG39 fusion IPT.
  • PSAG39 is the X4G3i> promoter sequence
  • EcoRl, Bgl ll is the restriction endonuclease site used to introduce PSAG39 into PCAMIA1301
  • Bst W is the restriction endonuclease site used to introduce IPT into P SAG39- Gf/S
  • LB RB is the left and right borders of T-DNA in pCAMIA1301
  • Hp/ is the hygromycin resistance screening gene
  • g is the reporter gene GUS ( ⁇ -glucuronidase)
  • Nos polyA is the nopaline synthase gene. Polyadenylation sequence.
  • Figure 4 shows the copy number of exogenous fragments in P SAG39 -Gi/S transgenic plants.
  • M represents ⁇ - ⁇ ) ⁇ 14 ⁇ ; 1 ⁇ 12 represents a transgenic plant; CK represents a wild-type plant.
  • Figure 5 shows the expression of GUS as a function of leaf senescence and ABA-induced expression of the gene SAG39 in wild-type plants.
  • FL indicates mature fully extended leaves
  • ES indicates early senescent leaves with chlorophyll content up to 90%
  • S 1 indicates early senescent leaves with chlorophyll content up to 70%
  • S2 indicates intermediate senescent leaves with chlorophyll content up to 60%
  • S3 indicates Late senescent leaves with a chlorophyll content of 40%
  • CK indicates a wild-type leaf control with ABA treatment for 0 minutes.
  • Figure 6 shows the expression of GUS in the full length promoter and 7 deletion promoter transformed plants.
  • y indicates green mature leaves;
  • s indicates late senescent leaves with chlorophyll content of approximately 40%;
  • p39 indicates transgenic plants transfected with P SAC39- GC/S;
  • f06, . , f5, f7, fl 0, fl 3, and fl 6 sequentially represent transgenic plants in which the left primer positions are -62, -239-493, -719, -1 100, -1300, -1600 to construct a fusion gene.
  • Figure 7 shows RT-PCR detection of transgenic T 2 generation homozygous plants / gene expression levels.
  • y indicates green mature leaves;
  • s indicates late senescent leaves with chlorophyll content of about 40%;
  • ⁇ 11 indicates wild type medium flower 1 1 control;
  • ZT1 -1, ZT2-1 and ZT3-1 indicate 3 turns ⁇ 5 ⁇ ( 339 -/ > Positive homozygous strain of Suizhonghua 11.
  • Figure 8 Greenness detection of transgenic plants.
  • a indicates ⁇ 5 ⁇ (339 -/ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 11 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 339 3
  • Figure 9 shows GUS tissue staining in different tissues of transgenic rice (at least 15 transgenic plants were examined).
  • a denotes a blade
  • b denotes a root
  • c denotes a stem
  • d denotes a flower
  • e denotes a glume
  • f denotes a seed coat
  • g denotes a seed:
  • h denotes a callus tissue.
  • Figure 10 Field phenotype of ⁇ 5 ⁇ (339 -/ ⁇ transgenic lines ZT1 -1 and ZT1-2 in the fruiting stage, the left picture is ZT1 -2, and the right picture is ⁇ 1-1.
  • OSJNBa0052O21 the accession number of the protein encoded by this homologous gene on NCBI Is CAD40026, we named the corresponding gene & 4G_39, which encodes a cysteine protease with a protein homology of 56% with SAG12.
  • TSSP plant promoter prediction software
  • the clone OSJNBa0052O21 was picked from the Japanese clear BAC library (Feng et al, Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature, 2002, 420: 316-320), and the plasmid was used as a template after activation culture, and the primers of Table 1 were designed.
  • PCR A full length promoter and a series of 5' deletion fragments were amplified. PCR reaction conditions: 94 ° C 5 min, 94 lmin, 58 ° C ⁇ ⁇ min, 72 'C 2 min, 30 cycles, 72 'C 7 min.
  • the 7 5' deletion fragments share the same right primer as the full-length promoter, and their left primers are relative to the gene transcription start point on the chromosome: -62, -239, -493, -719, -1100, - 1300, -1600, according to their relative position, another 1 J is named as PsAG39-239, PsAG39-493 PsAG39-719 PsAG39-1100, PsAG39-1300, PsAG39-1600' introduced a & 0 RI restriction site at the 5' end of each left primer and a Bg!U enzyme at the 5' end of the right primer. Cut the spot.
  • the PCR product was collected by adding 1/10 volume of NaAC (3M, pH 5.2) and 2 volumes of 95 °/. Ethanol, precipitated DNA; The precipitate was washed with 75% ethanol, and the precipitate was naturally air-dried and then dissolved in ultrapure water. The purified product was digested with £ C0 RI / /II. Then, it was recovered by U IQ-10 column DNA gel recovery kit (manufactured by Shanghai Shenggong Bioengineering Technology Service Co., Ltd.).
  • Eco should treat PCAMBIA1301 with gl II, excise the 35S promoter which initiates expression of gus gene, and construct the recombinant product into the digested plant binary Ti plasmid vector pCAMBIA1301 (the carrier is commercially available from CAMBIA, the vector contains GUS).
  • the reporter gene GUS is expressed under the direct control of the promoter candidate fragment.
  • the above-described constructed vector was introduced into an Agrobacterium tumefaciens strain Agrobacterium tumefaciens £H4 05 (commercially available from the Agrobacterium strain publicly used by CAMBIA Co., Ltd.) to constitute a transformed strain.
  • the constructed Ti plasmid vector was transformed into a rice variety by Agrobacterium-mediated method (Lin Yongjun et al., Agrobacterium-mediated establishment of a high-efficiency transgenic system of Mudanjiang No. 8, Journal of Crop Science, 2002, 28 (3 ): 294-300). In the flower 11".
  • Primer p39ipt-F (5'-cggaattcagatctatggatctgcgtctaattttcgg-3') and p39ipt- were designed using plasmid psg516 (Gan et al, Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science. 1995, 270: 1986-1987) as a template.
  • Agrobacterium strain EHAW5 was transferred to Agrobacterium strain EHAW5, and transformed into rice varieties by Agrobacterium-mediated method (Lin Yongjun et al., Agrobacterium-mediated establishment of high-efficiency transgenic system of Mudanjiang No. 8, Journal of Crop Science, 2002, 28 ( 3 ): 294-300) " ⁇ 11" (commercial management variety from the Crop Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences).
  • PCR reaction conditions 94 ° C 5 min, 94 ° C lmin, 55 'C lmin, 72 ° C lmin, 30 cycles, 72. C 7min.
  • the Agrobacterium-mediated genetic transformation method mainly refers to the method described in the "Agrobacterium-mediated Genetic Transformation Operation Manual" published by the National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement of Huazhong Agricultural University (Lin Yongjun et al., Agrobacterium-mediated Mudanjiang Establishment of the No. 8 ⁇ ⁇ transgenic system, Acta Agronomica Sinica, 2002, 28 (3 ): 294-300 )o
  • the transformed receptor is an embryogenic callus induced by mature seeds of the rice variety "Zhonghua 11". After pre-cultivation, infestation, co-cultivation and screening, the callus with hygromycin resistance is obtained, and then the transgenic plants are obtained by differentiation, rooting, seedling and transplanting.
  • the main steps of the genetic transformation of the present invention, the medium and the method of its preparation are as follows:
  • the abbreviations of the phytohormone used in the medium of the present invention are as follows: 6-BA (6-BenzylaminoPurine, 6-benzyl adenine); CN (Carbenicillin, carbenicillin); KT (Kinetin, kinetin): NAA ( Napthalene acetic acid, naphthaleneacetic acid); IAA (lndole-3 -acetic acid, noisy acetic acid;); 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid); AS (Acetosringone , acetosyringone); CH (Casein Enzymatic Hydrolysate, hydrolyzed casein); HN (Hygromycin B, hygromycin); DMSO (Dimethyl Sulfoxide, dimethyl sulfoxide); N6max (N6 large elemental solution); N6mix (N6 Trace element solution); MSmax (MS large element solution); MSmix (MS trace
  • the above reagents were dissolved one by one, and then made up to 1000 ml with distilled water at room temperature.
  • Vitamin solution prepared according to 100X concentrate
  • Vitamin Bl Thiamine HC1 0.1 g
  • Vitamin B6 Pyridoxine HC1 0.1 g
  • Nitric acid hinge (NH 4 N0 3 ) 16.5 g
  • the above reagent was dissolved at room temperature and made up to 1000 ml with distilled water.
  • Manganese sulfate (MnS0 4 ' 4H 2 0) 2.23 g
  • Zinc sulfate (ZnS0 4 '7H 2 0) 0.86g
  • the above reagent was dissolved at room temperature and made up to 1000 ml with distilled water.
  • NAA naphthaleneacetic acid
  • Fe 2+ EDTA stock solution (take 100X concentrate prepared, the same below) 10 ml
  • Vitamin storage solution (take 100X concentrate prepared, the same below) 10 ml
  • Phytagel 3g Add distilled water to 900 ml, adjust the pH to 5.9 with IN potassium hydroxide, boil and dilute to 1000 ml, dispense into a 50 ml flask (25 ml / bottle), seal, and sterilize as described above.
  • Vitamin Storage Solution (100X) 2.5 ml
  • Vitamin stock solution (100X) 1 ml
  • Distilled water was added to 900 ml, and the pH was adjusted to 5.8 with 1 N potassium hydroxide.
  • the inoculated medium was cultured in the dark for 4 weeks at a temperature of 25 ⁇ 1 °C.
  • a compact and relatively dry embryogenic callus was selected and cultured in the dark on a pre-culture medium for 2 weeks at a temperature of 25 ⁇ 1 'C.
  • Example 4 Southern blot was used to determine whether the foreign fragment was integrated into the rice genome, and the copy number of the inserted fragment was identified.
  • the total DNA was transferred from the green and young leaves of the transgenic plants, and the hybridization was carried out by using the GUS gene sequence as a probe.
  • the total DNA extraction of the whole sample was performed by CTAB method (Rogers and Bendich, Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium). And mummified plant tissues. Plant Mol Biol, 1985, 5: 69-76), transfer membrane, Southern hybridization, reference to Zhou et al. (Zhou et al, The defense responsive genes showing enhanced and repressed expression after pathogen infection in rice (Oryza sativa L 2002. Science China (Series C), 45: 449-467).
  • the probe used for Southern hybridization is a partial sequence of the hygromycin gene on the backbone of the binary vector PCAMB1A1301.
  • the primers for amplifying this probe are: hpt-F (5'-atttgtgtacgcccgacagt-3') and hpt-R (5 '- ggatatgtcctgcgggtaa-3 ' ) »
  • the T-DNA insertion sites of the 13 full-length promoters were different, indicating that the transformation events they occurred were independent;
  • the single plants of 1, 3, 7, 9, and 11 were inserted in a single copy, which is very advantageous for the isolation of transgenic homozygous lines in the offspring.
  • Example 5 Northern blot analysis of promoter P SAC ; 39 spatiotemporal expression specificity and response to ABA
  • GUS-F (5'-gggcgaacagttcctgatta -3')
  • GUS-R 5'-cgaaatattcccgtgcactt-3'
  • Example 6 Analysis of the expression pattern of AC39 in various tissues by GUS tissue staining
  • Example 7 Analysis of senescence-specific segments using a series of 5'-end deletion promoters
  • the promoter of each segment was deleted (from the full length of the promoter shown in Example 6, the length of the fragment is shown in Example 2).
  • the green leaf (y) and the senescent leaf (s) of the transgenic plant were subjected to Northern hybridization.
  • the expression of GUS was examined, and the effect of the promoter on the space-time specific activity after the deletion of the promoter was examined.
  • the RNA extraction and hybridization method was the same as in Example 5.
  • p39 represents a transgenic plant transfected with P SAG39
  • fD6, ⁇ , f5, ⁇ , fl0, fl3, and fl6 sequentially indicate that the left primer positions of the deleted promoter are -62, -239, -493, -719, -1100, -1300, -1600.
  • f5 ie P S AG39493, the nucleotide sequence of the promoter is shown in SEQ ID NO: 5
  • fl6 ie P S AG39-1600, the nucleotide sequence of the promoter is shown in SEQ ID NO: 3
  • the expression pattern of the full-length promoter which is expressed by aging
  • ⁇ 06, ⁇ , f7, fl0, fl3 do not show senescence specificity
  • the expression intensity of f5 is the same as the full length of this series of deletion promoters. The strongest of them.
  • Example 4 Screening of transgenic homozygous families: Using the method of Southern hybridization (refer to Example 4), the exogenous fragment insertion is a single copy of the To-generation single plant, the ⁇ sub-strain is planted, and after the seeds are matured, each strain is Test 20 plants, 50 seeds per plant, disinfected after shelling (see Example 3 for disinfection method), and placed on rooting medium containing 50 mg/L hygromycin (see the ingredients of the rooting medium) In the above Example 3, 9) was subjected to a germination test, and after 7 days, the germination was examined. At the same time, the same treatment was carried out with untransgenic seeds as a control.
  • the germination rate of the positive homozygous transgenic plants on the rooting medium containing hygromycin is 100%, heterozygous
  • the germination rate of the transgenic plants was about 75% (if the offspring of this line were abnormally separated, the germination rate was less than 75%), and the germination rate of the negative homozygous plants was 0%. Therefore, if all 50 seeds inoculated are germinated, they are homozygous positive plants, and if they are partially germinated, they are heterozygous plants, and if they do not germinate, they are homozygous negative plants.
  • transgenic homozygous families We screened 3 transgenic homozygous families, and the T 2 generation homozygous positive plants were named ⁇ 1-1, ⁇ 2- ⁇ ZT3-1, and they corresponded to the same ⁇ .
  • the transgenic homozygous negative lines of the individual plants were named as ⁇ 1-2, ⁇ 2-2.
  • Vector Name Primer Name Forward Primer (5'-3') 1 Reverse Primer (5'-3') 2
  • Vector name Primer name Forward primer (5'-3'V Reverse prime ') 2
  • the underlined portion represents the restriction site of ⁇ oRI.
  • Part B g ni represent the underlined restriction sites.

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Description

水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用 技术领域
本发明属于植物基因工程和水稻分子育种技术领域， 具体涉及到一个叶片衰老特异诱导表达的 水稻启动子的克隆及其在转基因水稻中的应用。 背景技术
水稻是人类最重要的粮食作物之一。 虽然目前杂交稻的推广暂时解决了人类的粮食危机， 但是 目前生产上广泛使用的一些优良杂交稻组合存在着一个重要的缺陷： 生育后期叶片易早衰， 导致光 合能力降低， 库大源不足， 造成结实率低、 充实度不良的问题。 叶片是植物进行光合作用， 吸收水 和 co2产生能量的重要场所， 也是植物体合成氨基酸、 抗氧化剂、 各种营养物质的工厂。一旦叶片 衰老， 其光合能力将显著下降， 因而作物的产量很大程度上受到叶片衰老的影响。 如果在生殖生长 中后期， 叶片能够保持较长时间的健康持绿状态， 能尽量持久地保持光合能力， 并且增强它在籽粒 充实期间的营养物质输出能力， 改善籽粒充实度， 提高产量有重要的意义。
植物自身细胞核基因如何调控衰老进程， 其中的分子机制尚不明确。 传统的方法往叶片上喷洒 激素如细胞分裂素， 或是在作物结实期适当追加氮肥， 都可一定程度的延缓衰老。 随着生物技术的 发展， 在培育持绿性水稻的策略中， 采用分子遗传调控的手段来延缓叶片衰老是一条经济有效且保 护环境的措施。 这主要是基于激素生理学， 运用转基因手段， 增强细胞分裂素在植物体内表达来延 缓衰老。 细胞分裂素是植物衰老调节研究最多的一种天然激素。 细胞分裂素调控植物细胞分裂和分 化， 控制植物生长发育的多种进程， 茎和芽的生长、 营养信号的传导、 增加作物产量等。 细胞分裂 素能够抑制核糖核酸酶、 脱氧核糖核酸酶、 蛋白酶等的活性， 能延缓核酸、 蛋白质、 叶绿体等的降 解并且促使营养物质向应用部位移动。 异戊二烯合成酶基因 /ΡΓ编码调节细胞分裂素合成的关键限 速酶， 利用从根癌农杆菌中分离的 / 基因， 人们在叶片抗衰老基因工程研究中开展了大量的工作， 培育了一些持绿性植物 (Smigocki, Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene. Plant Mol Biol, 1991, 16: 105-115； Li等, Genome-wide transcription analyses in rice using tiling microarrays. Nat Genet, 2006, 38: 124-129； Gan and Amasino, Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 1995, 270: 1966-1967； Mc enzie, Controlled Cytokinin Production in Transgenic Tobacco Using a Copper-Inducible Promoter. Plant Physiol, 1998, 116: 969-977； Lin等, Cultivating rice with delaying leaf- senescence by PSAGi2-ipt gene transformation. Acta Bot Sin, 2002， 44: 1333-1338； Chang等， Overproduction of Cytokinins in Petunia Flowers Transformed with PSAGI2-IPT Delays CorollaSenescence and Decreases Sensitivity to Ethylene. Plant Physiol, 2003, 132: 2174-2183； Huynh等， Regulation of flooding tolerance of SAG 12: ipt Arabidopsis plants by cytokinin. J Exp Bot, 2005, 56: 1397-1407； Calderini等， Delay of leaf senescence in Medicago sativa transformed with the ipt gene controlled by the senescence-specific promoter SAG 12. Plant Cell Reports, 2007, 26: 611-615)。 在这些研究中， 早期利用的是表达量比较高的组成型启动子， 如 CaMV35S启动子或玉米 Ubiquitin启动子， 结果显示组成型过量表达 IPT的转基因植株均表现为 细胞分裂素含量增加， 叶片衰老延迟， 同时植株的生长发育形态也发生了许多不正常的变化， 如叶 片变小、叶型变圆，顶端优势丧失，不能形成根或形成的根不能伸长等，后来利用热激启动子 Phsp70 和铜诱导型特异启动子， 发现转基因植株的侧芽和叶片数都明显增多。 直到利用拟南芥衰老特异基
9 本 因 的启动子表达 IPT转化烟草， 取得了比较理想的效果， 转基因烟草叶片和花的衰老明显延 迟， 开花数提高 60%， 种子产量提高 50% , 生物学产量提高 40 %。 转化拟南芥、 矮牵牛等同样达 到延缓衰老的效果， 开花数目亦有所增加， 并且抗涝、 抗旱性有所增强。 但是该体系在水稻这个禾 本科植物中的应用受到物种差异的影响， 只起到了持绿的效果， 没有增加光合产物。 找到一个水稻 来源的启动子在特定时期特定组织中高效特异的表达细胞分裂素将对培育持绿性高产水稻具有重要 作用和意义。
计算机和网络技术的发展给生物信息学的研究注入新的活力， 大量数据库的建立为启动子的预 测及鉴定带来方便， 2008年建立了最新的真核启动子的数据库。 克隆启动子并通过报告基因来定性 或定量的分析启动子活性的技术很成熟。 人们已经成功分离并验证了大量组成型或特异型表达的启 动子， 通过缺失分析、 酵母单杂交、 凝胶阻滞实验、 DNase l足迹实验等技术鉴定了启动子 DNA上 反式作用蛋白结合的位点， 探明一批对组织或时空表达起调控作用的顺式作用元件（ hodakovskaya 等， Enhanced cold tolerance in transgenic tobacco expressing a chloroplast ω-3 fatty acid desaturase gene under the control of a cold-inducible promoter. Planta, 2006, 223: 1090-1100； Cai等， Identification of novel pathogen-responsive cis-elements and their binding proteins in the promoter of OsWRKY 13, a gene regulating rice disease resistance. Plant Cell Environ, 2008, 31 : 86-96； Hua等， Analysis of rice genes induced by striped stemborer (Chilo suppressalis) attack identified a promoter fragment highly specifically responsive to insect feeding. Plant Mol Biol, 2007, 65: 519-530； Saha 等, Characterization of vascular-specific RSsl and rolC promoters for their utilization in engineering plants to develop resistance against hemipteran insect pests. Planta, 2007, 226: 429-442 ) 。 本发明就是利用有关分子生物学方法， 从水稻日本晴 BAC文库中克隆得到一个叶片衰老特异诱导表达的启动子，将该启动子基因融合报告 基因 GUS导入水稻植株中， 验证其表达模式， 鉴定特异性表达区段； 构建该启动子驱动 / 基因的 表达系统， 筛选纯合转基因家系， 证实表达该系统的转基因家系具有持绿性。 发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，从水稻日本晴 BAC文库中分离并鉴定出具有叶片衰老 特异性的启动子， 并将这些启动子用于水稻的基因工程改良， 最终目的是提高水稻单产。 为了便于 利用，我们创建了 PSACI39、 PSA«9.1600和 PSAG3W93这 3个包含了核心特异性区但总长度不同的启动子。 将这些启动子构建的融合基因导入水稻， 从而获得改良的持绿性增强的转基因水稻植株。
本发明是这样实现的：
从水稻日本晴 BAC文库（Feng等， Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature, 2002, 420: 316-320 )中鉴定和克隆得到的叶片衰老特异表达的启动子， 申请人将其命名为 PSAG39、 PSAc39.16o<)和
PSAG39-493 所述的启动子 PSA<B9序列， 它是序列表 SEQ ID NO: 1所示的序列。 该启动子序列具有以 下特征： 通过利用该启动子所构建的 PSAC539-Gt/S载体驱动 GUS报告基因在转基因水稻中的表达， 发现该启动子在成熟的水稻叶片中有一定的表达， 随着叶片衰老程度加深其表达量逐步变强， 当叶 片衰老程度到达晚期时表达活性达到顶点； 用衰老诱导剂脱落酸（ABA )处理 30分钟后， 该启动子 表达量明显上升， 在 2小时达到最髙峰； 该启动子在叶、 茎、 根、 花、 颖壳及未成熟种子的种皮、 愈伤组织中表达， 而在成熟种子及胚乳中不表达。 利用启动子 PSAC;39驱动 / Γ基因在转基因家系中 表达， 进一步研究转 PSAC^-//^表达系统的阳性转基因水稻的叶片持绿性变化， 发现持绿性增强， 且这个表型与外源基因 / 的表达量是共分离的。 所述的启动子 PSAG39_16()()序列， 它是序列表 SEQ ID NO: 3所示的序列，是由启动子 PSAG39截短的核心区 1600 bp的序列。所述的启动子 PSAG3 93 序列， 它是序列表 SEQ ID NO: 3所示的序列， 是由？5/^39-16()()核心区进一步截断的493 1^的 序列。 这两个区段不仅具有独立的启动基因表达的功能， 而且在衰老的叶片中表达模式与 PSAG39 相同。
本发明的具体步骤是：
首先用特异性引物以 PCR的方法从日本晴 BAC克隆 OSJNBa0052O21上扩增得到一个被命名为 PSAG39的启动子候选片段， 将该启动子 PSA(339候选片段与报告基因 GUS编码序列构建成融合基因并 装载到双元 Ti载体上，装配成 PSAG39-GC/S载体， 再通过农杆菌介导的转基因方法，将候选片段构建 的报告基因转入水稻受体中， 获得转基因植株； 通过组织化学染色及 Northern blot分析， 考察该启 动子在叶片发育各时期的表达变化， 进而验证和克隆该启动子。 检测结果表明： 在成熟的水稻叶片 中有一定的表达， 随着叶片衰老程度加深其表达量逐步变强， 当叶片衰老程度到达晚期时表达活性 达到顶点； 用衰老诱导剂脱落酸处理 30分钟后， 该启动子表达量明显上升， 在 2小时达到最高峰； 该启动子在叶、 茎、 根、 花、 颖壳及未成熟种子的种皮、 愈伤组织中表达， 在成熟种子及胚乳中不 表达（如图 5a、 图 5b和图 9所示）。采用片段缺失的方法， 我们构建了 7个来源于 PSAG39的 5'端缺 失片段连接 GUS表达载体， 分析这 7个片段的衰老特异性表达情况， 结果显示： 来源于该启动子的 两个区段 PSAG39-1600和 PSAG39493不仅具有独立的启动基因表达的功能， 而且在衰老的叶片中表达 量比在绿色成熟叶片中明显增强。 然后用 IPT基因替换掉 PSAG39-GC/S载体上的 GUS , 装配成 PSAG39-/ 载体， 同样用农杆菌介导的转基因方法， 将候选片段构建的报告基因转入水稻受体中， 获 得转基因植株； 繁殖并筛选了单拷贝插入的转基因纯合家系， 通过 RT-PCR方法检测 /ΡΓ在转基因 家系中是表达的， 并且阳性转基因纯合家系的叶片持绿性增强。
本发明的优点在于：
( 1 )本发明鉴定了叶片衰老特异性表达的启动子 PSA(539及核心结构， 为基因工程和分子育种提供了 新的特异表达的启动子资源。
( 2 ) 本发明可以直接应用于水稻衰老特异诱导表达启动子的鉴定和克隆。
( 3 ) 本发明所提供的启动子 PSAC339、 PSAG39-160o和 PSAG39^93构建抗衰老相关基因的表达载体转化 植物以提高植物的抗衰老性， 受体植物包括水稻及其他作物例如玉米、 小麦、 棉花、 油菜或番茄等。 附图说明
序列表 SEQ ID NO: 1， 公开了本发明克隆的的包括 SAG39基因 5'端部分编码序列的水稻叶片 衰老特异诱导表达启动子的核苷酸序列。
序列表 SEQ ID NO: 3是从所述的 SEQ ID NO: 1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子 应用的核苷酸序列， 长度为 1637bp。
序列表 SEQ ID NO: 5是从所述的 SEQ ID NO: 1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子 应用的核苷酸序列， 长度为 494bp。
图 1 : 显示的是& 4GJi>基因启动子区顺式作用元件。 阴影显示的是基本启动子元件序列； 双下 划线序列为扩增 SAG39基因启动子所用的引物序列；单下划线序列为预测的 基因翻译起始位 点； 预测的转录起始位点加文本框表示， 此处的碱基编号为 +1 ; 在其上游的序列编号为负， 在其下 游的序列编号为正； 翻译起始位点 ATG用阴影加文本框表示。
图 2: 表示双元载体 pCAMBIA 1301结构示意图。
图 3 :表示构建好的以 pCAMBIA 1301为骨架的表达载体。图中 a显示融合 Gt/S的表达载体（也 代表了 PSAG39-1600或 PSAG39>493融合 GUS的表达载体,这两个启动子酶切位点与载体上的相对位置 与 PSAG39完全相同）； b显示 PSAG39融合 IPT的表达载体。 PSAG39为 X4G3i>启动子序列； EcoRl, Bgl ll 为将 PSAG39导入 PCAMIA1301时所用的限制内切酶位点； 、 Bst W为将 IPT导入 PSAG39-Gf/S 所用的限制内切酶位点； LB、 RB分别为 pCAMIA1301中 T-DNA的左边界和右边界； Hp/为潮霉素 抗性筛选基因； g 为报告基因 GUS ( β-葡萄糖苷酸酶）； Nos polyA为胭脂碱合成酶基因多聚腺苷 酸序列。
图 4: 显示的是 PSAG39-Gi/S转基因植株中外源片断的拷贝数情况。 图中： M表示 λ-ΕΟ)Τ14 ΐ； 1〜12表示转基因植株； CK表示野生型植株。
图 5: 显示的是 GUS随着叶片衰老的表达变化情况和野生型植株中基因 SAG39受到 ABA诱导 的表达情况。 图中： FL表示成熟的完全伸展叶片； ES表示叶绿素含量达 90%的早期衰老叶片； S 1 表示叶绿素含量达 70%的早期衰老叶片； S2表示叶绿素含量达 60%的中期衰老叶片； S3表示叶绿 素含量达 40%的晚期衰老叶片； CK表示 ABA处理 0分钟的野生型叶片对照。
图 6: 显示 GUS在全长启动子和 7个缺失启动子转化植株中的表达情况。 图中： y表示绿色成 熟叶片； s表示叶绿素含量大约 40%的晚期衰老叶片； p39表示转 PSAC39-GC/S的转基因植株； f06、 。、 f5、 f7、 fl 0、 fl 3、 fl 6依次表示的是左引物位置为 -62、 -239 -493、 -719、 -1 100、 -1300、 -1600 构建融合基因的转基因植株。
图 7: 显示 RT-PCR检测转基因 T2代纯合植株 / 基因表达量。 图中： y表示绿色成熟叶片； s 表示叶绿素含量大约 40%的晚期衰老叶片； ΖΗ11表示野生型中花 1 1对照； ZT1 -1、 ZT2-1和 ZT3-1 分别表示 3个转 Ρ5Α(339-/ >Γ中花 11的阳性纯合株系。
图 8: 转基因植株的持绿性检测。 图中： a表示 Ρ5Α(339-//>Γ转中花 11植株抽穗后叶片 存活数目统计； b表示 PSAG39-/Pr转中花 1 1植株抽穗后倒三叶的持绿度。 ZT1 - 1、 ZT2-1和 ZT3-1分 别表示 3个转 PSAG39-/Pr中花 11的阳性纯合株系； ZT1-2 , ZT2-2、 ΖΤ3-2分别表示 ZT1 -1、 ZT2-1 和 ZT3-1所对应的来自于同一个 TO代单株的转基因纯合阴性株系。
图 9: 显示在转基因水稻不同组织中 GUS组织染色情况 （至少考察 15株转基因植株）。 图中： a表示叶片； b表示根： c表示茎杆； d表示花； e表示颖壳； f表示种皮； g表示种子： h表示愈伤组 织。
图 10: Ρ5Α(339-/ΡΓ转基因株系 ZT1 -1和 ZT1-2的单株在结实期的田间表型， 左图是 ZT1 -2 , 右 图是 ΖΤ1-1。 具体实施方式
实施例 1: 启动子 PSAC39候选片段的获得
利用生物信息学网站 NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)软件 BlastP ( Gish等， Identification of protein coding regions by database similarity search. Nature Genet. 1993, 3: 266-272 ) 搜索拟南芥叶片衰 老特异性蛋白 SAG 12在水稻基因组的最髙同源序列，发现其位于日本晴第 4染色体的 BAC克隆上， 克隆号为 OSJNBa0052O21 , 该同源基因编码的蛋白质在 NCBI上的登陆号是 CAD40026, 我们将之 对应的基因命名为& 4G_39, 它编码半胱氨酸蛋白酶， 与 SAG12的蛋白质同源性髙达 56%。利用植物 启动子预测软件 TSSP ( http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=case_study_plants ) 预测出 SAG39 的启动子序列位于 ATG上游 2.1 Kb, 将其命名为 PSAC539 (见图 1 )。
实施例 2: PSAC39启动子候选片段和缺失片断的转化载体构建
( 1 ) 从日本晴 BAC文库 （Feng等， Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature, 2002, 420: 316-320 )中挑取克隆 OSJNBa0052O21， 活化培养后抽取其质粒为模板， 设计表 1的引物，通过 PCR 扩增全长启动子以及一系列 5'缺失片段。 PCR反应条件： 94°C 5min, 94 lmin, 58 °C 〗min， 72 'C 2min, 30个循环， 72'C 7min。 7个 5'缺失片段与全长启动子共用同一个右引物， 它们的左引物 在染色体上与基因转录起始点的相对位置是： -62、 -239、 -493、 -719、 -1100、 -1300、 -1600, 根据 其相对位置分另1 J命名为
Figure imgf000006_0001
PsAG39-239、 PsAG39-493 PsAG39-719 PsAG39-1100、 PsAG39-1300、 PsAG39-1600' 在每条左引物 5'端都引入 &0RI酶切位点， 右引物 5' 端引入 Bg!U酶切位点。
(2)收集 PCR产物， 加入 1/10体积的 NaAC (3M, pH5.2)和 2倍体积 95°/。乙醇， 沉淀 DNA; 用 75%的乙醇洗涤沉淀， 沉淀自然风干后加超纯水溶解。 纯化产物经用 £C0RI/ /II酶切。 然后用 U IQ-10柱式 DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司生产）回收。同样 Eco應 gl II处理 PCAMBIA1301, 切除启动 gus基因表达的 35S启动子， 将回收产物构建到酶切后的植物双 元 Ti质粒载体 pCAMBIA1301 (该载体商购自 CAMBIA公司公开使用的载体， 载体含有 GUS报告 基因） 的多克隆位点上， 使报告基因 GUS在启动子候选片段的直接控制下表达。
(3)将上述构建好的载体导入农杆碱型的根癌农杆菌 £H4 05菌株 （该菌株商购自 CAMBIA公司 公开使用的农杆菌菌株)， 构成转化菌株。 将构建好的 Ti质粒载体通过农杆菌介导的方法 （林拥军 等， 农杆菌介导的牡丹江 8号高效转基因体系的建立， 作物学报， 2002, 28 (3 ): 294-300) 转化水 稻品种 "中花 11"。
(4) 以质粒 psg516 (Gan等， Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science.1995, 270: 1986-1987)为模板， 设计引物 p39ipt-F (5'- cggaattcagatctatggatctgcgtctaattttcgg-3') 和 p39ipt-R (5*- aggtaaccctaatacattccgaatggatgac-3') 扩增/ ΡΓ基因， 在左引物 5'端引入 ¾/Π酶切位 点， 右引物 5'端引入 酶切位点 （以下划线指出）， 收集 PCR产物， 以上述同样的方法纯化回 收后酶切，连接到 PSAC39-Gt/S载体中，构建成载体 PSAC339-// (图 2b)。随后转入农杆菌菌株 EHAW5, 通过农杆菌介导的方法 （林拥军等， 农杆菌介导的牡丹江 8号高效转基因体系的建立， 作物学报， 2002, 28 ( 3 ): 294-300)转化水稻品种 "中花 11" (来自中国农业科学院作物研究所商业经营品种）。 PCR反应条件： 94°C 5min, 94 °C lmin, 55'C lmin, 72 °C lmin, 30个循环， 72。C 7min。
实施例 3: 农杆菌介导的遗传转化
农杆菌介导的遗传转化方法主要参照本申请人华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表 的 "农杆菌介导的遗传转化操作手册"所示的方法 （林拥军等， 农杆菌介导的牡丹江 8号髙效转基 因体系的建立， 作物学报， 2002, 28 (3 ): 294-300 )o 转化受体为水稻品种 "中花 11"的成熟种子所 诱导产生的胚性愈伤组织。 经过预培养、 侵染、 共培养、 筛选得到具有潮霉素抗性的愈伤， 再经过 分化、 生根、 练苗和移栽， 得到转基因植株。 本发明的遗传转化的主要步骤、 培养基及其配制的方 法如下所述：
(1)试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的縮写表示如下： 6-BA (6-BenzylaminoPurine, 6-苄基 腺嘌呤）； CN (Carbenicillin, 羧苄青霉素）； KT (Kinetin, 激动素）： NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸）； IAA (lndole-3 -acetic acid,吲噪乙酸;）； 2,4-D ( 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-二氯苯氧乙酸） ； AS (Acetosringone, 乙酰丁香酮） ； CH (Casein Enzymatic Hydrolysate, 水解酪蛋白） ； HN (HygromycinB, 潮霉素）； DMSO (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚砜） ； N6max (N6大量元素成分溶液） ； N6mix (N6微量元素成分溶液） ； MSmax (MS大量元素成 分溶液） ； MSmix (MS微量元素成分溶液）
(2) 主要溶液配方
1) N6培养基大量元素母液 （按照 10倍浓缩液 （10X) 配制） ： 硝酸钾 （KN03) 28.3 g
磷酸二氢钾 （KH2P04) 4.0 g
硫酸铰 （(NH4)2S04) 4.63 g
硫酸镁 （MgS04 '7H20) 1.85 g
氯化钙 （CaCl2 '2H20) 1.66 g
将上述试剂逐一溶解， 然后室温下用蒸馏水定容至 1000 ml。
2) N6培养基微量元素母液 （按照 100倍浓缩液 （100X) 配制
碘化钾 （KI) 0.08 g
硼酸 （H3B03) 0.16 g
硫酸锰 （MnS04 4H20) 0.44 g
硫酸锌 （ZnS04'7H20) 0.15 g
将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至 1000 mlo
3)铁盐（Fe2EDTA) 贮存液（按照 100X浓缩液配制）
将 3.73 克乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA '2H20)和 2.78克 FeS04 ' 7H20分别溶解， 混合并用 蒸馏水定容至 1000 ml， 至 70°C温浴 2小时， 4°C保存备用。
4) 维生素 存液 （按照 100X浓縮液配制）
烟酸 (Nicotinic acid) 0.1 g
维生素 Bl (Thiamine HC1) 0.1 g
维生素 B6 ( Pyridoxine HC1 ) 0.1 g
甘氨酸 （Glycine) 0.2 g
肌醇 （Inositol ) lO g
加蒸馏水定容至 1000 ml, 4°C保存备用。
5) MS培养基大量元素母液（按照 10X浓缩液配制）
硝酸铰 （NH4N03) 16.5 g
硝酸钾 19.0 g
磷酸二氢钾 1.7 g
硫酸镁 3.7 g
氯化钙 4.4 g
将上述试剂在室温下溶解， 并用蒸馏水定容至 1000 ml。
6) MS培养基微量元素母液（按照 100X浓縮液配制）
硫酸锰 （MnS04 ' 4H20) 2.23 g
硫酸锌 （ZnS04 '7H20) 0.86g
硼酸 （ H3B03) 0.62 g
碘化钾 （KI) 0.083 g
钼酸钠 (Na2Mo04-2H20) 0.025 g
硫酸铜 （CuS04'5H20) 0.0025 g
氯化钴 （CoCI2 ' 6H20) 0.0025g
将上述试剂在室温下溶解， 并用蒸馏水定容至 1000 ml。
7) 2,4-D贮存液 ( l mg/ml) 的配制：
称取 2，4-D 100 mg， 用 l ml I N氢氧化钾溶解 5分钟， 然后加 10 ml 蒸馏水溶解完全后定容 至 100 ml, 于室温下保存。
8) 6-BA贮存液（l mg/ml) 的配制：
称取 6-BA 100 mg, 用 l ml I N氢氧化钾溶解 5分钟， 然后加 10 ml 蒸馏水溶解完全后定容 至 100 ml, 室温保存。
9)萘乙酸 （NAA) 5 &存液（l mg/ml) 的配制：
称取 NAA lOO mg, 用 l ml I N氢氧化钾溶解 5分钟， 然后加 10 ml 蒸馏水溶解完全后定容 至 100 ml, 4'C保存备用。
10〉 吲哚乙酸（IAA )贮存液 （l mg/ml) 的配制：
称取 IAA lOO mg, 用 l ml I N 氢氧化钾溶解 5分钟， 然后加 10 ml 蒸馏水溶解完全后定容至 100 ml, 4'C保存备用。
11)葡萄糖贮存液 （0.5 g/ml) 的配制：
称取葡萄糖 125 g， 然后用蒸馏水溶解定容至 250 ml， 灭菌后 4'C保存备用。
12) AS Jt存液的配制：
称取 AS 0.392 g ， 加入 DMSO lO ml溶解， 分装至 1.5 ml 离心管内， 4'C保存备用。
13) 1N氢氧化钾贮存液
称取氢氧化钾 5.6 g, 用蒸馏水溶解定容至 100 ml, 室温保存备用。
(3) 用于水稻遗传转化的培养基配方
1 ) 诱导培养基
N6max母液 （取已经制备好的 10X 浓縮液， 下同） 100毫升
N6mix母液 （取已经制备好的 100X浓縮液， 下同） 10毫升
Fe2+EDTA贮存液 （取己经制备好的 100X 浓缩液， 下同） 10毫升
维生素贮存液 （取己经制备好的 100X 浓縮液， 下同） 10毫升
2,4-D贮存液 （取上述制备好的） 2.5毫升
脯氨酸 （Proline) 0.3克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸馏水至 900毫升， 1N氢氧化钾调节 pH值到 5.9, 煮沸并定容至 1000毫升， 分装到 50毫升三 角瓶（25 毫升 /瓶） ， 封口后按常规方法灭菌 （例如 121 Ό下灭菌 25分钟， 下述的培养基灭菌方 法与本培养基的灭菌方法相同） 。
2) 继代培养基
N6max母液 （10X) 100毫升
N6mix母液 （100X) 10毫升
Fe2+EDTA贮存液 （100X) 10毫升
维生素贮存液 （100X) 10毫升
2,4-D贮存液 2.0毫升
脯氨酸 0.5克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克 加蒸馏水至 900毫升， IN氢氧化钾调节 pH值到 5.9, 煮沸并定容至 1000毫升， 分装到 50毫升 三 角瓶 （25 毫升 /瓶） ， 封口， 按上述方法灭菌。
3)预培养基
N6max母液 （10X) 12.5毫升
N6mix母液 （100X ) 1.25毫升
Fe2+EDTA贮存液 （100X ) 2.5毫升
维生素贮存液 （100X ) 2.5毫升
2,4-D贮存液 0.75毫升
CH 0.15克
蔗糖 5克
琼脂粉 1.75克
加蒸馏水至 250毫升， 1N氢氧化钾调节 pH值到 5.6, 封口， 按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入 5毫升 葡萄糖贮存液和 250微升 AS 贮存液， 分装倒入培养皿中 (25毫升 /皿） 。
4)共培养基
N6max母液 （10X) 12.5 ml
N6mix母液 （100X) 1.25ml
Fe2+EDTA 贮存液 （100X) 2.5 ml
维生素贮存液 （100X ) 2.5 ml
2,4-D贮存液 0.75 ml
CH 0.2 g
蔗糖 5 g
琼脂粉 1.75 g
加蒸馏水至 250毫升， IN氢氧化钾调节 pH值到 5.6, 封口， 按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入 5毫升 葡萄糖贮存液和 250微升 AS贮存液，分装倒入培养皿中（25 毫升 /每皿） 。
5) 悬浮培养基
N6max母液 （10X) 5毫升
N6mix母液 （100X) 0.5毫升
Fe2+EDTA 贮存液 （100X) 0.5毫升
维生素贮存液 （100X ) 1毫升
2,4-D贮存液 0.2毫升
CH 0.08克
蔗糖 2克
加蒸馏水至 100毫升，调节 pH值到 5.4,分装到两个 100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。 使用前加入 1毫升 无菌葡萄糖贮存液和 100微升 AS贮存液。
6) 选择培养基
N6max母液 （10X) 25毫升
N6mi 母液 （100X) 2.5毫升
Fe2+EDTA 贮存液 （100X) 2.5毫升 维生素贮存液 （100X ) 2.5毫升
2,4-D贮存液 0.625毫升
0.15克
蔗糖 7.5克
琼脂粉 1.75克
加蒸馏水至 250毫升， 调节 pH值到 6.0， 封口， 按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基， 加入 250微升 HN (50毫克 /毫升） 和 400微升 CN (250毫克 /毫升） 分装倒入 培养皿中 （25毫升 /皿） 。 （注： 第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为 400毫克 /升， 第二次及以 后选择培养基羧苄青霉素浓度为 250毫克 /升）。
7) 预分化培养基
N6max母液 （10X ) 25毫升
N6mix母液 （100X) 2.5毫升
Fe2+EDTA 贮存液 （100X) 2.5毫升
维生素贮存液 （100X) 2.5毫升
6-BA 贮存液 0.5毫升
T贮存液 0.5毫升
NAA 贮存液 50微升
IAA 贮存液 50微升
CH 0.15克
蔗糖 7.5克
琼脂粉 1.75克
加蒸馏水至 250毫升， 1 N氢氧化钾调节 pH值到 5.9， 封口， 按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基， 250微升 HN ( 50毫克 /毫升） 250微升 CN (250毫克 /毫升） ， 分装倒入培养皿 中 （25毫升 /皿） 。
8) 分化培养基
N6max母液 （10X) 100毫升
N6mix母液 （100X) 10毫升
Fe2+EDTA 贮存液 （100X) 10毫升
维生素贮存液 （100X ) 10毫升
6-BA 贮存液 2毫升
T贮存液 2毫升
NAA 贮存液 0.2毫升
IAA 贮存液 0.2毫升
C H 1克
蔗糖 30克
Ph tagel 3克
加蒸馏水至 900毫升， 1 N氢氧化钾调节 pH值到 6.0。
煮沸并用蒸馏水定容至 1000毫升， 分装到 50毫升三角瓶（50毫升 /瓶）， 封口， 按上述方法灭菌。
9) 生根培养基
MSmax母液 （10X ) 50毫升 MSmix母液 ( 100X ) 5毫升
Fe2+EDTA贮存液 （100X) 5毫升
维生素贮存液 （100X ) 5毫升
蔗糖 20克
Phytagel 3克
加蒸馏水至 900毫升， 用 1N氢氧化钾调节 pH值到 5.8。
煮沸并用蒸馏水定容至 1000毫升， 分装到生根管中 （25毫升 /管） ， 封口， 按上述方法灭菌。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤
3.1 愈伤诱导
1) 将成熟的中花 1 1 水稻种子去壳， 然后依次用 70%的乙醇处理 1 分钟， 0.15%氯化汞 (HgCl2)种子表面消毒 15分钟：
2) 用灭菌水洗种子 4-5次；
3) 将种子放在诱导培养基上；
4) 将接种后的培养基置于黑暗处培养 4周， 温度 25±1 °C。
3.2 愈伤继代
挑选亮黄色、 紧实且相对干燥的胚性愈伤， 放于继代培养基上黑暗下培养 2周， 温度 25±1
。C。
3.3 预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤， 放于预培养基上黑暗下培养 2周， 温度 25±1 'C。
3.4农杆菌培养
1) 在带有对应抗性选择的 LA培养基 （LA培养基的配制参照 J.萨姆布鲁克等， 分子克隆实验 指南， 第三版， 金冬雁等 (译)， 科学出版社， 2002， 北京）上预培养农杆菌 £H4/W (该菌株来 自 CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株） 两天， 温度 28Ό ;
2) 将农杆菌转移至悬浮培养基里， 28'C摇床上培养 2-3小时。
3.5农杆菌侵染
1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；
2) 调节农杆菌的悬浮液至 OD6000.8-1.0;
3) 将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡 30分钟；
4) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干； 然后放置在共培养基上培养 3天， 温度 19-20'C。 3.6 愈伤洗涤和选择培养
1) 灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
2) 浸泡在含 400毫克 L羧苄青霉素 （CN) 的灭菌水中 30分钟；
3) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
4) 转移愈伤至选择培养基上选择培养 2-3次， 每次 2周。
3.7 分化
1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养 5-7天；
2) 转移预分化培养的愈伤至分化培养基上， 光照 （1500-2000LUX) 下培养， 培养温度 26°C。 3.8 生根
1)剪掉分化时产生的根；
然后将其转移至生根培养基中光照 （1500-2000LUX) 下培养 2-3周， 培养温度 26'C。 3. 9 移栽
洗掉根上的残留培养基， 将具有良好根系的幼苗转入温室， 同时在最初的几天保持水分湿润。 实施例 4:利用 Southern blot确定外源片段是否整合到水稻染色体组上，同时鉴定插入片断的拷贝数。
取转基因植株绿色幼嫩叶片抽提总 DNA转膜， 以 GUS基因序列为探针进行 Southern杂交， 大 样的总 DNA提取釆用 CTAB法 （Rogers and Bendich, Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol Biol, 1985, 5: 69-76),转膜、 Southern杂交参照 Zhou等的方法 (Zhou等, The defense responsive genes showing enhanced and repressed expression after pathogen infection in rice (Oryza sativa L). 2002, Science China (Series C), 45: 449-467)。 Southern杂交 所用的探针是双元载体 PCAMB1A1301骨架上的潮霉素基因的部分序列， 扩增这段探针的引物是： hpt-F ( 5'-atttgtgtacgcccgacagt-3' )和 hpt-R ( 5'- ggatatgtcctgcgggtaaa-3 ' ) » 检测结果如图 4所示， 这 13 株全长启动子的转化单株中 T-DNA插入位点都不一样， 说明它们发生的转化事件都是独立的； 其中 1、 3、 7、 9、 11号单株是单拷贝插入的， 对于后代分离转基因纯合株系非常有利。
实施例 5: Northern blot方法分析启动子 PSAC;39的时空表达特异性和响应 ABA的情况
( 1 )在中花 11分蘖期叶片生长从成熟到逐渐衰老的不同时期 （FL, 成熟的完全伸展叶片； ES, 叶 绿素含量达 90%的早期衰老叶片； S1 , 叶绿素含量达 70%的早期衰老叶片； S2, 叶绿素含量达 60% 的中期衰老叶片； S3， 叶绿素含量达 40%的晚期衰老叶片）取叶片抽提总 RNA, 釆用 TRIZOL试剂
(购自 Irwitrogen公司）， 提取方法根据该 TRIZOL试剂说明书。 转模后以 GUS基因序列的特异区 段为探针进行 Northern杂交， 鉴定该基因的时空表达模式（见图 5a所示）。用来扩增 GUS探针的引 物是： GUS-F ( 5'- gggcgaacagttcctgatta -3' ) 和 GUS-R (5'- cgaaatattcccgtgcactt -3')。
(2)对野生型中花 11三叶期幼苗进行脱落酸 （ABA, 100 μΜ) 处理 5分钟、 10分钟、 20分钟、 30 分钟、 1小时、 2小时、 4小时、 8小时、 24小时的样品取叶片抽提总 RNA转膜， 以 SAG39基因的 特异区段序列为探针进行 Northern杂交， 鉴定该基因响应衰老诱导剂脱落酸的表达情况 （见图 5b 所示）。用来扩增 SAG39特异区段探针的引物是： SAG39-F (5'- acaatgaggctgcccttatg -3')和 SAG39-R
( 5'- aaaggctcacttgctcatgg -3' )。
(3 ) 以上的杂交结果显示： PSA(339启动子的表达量是很高的， 而且在成熟叶片中也表达， 当叶片衰 老程度到达晚期时表达活性达到髙峰期， 证明该启动子确实是叶片衰老特异性表达启动子。 同时用 衰老诱导剂 ABA处理野生型中花 11时， 基因 SAG39在 30分钟后表达量明显上升， 揭示该基因参 与 ABA信号转导途径。
实施例 6: GUS组织染色法分析 AC39在各种组织中的表达模式
分别取载体 PSA(i39-GWS (其核苷酸序列见序列表 SEQ ID :1所示， 附图 3的结构图所示）遗传 转化筛选得到的抗性愈伤组织或者转基因植株根、叶片、叶鞘、茎杆、颖壳、花、种子切成约 0.5 CM 长度的适当大小， 浸入约 200 μ 1的 GUS染液， 37'C过夜， 然后用 75%酒精脱色， 观察是否有蓝色 出现。 染色液的配方参照 Jefferson等报道的方法 （Jefferson等， GUS ftisions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J, 1987, 6: 3901-3907)。结果表明： GC/S 报告基因在 P39植株叶、 茎、 根、 花、 颖壳及未成熟种子的种皮、 愈伤组织中表达， 在成熟种子及 胚乳中不表达 （图 9), 揭示该启动子可以应用于基因工程育种改良研究。
实施例 7: 利用一系列 5' 端缺失启动子分析控制衰老特异性的区段
取自然衰老条件下各段缺失启动子 （来自于实施例 6所示启动子全长的一部分， 片段长度见实 施例 2) 转基因植株的绿色叶片 （y) 和衰老叶片 （s) 进行 Northern杂交， 检测 GUS的表达情况， 探明启动子缺失一段后对其时空特异性活性的影响， RNA的抽提和杂交方法同实施例 5。 如图 6所 示， p39表示转 PSAG39的转基因植株， fD6、 β、 f5、 Π、 fl0、 fl3、 fl6依次表示该缺失启动子的左 引物位置为 -62、 -239、 -493、 -719、 -1100、 -1300、 -1600。 杂交结果显示： f5 (即 PSAG39493,该启动 子的核苷酸序列见 SEQ ID NO:5 )和 fl6 (即 PSAG39-1600,该启动子的核苷酸序列见 SEQ ID NO:3 )与 全长启动子的表达模式一致， 是衰老上升表达的， 而 ί06、 β、 f7、 fl0、 fl3没有显示衰老特异性， 而且 f5的表达强度与全长一样都是这一系列缺失启动子中最强的。这说明在 f5下游可能存在着正向 调控衰老特异性的顺式作用位点， 而 f5上游可能存在抑制衰老特异性的位点， 同时 f5下游的 -493 至 -239区段可能还含有一些对增强启动子表达起作用的顺式元件。 推测 fl6的下游也可能存在着正 向调控衰老特异性的顺式作用位点。
实施例 8: 鉴定转 PSA(J39-/ r家系的持绿性
( 1 )筛选转基因纯合家系： 利用 Southern杂交的方法（参照实施例 4)挑出外源片段插入是单拷贝 的 To代单株， ^代分株系种植， 种子成熟收获后， 每个株系试验 20单株， 每个单株取 50粒种子， 去壳后消毒 （消毒方法参照实施例 3 ), 放在含 50mg/L潮霉素的生根培养基上 （该生根培养基的成 分参见上述实施例 3中 9)进行发芽试验， 7天后检査发芽情况。 同时， 以未转基因的种子进行同样 的处理作对照。理论上， 若消毒的种子在不加潮霉素的条件下具有 100%的发芽活力， 则在含潮霉素 的生根培养基上， 阳性纯合转基因单株的发芽率为 100%, 杂合转基因单株的发芽率为 75%左右（如 果该株系后代发生异常分离， 则发芽率小于 75%), 阴性纯合单株的发芽率为 0%。 因此， 如果所接 种的 50粒种子全部发芽， 则为转基因纯合阳性植株， 如果部分发芽， 则为杂合植株， 如果全部不发 芽，则为纯合阴性植株。我们筛选得到 3个转基因纯合家系， T2代的纯合阳性植株分别命名为 ΖΤ1-1、 ΖΤ2-Κ ZT3-1 , 它们所对应的来自于同一个 Τ。代单株的转基因纯合阴性株系命名为 ΖΤ1-2、 ΖΤ2-2、
(2)检测外源基因的表达谱： 取转基因植株 ΖΤ1-1、 ΖΤ2-Κ ZT3-1的绿色叶片（y)和衰老叶片（s) 抽提总 RNA,参照 Cai的方法（Cai， Isolation and Functional Characterization the pathogen-inducible and tissue-specific expression promoters. (Dissertation for Doctoral Degree). Wuhan: HuaZhong Agriculturial University. 2006)反转录成为单链 cDNA作为模板，用引物 ipt-F ( 5'-gcctctggtgaagggtatcat-3' )和 ipt-R
( 5'- gcgatcccatgaatcaactta-3')进行 RT-PCR反应， 鉴定 / 的表达量。 结果显示， / 基因在衰老混 合样品中的表达量要高于绿叶混合样品，证明 /ΡΓ基因确实在衰老特异性启动子 ω9驱动下表达， ZT1-1的表达量最强， 而 ZT2-1次之， ZT3-1较弱 （见图 7)。
(3 )在抽穗后 7、 14、 21、 28、 33、 38、 43、 48、 52、 60天分别用叶绿素测定仪 SPAD-502 (Minolta Camera Co., Japan)测定转基因植株倒三叶的叶绿素含量，验证叶片的持绿性发生变化；在抽穗后 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 60天统计转基因植株的存活叶片数目， 验证叶片的存活寿命受 到影响。 结果显示， 3个转基因阳性株系倒三叶的持绿度 SPAD值从抽穗后 20天左右开始下降， 而 阴性株系从抽穗后 14天已经开始下降， 且下降速度明显快于阳性株系 （图 8a) ； 抽穗后 25天阳性 株系倒三叶仍是成熟绿叶， 很少衰老， 而阴性株系的倒三叶部分己经衰老甚至死亡 （图 8b) 。 如图 10所示 （左图是 ZT1-2, 右图是 ZT1-1 ) , 抽穗后转基因阳性株系 ZT1-1的乳熟期比转基因阴性株 系 ZT1-2长。 结合图 7的结果说明， 转 PSAG39-// 基因植株的持绿性表型是与外源基因的表达量共 分离的； 同时我们也可以得出结论： 转基因植株的持绿性增强确实是由 /ΡΓ基因在衰老特异性启动 子？^«9驱动下表达造成的。 表 1 扩增启动子全长和缺失片段的引物设计
载体名 引物名 正向引物 (5'-3') 1 反向引物 ( 5'-3') 2 Vector name Primer name Forward primer (5'-3'V Reverse prime ')2
PSAG39-GUS P39-F/R ggctctagaattcataagagagggaggca gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga cacg g
PSAG39-62"GUS Pf06-F/R ggctctagaattcaacatcgtacacgcacc gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga gta g
PsAG39-239"GUS Pf2-F/R ggctctagaattcacttcacggctacgcag gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga act g
PsAG39- 93~GUS Pf5-F/R ggctctagaattcccaatgtgcaaaactct gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga cca g
PsAG39-719"GUS Pf7-F/R ggctctagaattccgcacatatacacccaa gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga cctt g
PSAG39-1100-GUS PflO-F/R ggctctagaattcgatgagatgggaggag gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga gtga g
PSAG39-1300'GUS PA3-F/R ggctctagaattcggagagagcgtcggat gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga atga g
PSAG39-1600~GUS PH6-F/R ggctctagaattccgtggggaattttgtga gcagatctaccatgaggatggcgaagagcaga gtt g
下划线的部分代表 ^oRI的酶切位点。
下划线的部分代表 Bgni的酶切位点。

Claims

权 利 要 求 书 、 一种叶片衰老特异性表达的启动子 PSAG39, 它的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO: 1 所示。 、 一种叶片衰老特异性表达的启动子 PSACJ^ O，它的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:
2所示。 、 一种叶片衰老特异性表达的启动子 PSAC339_493，它的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO:
3所示。 、 权利要求 1 所述的启动子 PSA(339的两个植物表达载体， 该载体是 PSAC39-Gf/S和
、 权利要求 2所述的启动子 PSA(}39-16(K)的两个植物表达载体， 该载体是 PSA(J39-16()()-Gi^ 和 PSAG39- 、 权利要求 3 所述的启动子 PSAG39_493 序列的两个植物表达载体， 该载体是 PsAG3i 93-Gf/S禾口 PsAG39493- P 、 权利要求 1 -3任一项所述的启动子在水稻改良中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8202525B2 (en) 2009-12-22 2012-06-19 Pondera Biotechnologies, LLC Methods and compositions for treating distress dysfunction and enhancing safety and efficacy of specific medications
CN115017698A (zh) * 2022-06-02 2022-09-06 中国水稻研究所 一种分析水稻生育后期叶片衰老程度和衰老动态的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101358193B (zh) * 2008-08-08 2011-01-12 华中农业大学 水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用
CN102268433B (zh) * 2010-06-01 2012-12-19 中国科学院上海生命科学研究院 一种植物衰老特异性启动子及其应用
CN102295690B (zh) * 2010-06-25 2013-07-17 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与抗病性相关蛋白及其编码基因与应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6388170B1 (en) * 2000-04-07 2002-05-14 University Of Kentucky Research Foundation Bidirectional promoters and methods related thereto
CN1763197A (zh) * 2004-09-02 2006-04-26 高丽大学校产学协力团 新的植物衰老特异性基因及其启动子
CN101089182A (zh) * 2006-06-14 2007-12-19 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种叶片衰老相关基因及其编码蛋白与应用
US7365185B2 (en) * 2000-07-19 2008-04-29 Monsanto Technology Llc Genomic plant sequences and uses thereof
US20080184393A1 (en) * 2007-01-31 2008-07-31 Zhang Zhanyuan J Auto-Regulated Expression Of Bacterial Isopentenyltransferase Gene Promotes T-DNA Transformation In Soybean
CN101358193A (zh) * 2008-08-08 2009-02-04 华中农业大学 水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6388170B1 (en) * 2000-04-07 2002-05-14 University Of Kentucky Research Foundation Bidirectional promoters and methods related thereto
US7365185B2 (en) * 2000-07-19 2008-04-29 Monsanto Technology Llc Genomic plant sequences and uses thereof
CN1763197A (zh) * 2004-09-02 2006-04-26 高丽大学校产学协力团 新的植物衰老特异性基因及其启动子
CN101089182A (zh) * 2006-06-14 2007-12-19 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种叶片衰老相关基因及其编码蛋白与应用
US20080184393A1 (en) * 2007-01-31 2008-07-31 Zhang Zhanyuan J Auto-Regulated Expression Of Bacterial Isopentenyltransferase Gene Promotes T-DNA Transformation In Soybean
CN101358193A (zh) * 2008-08-08 2009-02-04 华中农业大学 水稻叶片衰老特异性启动子的鉴定及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAUL R. ET AL.: "Leaf senescence is delayed in maize expressing the Agrobacterium IPT gene under the control of a novel maize senescence- enhanced promoter", PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL (2004), vol. 2, 31 December 2004 (2004-12-31), pages 101 - 112 *
ZHANG ET AL.: "The Construction of a Plant Binary Vector pCAMBIA130-pRP-6-IPT-Nos for Expressing IPT Gene in Developing Rice Seed", JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE), vol. 45, no. 3, 31 May 2006 (2006-05-31), pages 432 - 435 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8202525B2 (en) 2009-12-22 2012-06-19 Pondera Biotechnologies, LLC Methods and compositions for treating distress dysfunction and enhancing safety and efficacy of specific medications
US8372414B2 (en) 2009-12-22 2013-02-12 Pondera Biotechnologies, LLC Methods and compositions for treating distress dysfunction and enhancing safety and efficacy of specific medications
US8617577B2 (en) 2009-12-22 2013-12-31 Pondera Biotechnologies Inc. Methods and compositions for treating distress dysfunction and enhancing safety and efficacy of specific medications
US8741319B2 (en) 2009-12-22 2014-06-03 Pondera Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for treating anxiety disorders or symptoms thereof
CN115017698A (zh) * 2022-06-02 2022-09-06 中国水稻研究所 一种分析水稻生育后期叶片衰老程度和衰老动态的方法
CN115017698B (zh) * 2022-06-02 2023-06-16 中国水稻研究所 一种分析水稻生育后期叶片衰老程度和衰老动态的方法

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CN101358193A (zh) 2009-02-04

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