CN112608371B

CN112608371B - 多效性基因SbSnf4及其在提高高粱茎杆含糖量和生物产量中的应用

Info

Publication number: CN112608371B
Application number: CN202011584844.7A
Authority: CN
Inventors: 李杰勤; 王意宏; 哈尔·德奥·乌帕迪亚; 王丽华; 丘达马尼·夏尔玛·普拉卡什; 刘言龙; 高丽; 孟瑞瑞; 郑剑; 靳鹏
Original assignee: Louisiana Lafayette, University of; Anhui University of Science and Technology
Current assignee: Louisiana Lafayette, University of; Anhui University of Science and Technology
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112608371A

Abstract

本发明公开一种多效性基因SbSnf4及其在提高高粱茎杆含糖量和生物产量中的应用，本发明提供的基因SbSnf4，为SEQ ID NO.1所示的DNA分子，或者在严格条件下与SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交且编码提高糖含量及生物产量相关蛋白的DNA分子；或者与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且编码提高糖含量及生物产量相关蛋白的DNA分子。发明人通过关联分析方法定位了该基因，在高粱中过表达SbSnf4基因，发现转基因植株高粱茎杆含糖量及整株生物产量均显著增加，即成功提高高粱的糖产量及生物产量。

Description

多效性基因SbSnf4及其在提高高粱茎杆含糖量和生物产量中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及多效性基因SbSNF4及其在提高高粱茎杆含糖量和生物产量中的应用。

背景技术

高粱(Sorghum bicolor)是C4光合系统的禾本科一年生草本植物，光合效率高，具备抗旱、耐涝、耐盐碱和适应性强等特性，在世界各国广为栽培，是世界第五大粮食作物。甜高粱是普通高粱的一个变种，除具有普通高粱的一般特征外，茎秆中积累了大量的糖分。甜高粱茎秆中液汁的含糖量与甘蔗相当，占茎秆总重量的9％-12％。与甘蔗相比，甜高粱单位面积转化乙醇的产量更高，还具有生育期短、耐冷性更强、适宜在更大的范围种植的优点。另外，甜高粱生物产量高，能有效利用干旱、盐渍化和瘠薄的边际土地，被认为是最具有发展潜力的新型饲草作物。因此，甜高粱是一种极具应用前景的可再生能源和饲用作物。

茎秆含糖量是甜高粱育种中的一个重要性状，而且也是衡量甜高粱生产燃料乙醇能力的一个重要指标。由于茎秆含糖量性状涉及到植物糖生物合成、转运和储存、能量代谢等一系列生理过程。从目前的研究来看，茎秆含糖量是一个复杂的数量性状。虽然已经定位了一些相关的QTL位点，但未见有关于该性状的基因克隆和功能分析的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个提高高粱茎杆含糖量及整株生物产量的基因SbSnf4，及其编码蛋白质和应用。发明人通过关联分析方法定位了该基因，在高粱中过表达SbSnf4基因，发现转基因植株高粱茎杆含糖量及整株生物产量均显著增加，即成功提高高粱的糖产量及生物产量。

本发明提供的基因SbSnf4，为SEQ ID NO.1所示的DNA分子，或者在严格条件下与SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交且编码提高糖含量及生物产量相关蛋白的DNA分子；或者与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且编码提高糖含量及生物产量相关蛋白的DNA分子。

序列表中的SEQ ID NO.1由1359个核苷酸组成。

本发明还提供了一种上述基因SbSnf4编码的蛋白质，即蛋白SbSNF4。

具体的，本发明提供的蛋白质，选自如(a)或(b)所示的任一种：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与提高糖含量及生物产量相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID NO.2，由452个氨基酸组成的蛋白质。

本发明还提供了含有所述基因SbSnf4的重组表达载体、表达试剂盒、转基因细胞系或重组菌。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

本发明用于基因SbSnf4重组表达载体所用的基础植物表达载体可以为本领域的常规载体，所用的植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在一种具体的实施例中，所述重组过表达载体可为在限制性内切酶XmaI和SacI双酶切载体pUBI1301的重组位点插入所述基因SbSnf4得到的重组质粒。将含有SbSnf4的pUBi1301命名为pUBi1301-SbSnf4。

含有以上任一所述基因SbSnf4的表达试剂盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因SbSnf4全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。本专利转基因后也可通过检测标记基因来检测本专利所述基因，例如通过检测转基因载体中的潮霉素基因，检测所用的引物可以为本领域常用的引物，例如可以为5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'和5'-GATGTAGGAGGGCGTGGATA-3'。

本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达试剂盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在高粱育种中的应用。

本发明还提供了所述基因，所述蛋白质，所述重组表达载体、表达试剂盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育糖含量及生物产量提高的转基因高粱中的应用。

本发明还提供了一种培育糖含量及生物产量提高的转基因高粱的方法，是将所述基因导入受体高粱中，得到高含糖量及高生物产量的转基因高粱。

本发明所述的糖含量提高是指高粱转入本发明所述的基因SbSnf4后茎秆的糖锤度比转入之前的野生型获得提高。

本发明所述的生物产量提高是中高粱转入本发明所述的基因SbSnf4后植株的生物量比转入之前的野生型获得提高。

本发明的有益效果：

本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的提高糖含量及生物产量的基因SbSnf4。将所述蛋白的编码基因导入受体高粱中，可以培育含糖量及生物产量显著提高的高粱。所述蛋白及其编码基因可以应用于高粱遗传改良。

附图说明

图1.高粱6号染色体上生物产量、糖锤度相关的多效性位点。R：雨季；PRi：雨季后灌溉；MC：微核心种质；BIOMASS：生物产量；BRIX：糖锤度；X轴表示染色体物理距离(bp)。

图2为转基因植株进行GUS染色检测结果。

图3是本发明过表达转基因植株与正常植株的表型分析，A为正常植株和SbSnf4转基因植株的株型图；B为两者的茎节长度对比图。

图4是实施例2的载体图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、提高高粱含糖量和生物产量相关位点及其编码基因的发现

在雨季和雨季后、有灌溉和无灌溉的情况下，对242份高粱微核心种质和304份参考品系进行了表型分析。材料种植采用α试验设计，每个环境3次重复。行长4m，行距75cm，株距10cm。种植前以150kg/ha的比例施用磷酸铵，种植后3周以100kg/ha的尿素作为追肥。在雨季后进行灌溉的情况下，田间地块灌溉5次，每隔相同时间浇灌7cm水。在微核心种质开花后两周，测定五株代表性植株的鲜重(Murray等2008ab)。称重后，从五个植株中提取汁液，测定汁液体积和重量，并用手持糖度仪测量(Ritter等，2008)糖度。糖产量以汁液重量乘以糖度来计算(Felderhoff等，2012)。

关联分析使用的265,500个SNP引物是由Morris等(2013)开发的。在本研究中，我们使用TASSEL 5.0的K模型，亲缘关系指数是由先前研究中开发的SNP标记生成的(Wang等人，2013年)。如果多个SNP与同一基因座的同一性状在多个环境中连锁(p<0.0001)，那么确认标记与性状之间的关联性。基于http://www.plantgdb.org/SbGDB/上的Sbi1.4信息，确定了含有连锁SNP标记的1-7号区域的7个候选基因。高粱6号染色体上生物产量、糖锤度相关的多效性位点如图1所示，结合功能分析与验证，确定SbSnf4为高粱含糖量和生物产量的编码基因SbSnf4，序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白如SEQ ID NO.2所示。

实施例2高粱转基因植物获得与鉴定

一、载体构建准备：用PstI/EcoRI消化pCAMBIA1301后，将含有玉米泛素1(UBI)启动子和GUS基因的pAHC25(Christensen and Quail 1996)连接到pCAMBIA1301，构建pUBI1301载体。候选基因的编码序列由Bio-Basic Inc.(Amherst，NY)或SynbioTechnologies(Monmouth Junction，NJ)合成，在两侧分别连接XmaI和SacI的酶切位点，再连接到pUC57质粒中。将合成的基因SbSnf4和pUBI1301分别用XmaI和SacI酶切，并用T4酶连接，制备用于高粱转化的转基因载体(图4)。

二、农杆菌制备：用电转染法，用上述转基因载体转化根癌农杆菌菌株LBA4404细胞。将转化的农杆菌细胞的单个菌落接种到具有50mg L^-1卡那霉素的10mL LB培养基中，室温(RT)下培养48h。随后，将5mL培养的细胞接种到含有50mg L^-1卡那霉素的200mL LB培养基中，再培养48h。该培养物储存用于高粱遗传转化。

三、高粱遗传转化：采用刘等(Liu G,Godwin ID 2012.Highly efficientsorghum transformation.Plant Cell Rep 31:999-1007.)的方法，授粉后12-15d收集幼穗。将种子从圆锥花序中取出，浸没于70％乙醇(v/v)中200r/min震荡5min。弃掉70％乙醇，将浸透的种子转移到50％的84消毒液中震荡摇匀10min，然后用蒸馏水洗涤5次。分离出长度为1.0-2.0mm的幼胚，并将其盾片朝上接种在含有愈伤组织诱导培养基(CIM:MS培养基中添加1g/L脯氨酸、1g/L天冬酰胺、1g/L KH₂PO₄、0.16mg/L CuSO₄和1mg/L 2,4-D)的培养皿上(7-10d)。基因枪转化前，幼胚愈伤组织在组织培养室中黑暗孵育。将6个胚愈伤组织置于含有渗透培养基(MS培养基中添加0.2M D-山梨醇和0.2M D-甘露醇)的培养皿中心黑暗培养2-3h，在PDS 1000/He(Bio-Rad)进行轰击。质粒DNA与0.6μm金粉(0.42mg/次)充分混匀。将载体膜支架与靶细胞的距离调整为12cm，轰击压强为1100psi，将每个pNPTII(UBI：：NPTII)质粒和上述每个转基因构建质粒各5μg混匀，将混匀后的质粒分6次轰击。轰击后，幼胚愈伤组织在渗透培养基上培养3-4h，然后转移到诱导培养基上。在诱导培养基上恢复3-4d，将幼胚愈伤组织转移到选择性再生培养基(MS培养基中添加1mg/L BAP、1mg/L IAA、0.16mg/LCuSO₄、30mg/L G418)中，并置于组织培养室光照培养。幼胚愈伤组织每两周继代一次，直到假定的转基因苗长到4-6cm。然后将苗转入生根培养基(MS培养基中添加1mg/L NAA、1mg/LIAA、1mg/L IBA和0.16mg/L CuSO₄、30mg/L geneticin G418)中4周。将生根苗移入温室塑料盆中，7d后移入田间。

四、转基因植物的表型鉴定

1、转基因种子GUS染色

转基因种子T₀代转pUBI1301阳性植株经GUS染色后，转基因幼苗被染为蓝色，未转成功幼苗不被染色。如图2萌发的幼苗显示是被染色的转基因种子。

2、表型鉴定

在海南三亚和安徽凤阳转基因植物种植田种植了转基因高粱。转基因高粱在开花后6周收获整株高粱并称鲜重。转基因植株与对照的株型及茎杆长度对比图如图3所示。转基因植株与对照之间的t检验在https://www.graphpad.com/quickcalcs/ttest2/中进行。

利用基因枪法将SbSnf4(表1和图3)的过表达载体转入Tx430幼胚中。转化植株在T₁代测定了生物产量和糖锤度。结果表明，转基因植株的生物量和糖锤度均极显著高于对照，可见本专利所述的基因SbSnf4可以显著提高高粱的含糖量及生物产量。

表1SbSnf4过表达转基因T1茎秆含糖量与鲜重比较

序列表

<110> 安徽科技学院

路易斯安那大学拉法叶分校

<120> 多效性基因SbSnf4及其在提高高粱茎杆含糖量和生物产量中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1359

<212> DNA

<213> 高粱(sorghum)

<400> 1

atggtgctgc agcgcttctc gtggccgtac ggcggccgga gagcctcctt ctgcggcagc 60

ttcaccgggt ggagggagtg tcccatgggg ctggtcgggg ccgagttcca ggtcgtcttc 120

gatctgcctc ccggggttta ccagtaccgg tttttggttg atggtgtctg gaggtgtgat 180

gaggcgaaac cctttgtacg tgatgaatat ggattgatca gcaatgaagt gcttgtggaa 240

aacaatgtac aacctgttgt gcagccagag ccttctatca gaggaaccaa tgtggatgag 300

ggtatcattt tgacaacaat gcccccggag ccatcatctc agaacccagg cgtgcaaata 360

gcagttttcc gccatgtggt ctctgaaata ttattacaca ataccatata tgacgttgtt 420

cctatttcta gcaagttagc agttttggac actcagcttc ctgttaaaca agcatttaaa 480

ataatgcatg atgagggtct tgctctggtt cctctttggg atgaccatca gggaactata 540

acaggcatgc tcactgcatc agattttgta ttaatgttga gaaagttgca gagaaacatt 600

cgagttattg gcaatgaaga gcttgaaatg catcccattt ctgcttggaa agaagcaaag 660

ctacagtttt atggtgggcc tgatggtgct gccatgcaga gaaggccatt aatccatgtt 720

aaggattcag ataatttagt ggatgtggca ttgactataa tcagaaatga aatatcttca 780

gttcctatct ttaagtgcgt gccagattca acagggatgc ctttccttag tcttgcaacc 840

ctccagggga ttttgaaatt tctttgctcg aagctacaag aacaggctga gggctgttcc 900

cttctgcaca atcagcttct cagtattcct attggcacat ggtctccaca tacgggaagg 960

tcaagtagca ggcaactcag aactttgcta ctgagttctc ctctaaatac ctgcctggat 1020

tttctgcttc aagatagagt aagctcaatt cctatagttg atgacaatgg atccctccgt 1080

gacgtctact cactcagtga tatcatggct ctggcgaaga atgatgttta tgctcgcatc 1140

gaacttgaac aagtgactgt gcaaaatgct ttggatgtgc aataccaggt gcatggccga 1200

agacagtgtc atacttgttt acagacgagt accttgctgg aagtcttgga gggattgtct 1260

gttccaggag tgcgacggct tgttgttatt gaacaaagta ccagatttgt ggaaggaatc 1320

atctcattga gagacatttt tacatttctc cttggatag 1359

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> 高粱(sorghum)

<400> 2

Met Val Leu Gln Arg Phe Ser Trp Pro Tyr Gly Gly Arg Arg Ala Ser

1 5 10 15

Phe Cys Gly Ser Phe Thr Gly Trp Arg Glu Cys Pro Met Gly Leu Val

20 25 30

Gly Ala Glu Phe Gln Val Val Phe Asp Leu Pro Pro Gly Val Tyr Gln

35 40 45

Tyr Arg Phe Leu Val Asp Gly Val Trp Arg Cys Asp Glu Ala Lys Pro

50 55 60

Phe Val Arg Asp Glu Tyr Gly Leu Ile Ser Asn Glu Val Leu Val Glu

65 70 75 80

Asn Asn Val Gln Pro Val Val Gln Pro Glu Pro Ser Ile Arg Gly Thr

85 90 95

Asn Val Asp Glu Gly Ile Ile Leu Thr Thr Met Pro Pro Glu Pro Ser

100 105 110

Ser Gln Asn Pro Gly Val Gln Ile Ala Val Phe Arg His Val Val Ser

115 120 125

Glu Ile Leu Leu His Asn Thr Ile Tyr Asp Val Val Pro Ile Ser Ser

130 135 140

Lys Leu Ala Val Leu Asp Thr Gln Leu Pro Val Lys Gln Ala Phe Lys

145 150 155 160

Ile Met His Asp Glu Gly Leu Ala Leu Val Pro Leu Trp Asp Asp His

165 170 175

Gln Gly Thr Ile Thr Gly Met Leu Thr Ala Ser Asp Phe Val Leu Met

180 185 190

Leu Arg Lys Leu Gln Arg Asn Ile Arg Val Ile Gly Asn Glu Glu Leu

195 200 205

Glu Met His Pro Ile Ser Ala Trp Lys Glu Ala Lys Leu Gln Phe Tyr

210 215 220

Gly Gly Pro Asp Gly Ala Ala Met Gln Arg Arg Pro Leu Ile His Val

225 230 235 240

Lys Asp Ser Asp Asn Leu Val Asp Val Ala Leu Thr Ile Ile Arg Asn

245 250 255

Glu Ile Ser Ser Val Pro Ile Phe Lys Cys Val Pro Asp Ser Thr Gly

260 265 270

Met Pro Phe Leu Ser Leu Ala Thr Leu Gln Gly Ile Leu Lys Phe Leu

275 280 285

Cys Ser Lys Leu Gln Glu Gln Ala Glu Gly Cys Ser Leu Leu His Asn

290 295 300

Gln Leu Leu Ser Ile Pro Ile Gly Thr Trp Ser Pro His Thr Gly Arg

305 310 315 320

Ser Ser Ser Arg Gln Leu Arg Thr Leu Leu Leu Ser Ser Pro Leu Asn

325 330 335

Thr Cys Leu Asp Phe Leu Leu Gln Asp Arg Val Ser Ser Ile Pro Ile

340 345 350

Val Asp Asp Asn Gly Ser Leu Arg Asp Val Tyr Ser Leu Ser Asp Ile

355 360 365

Met Ala Leu Ala Lys Asn Asp Val Tyr Ala Arg Ile Glu Leu Glu Gln

370 375 380

Val Thr Val Gln Asn Ala Leu Asp Val Gln Tyr Gln Val His Gly Arg

385 390 395 400

Arg Gln Cys His Thr Cys Leu Gln Thr Ser Thr Leu Leu Glu Val Leu

405 410 415

Glu Gly Leu Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Leu Val Val Ile Glu Gln

420 425 430

Ser Thr Arg Phe Val Glu Gly Ile Ile Ser Leu Arg Asp Ile Phe Thr

435 440 445

Phe Leu Leu Gly

450

Claims

1.SEQ ID NO.1所示的基因，SEQ ID NO.2所示的蛋白质，含有SEQ ID NO.1所示的基因的重组表达载体、表达试剂盒或重组菌中的至少一种在培育糖含量及生物产量提高的转基因高粱中的应用。

2.一种培育糖含量及生物产量提高的转基因高粱的方法，是将SEQ ID NO.1所示的基因导入高粱中，得到高含糖量及高生物产量的转基因高粱。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：SEQ ID NO.1所示的基因通过重组表达载体导入高粱中。