JP7460246B2 - Ｃｈｋ遺伝子の過剰発現による改良されたシュート再生 - Google Patents

Description

本発明は、分子植物生物学の分野に関し、特に植物再生の分野に関する。本発明は、植物細胞の再生能力を改良する方法に関する。

植物育種は、有用で優れた形質の選択及び組換えを介して作物の生産性及び性能を改良すること、また遺伝子技術によりそのような植物形質を改良することを目的としている。これらの技術は、多くの場合、重要な技術的課題：どのように単一細胞から繁殖力のある植物に再生するかについて直面する。これは、遺伝的変化（突然変異誘発、ゲノム編集、遺伝子形質転換）を作製することを目的とした技術と、全体としてのゲノムに影響を及ぼす技術（ＤＨ産生、倍数化、体細胞ハイブリダイゼーション）の両方に当てはまる。これは、実現される遺伝的又はゲノム的な変化が１つ又は少数の細胞においてのみ生じ、生物体のすべての細胞において厳密に同じ方法で同時に生じることが決してないからである。したがって、これらの現在の技術の重要な制限は、所望の細胞を特定して選抜し、続いてそれらを完全で繁殖力のある植物に成長させることである。

ゲノム改良の技術は、改変された単一細胞が繁殖力のある植物全体にｉｎ ｖｉｔｒｏ再生される可能性により阻まれている。再生は、典型的には、最初に単一細胞が持続的細胞分裂を経て多細胞構造又はカルスを形成する段階を通過する。続いて、外因的に供給された植物成長調節物質の影響下で、多細胞塊内の細胞は組織化構造を形成する。したがって、再生は、少なくとも２つの連続する重要なステップ、すなわち、細胞分裂のステップと、その後の組織化構造を形成する分化のステップを含む。第１のステップは、カルス形成を含み得る。第２のステップは、デノボ分裂組織形成を含んでいなければならない。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの植物再生は、２つの選択的経路である器官形成と体細胞胚形成のうちの１つに従うが、それらのどちらも植物成長調節物質による誘導に依存する（Ｄｕｃｌｅｒｃｑら、２０１１、ＴＩＰＳ １６：５９７）。単子葉植物及び双子葉植物は、これら２つの選択的経路の両方又は一方のみのいずれかを使用して再生することができる。

双子葉植物における植物再生の一般的な経路は器官形成であり、そこでデノボ頂端分裂組織が未分化細胞から形成される。これらの分裂組織は、通常、成長してシュートを形成し、次いでそれは下部の細胞塊から分かれ、根を形成するように誘導される。器官形成は、典型的には、サイトカイニン、又はサイトカイニンが多くの場合に主に存在するオーキシン又はサイトカイニンの混合物を含有する培地で誘導される。サイトカイニンは、植物成長調物質又は植物ホルモン、アデニンの誘導体の一群であり、細胞分裂を促進することが可能である（Ｍｏｋ及びＭｏｋ、２００１、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５２：８９～１１８）。この群は、天然に存在するサイトカイニン、例えばゼアチンと、合成サイトカイニン、例えばキネチン及び６－ベンジルアミノプリン（６－ＢＡＰ）を含む。

単子葉植物種及び木本種において多くの場合確認される別の再生経路は、体細胞胚形成を介するものであり、それによって、カルスの未分化細胞は、適切な条件下で、胚形成細胞を生成し、最終的には、接合胚、いわゆる体細胞胚に似ている構造を形成する（Ｑｕｉｒｏｚ－Ｆｉｇｕｅｒｏａら、２００６、ＰＣＴＯＣ ８６：２８５～３０１）。次いで、これらの体細胞胚は、自発的に、又は低濃度の植物成長調物質下で、小さな小植物に変換される可能性がある。カルス又は細胞懸濁液における胚形成の潜在能力は、典型的には、天然の又は合成の植物成長調節物質の一群であるオーキシンにより誘導される。

主な障害は、繁殖可能で健全な植物に再生する植物細胞の能力が一般的に制限されていることである。再生の潜在能力は、植物の種、品種、組織起源に大きく依存する。確立されたプロトコルを用いたとしても、順調に植物まで再生する細胞の割合は、通常、極めて低い（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００７、Ｐｌａｎｔａ ２２５：３４１～３５１）。再生が失敗するか、又は効率が不十分である植物種又は品種は、扱いが困難と考えられる。器官形成において扱いが困難な作物種の例は、トウガラシ、ダイズ、キュウリ及びサトウダイコンである。

これまで、扱いの困難性は、多くの場合、組織培養条件（培地組成、光、温度）における経験的な変更による試行錯誤のアプローチによって対処されており、成功には限界があった。このようにして開発されたプロトコルは、遺伝子型及び実験室の条件に依然として依存しており、そのため、ある程度まで予測不可能である。

器官形成又は体細胞胚形成による再生は、導入遺伝子の異所性発現によって増強することができる。このようなアプローチの一例は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＥＳＲ１（ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ転写因子）の過剰発現であり（Ｂａｎｎｏら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １３：２６０９～２６１８）、根外植片からシュート再生が増強される。別の例は、タバコにおけるＡＰ２／ＥＲＦ転写因子であるＢＢＭの過剰発現であり（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００７、Ｐｌａｎｔａ ２２５：３４１～３５１）、シュート形成が増加し、体細胞胚形成に関する能力が高くなる。しかし、これらの転写因子の構成的発現は、形態学的欠陥及び発達上の欠陥をもたらすので、これらは、外因的に供給される誘導物質（それぞれ、エストラジオール誘導システム及びデキサメタゾン誘導システム）による発現の調節を必要とする。したがって、発現の調節の必要性により、現在、再生のための導入遺伝子の使用は制限されている。

したがって、植物の発生能力を改良すること、特に、低い又は不十分な再生能力を有する植物の発生能力を改良することが当技術分野において依然として必要とされている。特に、導入遺伝子の発現の調節を必要とすることなく、植物の再生能力を改良することもまた当技術分野において必要とされている。

第１の態様では、本発明は、植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力を改良する方法であって、植物細胞におけるヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップを含み、ヒスチジンキナーゼがＣＨＫ２、ＣＨＫ３及びＣＨＫ４のうちの少なくとも１つであり、好ましくは、ヒスチジンキナーゼがＣＨＫ２及びＣＨＫ４のうちの少なくとも１つであり、好ましくは、ヒスチジンキナーゼがＣＨＫ４である、方法に関する。

一実施形態では、ヒスチジンキナーゼは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされており、好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号３と少なくとも５０％の配列同一性を有する。

好ましくは、植物細胞の前記再生能力は、ヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有していない同一の植物細胞と比較して改良されている。

一実施形態では、ヒスチジンキナーゼのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のうちの少なくとも１つと少なくとも５０％の配列同一性を有し、好ましくは、ヒスチジンキナーゼのアミノ酸配列は配列番号６と少なくとも５０％の配列同一性を有する。

好ましくは、ヒスチジンキナーゼの発現は、植物細胞において一過的に増加又は導入される。

本発明の一実施形態では、ヒスチジンキナーゼの発現は、植物細胞において連続的に増加又は導入される。

好ましくは、植物細胞はオオムギ、キャベツ、キャノーラ、カッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、ナタネ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ライムギ、モロコシ、西洋カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、アマトウガラシ、トマト、スイカ、コムギ、ズッキーニ、ダイズ、キク、及びシロイヌナズナからなる群から選択される植物から得ることができる。

さらなる実施形態では、サイトカイニンはアデニン型サイトカイニンであり、好ましくは、アデニン型サイトカイニンはキネチン、ゼアチン、トランス－ゼアチン、シス－ゼアチン、ジヒドロゼアチン、６－ベンジルアミノプリン及び２ｉＰからなる群から選択される。

第２の態様では、本発明は、
本明細書で定義した植物細胞を、サイトカイニンを含む培地でインキュベートするステップと；
植物細胞を植物に再生させるステップと
を含む、植物を再生する方法に関する。

好ましくは、培地は少なくとも１つのさらなる植物ホルモンを含み、好ましくは、１つのさらなる植物ホルモンはオーキシンである。

一実施形態では、植物細胞は多細胞組織、好ましくはカルス組織、植物器官又は外植片の一部分である。

好ましくは、外植片は胚軸外植片、茎部外植片、子葉外植片、根外植片、葉外植片、花外植片及び分裂組織のうちの少なくとも１つである。

さらなる実施形態では、培地中のサイトカイニン濃度は約１００～３０００ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは、サイトカイニン濃度は約２００～６００ｎｇ／ｍｌである。

本発明の実施形態では、改良されたサイトカイニン誘導性再生能力は、改良された分裂組織形成、改良された不定シュート形成、改良された花序形成、改良された体細胞胚形成、改良された根形成、改良された不定シュートの伸長、及び改良された完全な植物の再生の群から選択される。

第３の態様では、本発明は、本明細書で定義した本発明の方法によって得ることができる植物又は植物部分に関し、好ましくは、植物部分は、種子、果実又は非増殖材料である。

別の態様では、本発明は、配列番号３と少なくとも５０％の配列同一性を有する第１のヌクレオチド配列と、配列番号１と少なくとも５０％の配列同一性を有する第２のヌクレオチド配列とを含む発現構築物であって、好ましくは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つは調節エレメントに作動可能に連結されている、発現構築物に関する。

さらなる態様では、本発明は、植物のサイトカイニン誘導性再生能力を改良するための、ＣＨＫ２、ＣＨＫ３及び／又はＣＨＫ４ヒスチジンキナーゼ或いは本明細書で定義した発現構築物の使用に関する。

定義
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関係する様々な用語は、本明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される。そのような用語は、別段の指示のない限り、本発明が関係する技術分野におけるそれらの通常の意味を与えられるものとする。他の詳細に定義された用語は、本明細書で提供された定義と一致する形で解釈されるものとする。

本明細書に記載されたものと類似の又は等価の任意の方法及び材料を本発明の実施に使用できることは、当業者には明らかである。

本発明の方法において使用される従来の技術を実施する方法は、当業者には明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シーケンシング、及び関連分野における従来の技術の実施は、当業者には周知であり、例えば、以下の参考文献で論じられている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．、１９８９； Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ；並びに、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ。

単数形用語の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で明確に指示されていない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及には、２つ以上の細胞の組合せなどが含まれる。したがって、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つの」を意味する。

用語の「及び／又は」とは、記載されたケースの１つ又は複数が、単独で、又は記載されたケースのすべてに至るまでの、記載されたケースの少なくとも１つと組み合わせて起こり得る状況を意味する。

本明細書で使用される場合、用語の「約」とは、小さな変動を記載及び説明するために使用される。例えば、この用語は、±（＋又は－）１０％以下、例えば±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下、又は±０．０５％以下を意味し得る。さらに、量、比及び他の数値は、本明細書では範囲形式で示される場合がある。そのような範囲形式は、便宜性と簡潔性のために使用され、範囲の限界として明確に指定された数値を含むだけでなく、あたかも各数値及び部分的範囲が明確に指定されているようにその範囲内に含まれるすべての個々の数値又は部分的範囲が含まれるように柔軟に理解されるべきであることを理解されたい。例えば、約１～約２００の範囲内の比は、約１と約２００の明確に述べられた限界を含むだけでなく、個々の比、例えば、約２、約３及び約４、並びに部分的範囲、例えば、約１０～約５０、約２０～約１００などを含むものと理解されたい。

用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、包括的及びオープンエンドであり、排他的ではないと解釈される。詳細には、この用語及びその変形は、指定された特徴、ステップ、又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、又は構成要素の存在を除外するものと解釈されるものではない。

用語の「タンパク質」又は「ポリペプチド」とは同義的に使用され、特定の作用機序、サイズ、三次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を意味する。したがって、タンパク質の「断片」又は「部分」は、依然として「タンパク質」と呼ばれ得る。「単離されたタンパク質」は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、又は組換え細菌若しくは植物宿主細胞において、その自然環境にはもはや存在しないタンパク質を意味するために使用される。

「植物」とは、植物全体か、又は植物の一部分、例えば、植物から得ることができる細胞、組織又は器官（例えば、花粉、種子、配偶子、根、葉、花、花芽、葯、果実など）、並びにこれらのいずれかの誘導物及び自殖又は交配によってそのような植物に由来する後代を意味する。

「植物細胞（複数可）」は、分離した、又は組織、器官若しくは生物内の、プロトプラスト、配偶子、浮遊培養物、小胞子、花粉粒などを含む。植物細胞は、多細胞構造の一部分、例えば、カルス、分裂組織、植物器官又は外植片などであり得る。

植物／植物細胞を培養するための「同様の条件」とは、とりわけ、同様の温度、湿度、栄養及び光条件、並びに同様の灌水及び昼／夜リズムの使用を意味する。

用語の「相同性」、「配列同一性」等は、本明細書では同義的に使用される。配列同一性は、本明細書では、配列の比較により決定される場合、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列間又は２つ以上のヌクレオチド（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」もまた、場合によっては、そのような配列のストリング間の一致によって決定される場合、アミノ酸間又は核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、アミノ酸配列及び１つのポリペプチドのその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に計算することができる。配列同一性／類似性のパーセンテージは、配列の全長に対して決定することができる。

「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバルアラインメント又はローカルアラインメントのアルゴリズムを使用する２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、グローバルアラインメントアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用してアラインメントされるが、これは、配列を全長にわたり最適にアラインメントし、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用してアラインメントされる。次いで、（例えば、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによってデフォルトのパラメーターを使用して最適にアラインメントされた場合に）配列同一性（以下に定義）の少なくともある特定の最小パーセンテージを共有する場合、配列は「実質的に同一の」又は「本質的に類似の」と呼ぶことができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列を全長（完全長）にわたりアラインメントし、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小にする。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合、配列同一性を決定するために適切に使用される。一般的に、ＧＡＰデフォルトパラメーターが使用され、ｇａｐクリエーションペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）であり、ｇａｐエクステンションペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ ８９、９１５～９１９）。配列アラインメント及び配列同一性のパーセンテージのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．， ９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータープログラムを使用して、又はオープンソースソフトウェア、例えば、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮ バージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）を使用して、又は上記のＧＡＰと同じパラメーターを使用して、若しくはデフォルト設定を使用して（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質アラインメント及びＤＮＡアラインメントの両方について、デフォルトＧａｐオープニングペナルティは１０．０であり、デフォルトｇａｐエクステンションペナルティは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてはＢｌｏｓｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）決定することができる。配列が実質的に異なる全長を有する場合、ローカルアラインメント、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するものが好ましい。

或いは、類似性又は同一性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどを使用して、公開データベースに対して検索することにより決定することができる。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列を、公開データベースに対して検索を実行する「クエリー配列」としてさらに使用し、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３～１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘのプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ化アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９～３４０２に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えばＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照されたい。

用語の「核酸構築物」、「核酸ベクター」、「ベクター」及び「発現構築物」は、本明細書では同義的に使用され、また本明細書では、組換えＤＮＡ技術の使用から得られる人工の核酸分子として定義される。したがって、用語の「核酸構築物」及び「核酸ベクター」は、天然に存在する核酸分子を含まないが、核酸構築物は、天然に存在する核酸分子（の一部分）を含むことができる。

ベクター骨格は、例えば、バイナリーベクター又はスーパーバイナリーベクター（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許出願公開第２００２／１３８８７９号、及び国際公開第９５／０６７２２号を参照）であり得るか、当技術分野で公知であって本明細書の他の箇所に記載されているキメラ遺伝子が組み込まれる、又は適切な転写調節配列が既に存在している場合には所望の核酸配列（例えば、コード配列、アンチセンス配列又は逆方向反復配列）のみが転写調節配列の下流に組み込まれる、コインテグレート（ｃｏ－ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）ベクター又はＴ－ＤＮＡベクターであり得る。ベクターは、分子クローニングでの使用を容易にするさらなる遺伝的エレメント、例えば、選択可能マーカー、マルチクローニング部位などを含むことができる。

用語の「遺伝子」とは、適切な調節領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結されている、細胞内のＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、通常、いくつかの作動可能に連結された断片、例えば、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）を含む。

「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性な、すなわち生物学的に活性なタンパク質又はペプチドに翻訳されることが可能なＲＮＡに転写されるプロセスを意味する。

用語の「作動可能に連結された」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を意味する。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーター、又はむしろ転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。動作可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接していることを意味し得る。

「プロモーター」は、１つ又は複数の核酸の転写を調節するように機能する核酸断片を意味する。プロモーター断片は、好ましくは、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流（５’）に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位（複数可）の存在によって構造的に同定され、また、限定するものではないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、並びに直接的又は間接的に作用してプロモーターからの転写量を調節するための当業者に公知の他の任意のヌクレオチド配列を含む、他の任意のＤＮＡ配列もさらに含むことができる。

任意選択で、用語の「プロモーター」はまた、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）も含むことができる（例えば、プロモーターは、本明細書では、この領域が転写及び／又は翻訳の調節における役割を有し得るので、転写領域の翻訳開始コドンの上流の１つ又は複数の部分を含み得る）。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的条件及び発達的条件下で、ほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的に（例えば、ある特定の化合物の外部からの適用により）又は発達的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織又は細胞においてのみ活性である。

用語の「再生」とは、本明細書では、単一の植物細胞、カルス、外植片、組織から、又は器官からの新しい組織及び／又は新しい器官の形成として定義される。好ましい再生経路は、器官形成、すなわち（未分化）細胞からの新しい器官の形成である。好ましくは、再生は、異所性頂端分裂組織形成、シュート再生、及び根再生のうちの少なくとも１つである。本明細書で定義した再生は、好ましくは、少なくともデノボシュート形成に関係があり得る。例えば、再生は、（花序）シュートに向けての（伸長）胚軸外植片の再生であり得る。

再生は、単一植物細胞からの、又は、例えばカルス、外植片、組織若しくは器官からの新しい植物の形成をさらに含むことができる。再生プロセスは、親組織から直接的に、又は間接的に、例えばカルスの形成を介して生じ得る。

用語の「再生を可能にする条件」とは、本明細書では、植物細胞又は組織が再生することができる環境として理解される。そのような条件は、最低でも、適切な温度（すなわち０℃～６０℃）、栄養、昼／夜リズム、灌水、及び植物ホルモンサイトカイニンを含む。これらの条件には、実施例において明示した条件の１つ、２つ、又は３つが含まれ得る。さらに、「再生を可能にする最適条件」とは、植物細胞の最大の再生を可能にする環境条件である。

用語の「導入された発現」及び「デノボ発現」とは、本明細書では置き換え可能に使用される。

本発明者らは、植物細胞におけるヒスチジンキナーゼの発現を導入すること又は増強することが、サイトカイニンを含む培地において増殖させた場合に、この植物細胞の再生能力を増加させることを発見した。再生の潜在能力は、同じサイトカイニン含有培地において増殖させた非改変の植物細胞と比較して驚くほど増加した。したがって、ヒスチジンキナーゼを植物細胞に導入することにより、サイトカイニンの効果が有意に増強される。サイトカイニン含有培地での細胞の増殖と組み合わせてヒスチジンキナーゼの発現を増加させるこの効果の増強は、細胞が再生する最大能力を驚くほどに増加させた。したがって、本発明者らは、ヒスチジンキナーゼを植物細胞に導入させると、サイトカイニン含有培地において増殖させた場合に、不十分な再生能力を有する植物細胞を、再生することができる植物細胞に変換することができることを発見した。

いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、ヒスチジンキナーゼ遺伝子、例えば、サイトカイニン受容体分子をコードするＣＨＫ遺伝子は、植物をより感受性にし、結果的に、サイトカイニンに対して応答性が高くなり、シュート再生能力を著しく改良するように思われる。ＣＨＫ遺伝子は、これまでサイトカイニンシグナル変換に関与されているとされており（Ｋａｋｉｍｏｔｏ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９８２～９８５）、またＣＨＫ遺伝子の発現増強はサイトカイニン応答に起因する機能に関連しているが、再生能力には関連していなかった（Ｄｅｎｇら、２０１０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２２：１２３２～１２４８）。

国際公開第０２／０９９０７９号、欧州特許出願公開第２２７２８６２号、及びＲｉｅｆｌｅｒ Ｍら（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．１８ （２００６）：ｐ４０～５４）は、サイトカイニン応答レギュレーター及びその使用に関係している。しかし、これらの文書は、ヒスチジンキナーゼの発現とサイトカイニン含有培地における細胞の維持との組合せについては記載していない。特に、本発明者らは、サイトカイニン含有培地における細胞の維持と組み合わせた細胞におけるヒスチジンキナーゼの発現が、細胞をそれらの自然の最大の再生能力よりも高くまで押し上げることができることをここに示している。

第１の態様において、本発明は、したがって、植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力を改良する方法であって、植物細胞におけるヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップを含む、方法に関する。

植物細胞は、プロトプラストであってもよい。サイトカイニン誘導性再生は、本明細書では、少なくともサイトカイニンに曝露された場合の植物細胞の再生として、例えば、植物細胞の再生を可能にする条件下でサイトカイニンに曝露された場合の植物細胞の再生応答として定義される。

植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力は、本明細書では、植物細胞の再生を可能にする条件下で、好ましくは最適条件下で、少なくとも植物ホルモンサイトカイニンに曝露された場合に、植物細胞が再生する最大能力として理解される。植物細胞がサイトカイニン含有培地において再生するある特定の固有の最大の潜在能力を有することは、当技術分野において周知である。例えば、タバコ植物などから得られる植物細胞の最大の再生潜在能力は、通常、例えばキュウリ植物から得られる植物細胞の最大の再生潜在能力よりも高い。植物細胞の再生能力は、多細胞組織（複数可）にデノボ形成されたシュートの数を決定することによって評価することができる。再生の誘導の際の非限定的な例として、タバコ多細胞組織は、同じ数のキュウリ多細胞組織と比較して、多細胞組織につき、より多数のデノボ形成されたシュートを提供することができる。好ましい多細胞組織は、カルス又は外植片である。

さらに又は或いは、植物細胞が再生する最大の潜在能力は、例えば、出発材料の量を、サイトカイニンへの曝露後に再生される材料の量と比較することによって測定することができる。非限定的な例として、出発材料を形成する多細胞組織の数を決定することができる。続いて、再生を可能にする条件下で、好ましくは最適条件下で、少なくともサイトカイニンに曝露した後、再生される多細胞組織の数を決定することができる。再生された多細胞組織のパーセンテージは、本明細書では、植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力であると理解される。非限定的な例として、出発材料は、胚軸外植片、例えば伸長した胚軸外植片であり得、及び／又は再生組織は、シュート、例えば花序シュートであり得る。

サイトカイニン誘導性再生は、分裂組織形成、不定シュート形成、花序形成、体細胞胚形成、根形成、不定シュートの伸長、及び完全な植物の再生のうちの少なくとも１つであってよい。非限定的な例として、多細胞組織当たりのデノボ形成されたシュートの数を決定することができる。

当業者は、サイトカイニン誘導性再生能力を決定するための当分野において公知の他の同様の方法があることが分かる。

好ましくは、植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力は、好ましくは、同じ若しくは実質的に同じ条件下で、又は最適条件下で試験された場合の対照と比較して改良される。好ましくは、前記対照は、改変されたか又は新たに導入されたヒスチジンキナーゼを除いて、本発明の方法によって得られるか、又は得ることができる植物細胞と比較して、同じ遺伝的背景を有する同一の又は実質的に同一の植物細胞である。言い換えれば、好ましくは、対照は、本発明の方法のヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップの前に、本発明の方法によって得られる植物細胞と遺伝的に同一である植物細胞である。したがって、好ましくは、同一の植物細胞又は実質的に同一の植物細胞は、改良された再生能力を有する植物細胞と同じ遺伝的背景を有するが、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの導入又は増加された発現は有していない。

植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力は、再生を可能にする条件下、好ましくは最適条件下での、植物細胞の再生する最大の潜在能力である。最適条件は、好ましくは、少なくとも最適濃度のサイトカイニンを含む。

再生能力は、再生する出発材料のパーセンテージとして表すことができる。非限定的な例として、３６０個の外植片のうちの７個が再生を可能にする状態下で再生する場合、再生能力は（７／３６０^＊１００％）１．９％である。本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの発現は、改良された再生能力を可能にする。非限定的な例として、ヒスチジンキナーゼの導入又は増加された発現は、同様の又は実質的に同じ再生条件下で増殖させた場合、再生された外植片の数は、例えば１６０まで増加し得る。再生能力は、（１６０／３６０^＊１００％）４４．４％に増加した。したがって、再生能力は、（４４．４－１．９）４２．５％改良された（例えば表２を参照）。さらなる非限定的な例として、植物細胞の再生能力は、ある特定の時点で外植片ごとに形成されたシュートの数として表すことができる。例えば、誘導された再生の１８３日後に、２００個の外植片からヒスチジンキナーゼの導入又は増加された発現を有する９３個のシュートを回収することができ（表４も参照）、１８３日目の再生能力は（９３／２００^＊１００％）４６．５％である。同時に、２００個の対照外植片から６４個のシュートを回収することができ、１８３日目の再生能力は（６４／２００^＊１００％）３２％である。したがって、再生能力は（（４６．５－３２）／３２^＊１００％）４５％改良された（例えば表４を参照）。

非限定的な例として、サイトカイニン誘導性再生能力の改良は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有する植物細胞と、前記の増加又は導入された発現を有していない同一細胞との間の再生能力の差として表すことができる。好ましくは、植物細胞の再生能力は、ヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有していない同一の植物細胞と比較して、少なくとも約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％改良される。

当業者は、本発明の方法において同様に使用することができる、サイトカイニン誘導性再生能力の改良を決定するための当分野における他の適切な方法があることが分かる。

再生された植物細胞は、好ましくは、分裂組織形成又はデノボ分裂組織形成、シュート形成又は不定シュート形成、花序形成、体細胞胚形成、根形成、不定シュートの伸長及び完全な植物の再生のうちの少なくとも１つを有する。

この方法は、例えば、植物細胞を改良された再生能力について試験することをさらに含むことができる。改良された再生能力は、好ましくは、対照と比較して改良され、その対照は、好ましくは、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有さない同一の植物細胞である。

非限定的な例として、その試験ステップは、デノボ形成されたシュートの数を決定することにより実施することができる。したがって、本発明の方法は、例えば、デノボ形成されたシュートの数を決定するステップ、例えばカウントするステップをさらに含むことができる。デノボ形成されたシュートの数は、シュート形成の前に、多細胞組織の数、好ましくは外植片の数に関して決定することができる。或いは又はさらに、分裂組織の数、又はそれに由来する任意の組織を決定することができる。しかし、カルス又は「グリーンカルス」の形成が、形成され得るシュートの数を示してはいないことは本明細書において理解される。カルスの形成は増殖の指標となり得るが、組織化／分化の指標にはなり得ない。

さらなる非限定的な例として、試験するステップは、再生する外植片の数を決定することによって実施することができる。したがって、本発明の方法は、例えば、再生した外植片の数を決定するステップ、例えばカウントするステップをさらに含むことができる。再生された外植片の数は、出発材料を形成した外植片の数に関して決定することができる。

本発明において使用するためのヒスチジンキナーゼは、リン酸基を特定の基質上のヒスチジン残基に転移することができるタンパク質である。好ましくは、本発明において使用するためのヒスチジンキナーゼは膜貫通タンパク質であり、サイトカイニンの細胞受容体として作用し得る。サイトカイニンに結合する際、ヒスチジンキナーゼはシグナル伝達を開始し、Ｂ型ＡＲＲ（シロイヌナズナ応答レギュレーター）を活性化させ、それに続いてサイトカイニン制御型転写をもたらす。

ヒスチジンキナーゼは、ヒスチジンキナーゼ（ＣＨＫ）を含有するＣＨＡＳＥドメインであり得る。これらの受容体は、好ましくは、ＣＨＡＳＥ（Ｃｙｃｌａｓｅ／Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｓｅｎｓｏｒｙ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）と呼ばれる細胞質外センシングドメインに隣接する好ましくは少なくとも２つの疎水性膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含むＮ末端部分、並びに触媒ヒスチジンキナーゼ（ＨＫ）ドメインと、レシーバードメイン及び偽性レシーバードメインの両方（それぞれ、ＲＥＣ及びＲＥＣ様）を含有する細胞質Ｃ末端部分を含む複合マルチドメイン構造を示す。ＨＫドメインは、好ましくは、ＨＫ二量体化及びリン酸化受容体ドメイン（ＨｉｓＫＡ）及びＨＫ様ＡＴＰａｓｅドメイン（ＨＡＴＰａｓｅ）と呼ばれるＨＫ触媒ドメインから構成される（Ｄａｕｄｕら、「ＣＨＡＳＥ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｅ Ｔｒｅｅ： Ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． （２０１７）；８：１６１４）。

本発明において使用するためのヒスチジンキナーゼは、植物細胞に固有のタンパク質、例えば、細胞内において発現又は過剰発現される内因性ヒスチジンキナーゼタンパク質であり得る。したがって、内因性タンパク質は、野生型植物細胞のゲノム内にコードされており、その発現が導入又は増強されるタンパク質であり得る。さらに又は或いは、内因的にコードされたタンパク質の追加コピーを植物細胞に導入することができる。

一実施形態では、本発明において使用するためのヒスチジンキナーゼは、植物細胞に対して天然ではなく、すなわち外因性である。そのような外因性タンパク質は、相同タンパク質であり得る。そのタンパク質は、同じ亜属、属、連、亜科、科、目及び／又は分岐群に由来し得る。或いは、そのタンパク質は、異なる亜属、属、連、亜科、科、目及び／又は分岐群に由来し得る。ヒスチジンキナーゼタンパク質は、人工タンパク質であり得、例えば、天然には存在しないが、天然に存在するヒスチジンキナーゼと同一の又は同様の機能を発揮するタンパク質であり得る。

好ましい実施形態では、ヒスチジンキナーゼは、ＣＨＫ２、ＣＨＫ３及びＣＨＫ４のうちの少なくとも１つである。好ましくは、ヒスチジンキナーゼは、ＣＨＫ２及びＣＨＫ４のうちの少なくとも１つである。一実施形態では、ヒスチジンキナーゼはＣＨＫ２である。別の実施形態では、ヒスチジンキナーゼはＣＨＫ４である。本明細書では、ヒスチジンキナーゼの組合せの発現が植物細胞において導入又は増加されることを想定している。例えば、少なくとも２つの異なるＣＨＫ２タンパク質、少なくとも２つの異なるＣＨＫ３及び／又は少なくとも２つの異なるＣＨＫ４タンパク質の発現が植物細胞において増加又は導入される。或いは又はさらに、植物細胞は、少なくともＣＨＫ２及びＣＨＫ４タンパク質、少なくともＣＨＫ２及びＣＨＫ３タンパク質、又は少なくともＣＨＫ３及びＣＨＫ４タンパク質の増加又は導入された発現を有していてもよい。植物細胞は、本明細書で定義した少なくともＣＨＫ２、ＣＨＫ３及びＣＨＫ４タンパク質の増加又は導入された発現を有することができる。

本発明のヒスチジンキナーゼは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。好ましくは、ＣＨＫ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有することができる。配列番号１は、ＡＨＫ２とも注釈付けされている、シロイヌナズナのＣＨＫ２コード配列である。

好ましくは、ＣＨＫ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。配列番号２は、ＡＨＫ３とも注釈付けされている、シロイヌナズナのＣＨＫ３コード配列である。

好ましくは、ＣＨＫ４をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。配列番号３は、ＡＨＫ４、ＣＲＥ１、ＷＯＬ１、ＷＯＯＤＥＮ ＬＥＧ１とも注釈付けされている、シロイヌナズナのＣＨＫ４コード配列である。

一実施形態では、ＣＨＫ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子Ａｔ５ｇ３５７５０（配列番号７）、その相同体、又はＡｔ５ｇ３５７５０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列であるか、又はそれらに由来する。同一性のパーセンテージは、ゲノム配列の全長にわたり決定することができる。或いは、同一性のパーセンテージは、遺伝子のコード配列の全長にわたり決定することができる。

相同体の例としては、グリシン・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０２Ｇ４７６１１又はＧＬＹＭＡ１４Ｇ０１０４０）、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（イネ）（ＯＳ１０Ｇ０３６２３００、ＯＳＪＮＢＡ００５８Ｅ１９．１又はＯＳＪＮＢＡ００７３Ｌ０１．１）、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿００１４Ｓ１６２６０Ｇ）、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＳＯＬＹＣ０７Ｇ０４７７７０．２）、及びビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）（ＶＩＴ＿１２Ｓ００５７Ｇ００６９０）が挙げられる。好ましい相同体は、ソラヌム・リコペルシクムＳＯＬＹＣ０７Ｇ０４７７７０．２である。

好ましくは、ＣＨＫ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＳＯＬＹＣ０７Ｇ０４７７７０．２（配列番号３０）、その相同体、及び／又はＳＯＬＹＣ０７Ｇ０４７７７０．２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列であるか、又はそれらに由来する。同一性のパーセンテージは、ゲノム配列の全長にわたり決定することができる。或いは、同一性のパーセンテージは、遺伝子のコード配列の全長にわたり決定することができる。

一実施形態では、ＣＨＫ３タンパク質をコードする配列は、遺伝子Ａｔ１ｇ２７３２０（配列番号８）、その相同体、又はＡｔ１ｇ２７３２０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列であるか、又はそれらに由来する。同一性のパーセンテージは、ゲノム配列の全長にわたり決定することができる。或いは、同一性のパーセントは、遺伝子のコード配列の全長にわたり決定することができる。

相同体の例としては、ブラキポディウム・ディスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ２Ｇ５９１２７）、グリシン・マクス（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０５Ｇ２８０７０又はＧＬＹＭＡ０８Ｇ１１０６０）、オリザ・サティバ（イネ）（Ｂ１４５５Ｆ０６．３３）、ポプラス・トリコカルパ（ブラックコットンウッド）（ＨＫ３Ａ又はＰＯＰＴＲ＿０００３Ｓ１６９５０Ｇ）、ソラヌム・リコペルシクム（トマト）（ＳＯＬＹＣ０５Ｇ０１５６１０．２）及びビティス・ビニフェラ（ブドウ）（ＶＩＴ＿０１Ｓ００１０Ｇ０３７８０）が挙げられる。

一実施形態では、ＣＨＫ４タンパク質をコードする配列は、遺伝子Ａｔ２ｇ０１８３０（配列番号９）、その相同体、又はＡｔ２ｇ０１８３０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列であるか、又はそれらに由来する。同一性のパーセンテージは、ゲノム配列の全長にわたり決定することができる。或いは、同一性のパーセンテージは、遺伝子のコード配列の全長にわたり決定することができる。

相同体の例としては、ブラキポディウム・ディスタキオン（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ１Ｇ１０６６０）、グリシン・マクス（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０２Ｇ０９５５０、ＧＬＹＭＡ０５Ｇ３４３１０、ＧＬＹＭＡ０７Ｇ１９６２０、ＧＬＹＭＡ０７Ｇ２７５４０又はＧＬＹＭＡ０８Ｇ０５３７０）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）（コケ）（ＣＫＩ３Ａ、ＣＫＩ３Ｂ、ＣＫＩ３Ｃ、ＣＲＥ１、ＣＲＥ２、ＣＲＥ３、ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１６２４７３、ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１６９２９３、ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１７２２２５、ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿２２９０９５又はＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿６８０５３）、ポプラス・トリコカルパ（ブラックコットンウッド）（ＣＲＥ１Ｂ、ＰＯＰＴＲ＿０００８Ｓ１３７２０Ｇ）、ソラヌム・リコペルシクム（トマト）（ＳＯＬＹＣ０４Ｇ００８１１０．２）、モロコシ（モロコシ）（ＳＢ０１Ｇ０１００７０）及びビティス・ビニフェラ（ブドウ）（ＶＩＴ＿０１Ｓ００１１Ｇ０６１９０）が挙げられる。

ヒスチジンキナーゼをコードする配列は、植物細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよく、好ましくは、本発明の方法の植物細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。非限定的な例として、発現された、又はデノボ発現されたヒスチジンキナーゼは内因性タンパク質であり得るが、この内因性タンパク質をコードする配列は、外因性のコドン最適化された配列である。或いは、コドン最適化配列は、植物細胞にとって外因性であるヒスチジンキナーゼをコードすることができる。

一実施形態では、ヒスチジンキナーゼのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のうちの少なくとも１つと少なくとも５０％の配列同一性を有する。

ＣＨＫ２をコードするアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。配列番号４は、シロイヌナズナＣＨＫ２タンパク質である。

或いは、ＣＨＫ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。配列番号５は、シロイヌナズナのＣＨＫ３タンパク質である。

好ましくは、ＣＨＫ４をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号６と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。配列番号６は、シロイヌナズナのＣＨＫ４タンパク質である。

一実施形態では、ＣＨＫ２アミノ酸配列は、ＡＴ５Ｇ３５７５０．１（ＡＨＫ２）、その相同体、又はＡＨＫ２若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列であるか、又はそれらに由来する。好ましい相同体は、配列番号３１の配列を有するソラヌム・リコペルシクムＣＨＫ２（ＳｌｙＣＨＫ２）、及び／又はＳｌｙＣＨＫ２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列である。

相同体の例としては、グリシン・マクス（ダイズ）（Ｋ７ＫＢＲ１又はＫ７Ｍ４７６）、オリザ・サティバ（イネ）（Ｑ０ＩＹ６５、Ｑ９ＡＵＱ０又はＱ８Ｓ６Ｐ５）、ポプラス・トリコカルパ（ブラックコットンウッド）（Ｂ９ＩＡＲ０）、ソラヌム・リコペルシクム（トマト）（Ｋ４ＣＥＹ３）及びビティス・ビニフェラ（ブドウ）（Ｆ６ＨＨＭ７）が挙げられる。

一実施形態では、ＣＨＫ３アミノ酸配列は、ＡＴ１Ｇ２７３２０（ＡＨＫ３）、その相同体、又はＡＨＫ３若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列であるか、又はそれらに由来する。

相同体の例としては、ブラキポディウム・ディスタキオン（ミナトカモジグサ）（Ｉ１ＨＵＰ８）、グリシン・マクス（ダイズ）（Ｉ１Ｋ３Ｍ７又はＩ１ＫＳ３０）、オリザ・サティバ（イネ）（Ｑ５ＪＪＰ１）、ポプラス・トリコカルパ（ブラックコットンウッド）（Ｂ９ＧＭＬ７又はＢ９ＧＺＰ２）、ソラヌム・リコペルシクム（トマト）（Ｋ４ＢＹＳ７）及びビティス・ビニフェラ（ブドウ）（Ｄ７ＴＡＺ７）が挙げられる。

一実施形態では、ＣＨＫ４アミノ酸配列は、ＡＴ２Ｇ０１８３０（ＡＨＫ４）、その相同体、又はＡＨＫ４若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列であるか、又はそれらに由来する。

相同体の例としては、ブラキポディウム・ディスタキオン（ミナトカモジグサ）（Ｉ１ＧＮＺ３）、グリシン・マクス（ダイズ）（Ｋ７Ｋ７６７、Ｋ７ＫＲＨ０、Ｋ７Ｌ２１０、Ｋ７Ｌ２Ｃ５又はＩ１ＫＱＥ９）、フィスコミトレラ・パテンス（コケ）（Ａ９ＲＭＥ１、Ａ９ＳＪＭ１、Ａ９Ｔ３Ｔ９、Ａ９Ｓ５Ｕ９、Ａ９ＴＡＦ３、Ａ９ＴＫＮ３、Ａ９Ｓ２Ｌ４、Ａ９ＴＣＨ３、Ａ９ＴＶＭ０、Ａ９ＳＥＵ１又はＡ９ＲＭＥ０）、ポプラス・トリコカルパ（ブラックコットンウッド）（Ｂ９ＨＶＳ３又はＢ９ＨＪＪ３）、ソラヌム・リコペルシクム（トマト）（Ｋ４ＢＮＷ７）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）（モロコシ）（Ｃ５ＷＮ０４）及びビティス・ビニフェラ（ブドウ）（Ｆ６ＨＦＢ２）が挙げられる。

本発明の一実施形態では、増加又は導入された発現を有するヒスチジンキナーゼは、機能性ヒスチジンキナーゼである。機能性ヒスチジンキナーゼは、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の配列番号４、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列を有するヒスチジンキナーゼの機能と同一の又は類似の機能を植物細胞において果たす。本明細書で定義したＣＨＫ２は、好ましくは、シロイヌナズナの配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同一の又は類似の機能を植物細胞において果たす。本明細書で定義したＣＨＫ３は、好ましくは、シロイヌナズナの配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同一の又は類似の機能を植物細胞において果たす。本明細書で定義したＣＨＫ４は、好ましくは、シロイヌナズナの配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同一の又は類似の機能を植物細胞において果たす。本発明の文脈において、機能性ヒスチジンキナーゼ、又はヒスチジンキナーゼを含むＣＨＡＳＥドメインは、好ましくは、サイトカイニンに結合可能であり、サイトカイニン制御型転写をもたらすシグナル変換を開始する。或いは又はさらに、機能性ヒスチジンキナーゼは、増加又は導入された発現の際に、植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力を改良することが可能なヒスチジンキナーゼとして定義することもできる。

この方法は、例えば、植物、植物プロトプラスト又は植物細胞を遺伝子操作して、ヒスチジンキナーゼタンパク質を過剰発現又はデノボ発現させるステップを含むことができる。一実施形態では、ヒスチジンキナーゼの発現は、植物細胞において一過的に増加するか、又は導入される。タンパク質の発現を一過的に増加又は導入する方法は当技術分野では周知であり、本発明はいかなる特定の方法にも限定されない。

非限定的な例として、この方法は、好ましくは本明細書で定義した第９の態様の発現構築物として、本明細書に記載したヒスチジンキナーゼをコードする組換え核酸を含むベクター又は発現構築物で植物細胞を形質転換することを含み得る。そのようなベクター又は発現構築物は、好ましくは、植物ゲノムに組み込まれない。その結果、発現構築物から転写されたヒスチジンキナーゼタンパク質は、一時的に発現される。ヒスチジンキナーゼをコードする核酸の導入は、例えば、国際公開第２００９／０８２１９０号に開示されているような当技術分野で公知の任意の適切な手段を使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、この方法は、植物プロトプラスト又は植物細胞を、ベクターを含むアグロバクテリウム株と接触させて、組換え核酸を植物プロトプラスト又は植物細胞に導入することを含む。

或いは又はさらに、植物細胞は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼタンパク質で形質転換させることができる。ヒスチジンキナーゼタンパク質の導入は、当業者に公知の任意の適切な手段によって実施することができる。

一実施形態では、植物細胞のゲノムは、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼタンパク質を一過的に発現又は過剰発現するように改変することができる。非限定的な例として、発現カセットは植物細胞のゲノムに導入することができ、その発現カセットは、誘導性プロモーター及びヒスチジンキナーゼをコードする配列を少なくとも含む。ヒスチジンキナーゼは、例えば、インデューサーの存在下で発現され得る。インデューサーはトランスアクチベーター、例えば導入トランスアクチベーターに結合することができ、このトランスアクチベーターは、例えば、ヒスチジンキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されている誘導性プロモーターに結合することによって、ヒスチジンキナーゼの発現を開始又は増大する。

一実施形態では、ヒスチジンキナーゼの発現は、植物細胞において連続的に増加又は導入される。

ヒスチジンキナーゼタンパク質の連続的な過剰発現又は連続的なデノボ発現は、例えば、ヒスチジンキナーゼタンパク質をコードする内因性遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーを植物、植物プロトプラスト又は植物細胞のゲノムに挿入することによって達成することができる。さらなる方法は、プロモーターをモジュレートすること、及び／又は内因性ヒスチジンキナーゼをコードする配列に作動可能に連結されている配列をさらに調節することであり、それにより増強又は導入された発現がもたらされる。これらの調節配列は、ゲノム調節因子及びエピゲノム調節因子を含むことができる。

一実施形態では、植物のゲノムは、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のうちの少なくとも１つと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を有するゲノムプロモーター断片を改変することにより、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼを過剰発現又はデノボ発現するように改変される。

一実施形態では、植物細胞のゲノムは、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼを過剰発現又はデノボ発現するように改変される。非限定的な例として、本明細書で定義した内因性ヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子を囲む調節配列は、ヒスチジンキナーゼの発現を増加又は誘導するように改変され得る。これらの調節配列は、ヒスチジンキナーゼをコードする開始コドンから約１０ｋｂ、８ｋｂ、５ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、８００ｂｐ、６００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ未満又は約５０ｂｐ未満上流に位置し得る。或いは、これらの調節配列は、ヒスチジンキナーゼをコードする開始コドンから約１０ｋｂ、８ｋｂ、５ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、８００ｂｐ、６００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ未満又は約５０ｂｐ未満下流に位置し得る。

一実施形態では、本明細書で定義した内因性ヒスチジンキナーゼの発現を増加又は誘導するように改変された調節配列は、配列番号７と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列の約１０ｋｂ、８ｋｂ、５ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、８００ｂｐ、６００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ未満又は約５０ｂｐ未満上流に位置し得る。

一実施形態では、本明細書で定義した内因性ヒスチジンキナーゼの発現を増加又は誘導するように改変された調節配列は、配列番号８と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列の約１０ｋｂ、８ｋｂ、５ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、８００ｂｐ、６００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ未満又は約５０ｂｐ未満上流に位置し得る。

一実施形態では、本明細書で定義した内因性ヒスチジンキナーゼの発現を増加又は誘導するように改変された調節配列は、配列番号９と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列の約１０ｋｂ、８ｋｂ、５ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、８００ｂｐ、６００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ未満又は約５０ｂｐ未満上流に位置し得る。

一実施形態では、植物ゲノムは、例えば、ＫｅｙＢａｓｅ（登録商標）、標的ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）、オリゴ定方向突然変異誘発（ＯＤＭ）又はオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（ＯＤＴＭ）を使用して特定位置で改変し、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で定義した内因性ヒスチジンキナーゼの発現を導入又は増加するように植物細胞のゲノムを編集する方法としては、限定するものではないが、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮなどの特定のヌクレアーゼの使用が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲシステムの特定のヌクレアーゼの非限定的な例としては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１及びＣａｓＸが挙げられる。

内因性ヒスチジンキナーゼの発現を導入又は増加させる代わりに、又はそれに加えて、外因性ヒスチジンキナーゼタンパク質を植物細胞において安定的に発現させることができる。例えば、ヒスチジンキナーゼをコードする核酸、例えば、外因性ヒスチジンキナーゼは、植物細胞のゲノムに安定的に挿入することができる。そのようなヒスチジンキナーゼの発現は、導入された配列に作動可能に連結された配列によって調節することができる。これらの調節配列は細胞に対し内因性であり得るか、又は、例えばヒスチジンキナーゼをコードする核酸の導入とともに導入され得る。これらの調節配列は、ゲノム調節因子及びエピゲノム調節因子を含むことができる。
本発明の方法は、本発明の方法のヒスチジンキナーゼの過剰発現又はデノボ発現を試験するステップをさらに含んでいてもよい。言い換えると、本発明はまた、
ａ）植物細胞において本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップと；
ｂ）植物細胞における前記ヒスチジンキナーゼの発現レベルを検出するステップと
を含む、植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力を改良する方法も提供する。

ヒスチジンキナーゼタンパク質の過剰発現又はデノボ発現を試験する方法としては、限定するものではないが、ＰＣＲ分析、ゲノムＤＮＡの配列決定、ｍＲＮＡ転写産物の配列決定、ｍＲＮＡ転写産物レベルの分析（ノーザンブロット分析）、コピー数の分析（サザンブロット分析）などが挙げられる。好ましくは、本発明の方法は、本明細書で定義した対照と比較して、少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のヒスチジンキナーゼの発現の増加をもたらす。

一実施形態では、植物細胞は、非能率的な（ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）再生能力を有することが知られている植物から得られるか、又は得ることができる。不十分な（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）再生能力は、本明細書では、好ましくは植物細胞が再生を可能にする定義した条件下、好ましくは最適条件下に保たれた場合に、再生能力が約２５％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満であると理解される。非能率的な再生能力を有する植物の例としては、限定するものではないが、アマトウガラシ、キュウリ、及びメロンが挙げられる。

本発明において使用するための植物細胞は、再生を可能にするはずの条件下で再生することが不可能な植物から得られるか、又は得ることができる。

一実施形態では、植物細胞は、オオムギ、キャベツ、キャノーラ、カッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、ナタネ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ライムギ、モロコシ、西洋カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、アマトウガラシ、トマト、スイカ、コムギ、ズッキーニ、ダイズ、キク、及びシロイヌナズナからなる群から選択される植物から得られるか、又は得ることができる。

一実施形態では、植物細胞は、アマトウガラシ、キュウリ、メロン、ダイズ、キク、及びシロイヌナズナからなる群から選択される植物から得られるか、又は得ることができる。

一実施形態では、植物細胞は、アマトウガラシ、キュウリ、及びメロンからなる群から選択される植物から得られるか、又は得ることができる。

一実施形態では、植物細胞は、トマト又はトウガラシから得られるか又は入手可能であり、好ましくは、植物細胞は、ソラヌム・リコペルシクム又はカプシクム・アンヌウム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）から得られるか、又は得ることができる。

第２の態様では、本発明は、ｉ）本明細書で定義したサイトカイニンを含む培地中で本発明の第１の態様の方法によって得られた、又は得ることができる植物細胞をインキュベートするステップと；ｉｉ）植物細胞が植物に再生することを可能にするステップとを含む、植物を再生する方法に関する。
したがって、本発明はまた、
ａ）植物細胞において本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップと；
ｂ）植物細胞における前記ヒスチジンキナーゼの発現レベルを任意選択で検出し、ヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有する植物細胞を任意選択で選択するステップと；
ｃ）本明細書で定義したサイトカイニンを含む培地中で、植物細胞、任意選択でステップｂ）で選択した植物細胞をインキュベートするステップと；
ｄ）植物細胞を植物に再生させることを可能にするステップと
を含む、植物を再生する方法に関する。

一実施形態では、植物細胞は、本発明の第１の態様で明示された植物細胞である。植物細胞は、オオムギ、キャベツ、キャノーラ、カッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、ナタネ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ライムギ、モロコシ、西洋カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、アマトウガラシ、トマト、スイカ、コムギ、ズッキーニ、ダイズ、キク、及びシロイヌナズナからなる群から選択される植物から得られるか、又は得ることができる。

本発明の方法は、植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力を改良することに関し、この方法は、ヒスチジンキナーゼタンパク質の発現を増加又は導入するステップを含む。サイトカイニン（ＣＫ）は、植物の根及びシュートにおける細胞分裂、又は細胞質分裂を促進する植物成長物質（植物ホルモン）の一種である。サイトカイニンは木部を上方へと移動し、横方向の成長を促進することができる。それらは主として細胞の増殖及び分化に関係するが、頂芽優勢、腋芽成長、及び葉老化にも影響を及ぼし得る。

本発明で使用するためのサイトカイニンは、アデニン型サイトカイニン又はフェニル尿素型サイトカイニンであり得る。同様に、サイトカイニンは、天然で産生された植物ホルモンであり得るか、又は合成された化合物であり得る。アデニン型サイトカイニンは、根、種子及び果実のうちの少なくとも１つにおいて合成される植物ホルモンであり得る。さらに、形成層及び他の活発に分裂している組織もまた、サイトカイニンを合成することができる。

天然に存在するアデニン型サイトカイニンの非限定的な例は、ゼアチン並びにその代謝前駆体２ｉＰである。合成アデニン型サイトカイニンの非限定的な例は、キネチン及び６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）である。置換尿素化合物、例えばチジアズロン及びＣＰＰＵなどは植物においては生じないが、組織培養においてはサイトカイニンとして作用し得る。

アデニン型サイトカイニンは、キネチン、ゼアチン、トランス－ゼアチン、シス－ゼアチン、ジヒドロゼアチン、６－ベンジルアミノプリン、及び２ｉＰ、並びにそれらの組合せからなる群から選択することができる。フェニル尿素型サイトカイニンは、ジフェニル尿素又はチジアズロンであり得る。

一実施形態では、本明細書で定義した植物細胞は、植物細胞の再生を可能にする条件下で、本明細書で定義したサイトカイニンを含む培地においてインキュベートされる。植物細胞は、サイトカイニンを含む培地において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は約１０日間、再生を可能にする条件下でインキュベートすることができる。植物細胞は、サイトカイニンを含む培地において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は約１２週間、再生を可能にする条件下でインキュベートすることができる。

一実施形態では、本明細書で定義した植物細胞は、サイトカイニンを含む培地において、少なくとも５、６、７、８、９週間インキュベートされる。

一実施形態では、再生された植物細胞は、子葉胚にさらに発達させることができる。用語の「子葉胚」及び「子葉期胚」とは、本明細書では同義的に使用することができる。子葉胚は、好ましくは、子葉期体細胞胚である。一実施形態では、子葉胚のすべての細胞は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼを発現又は過剰発現する。本発明の方法によって生成された変異誘発された子葉胚は、小植物にさらに成長させることができる。小植物は、植物にさらに成長させることができる。

本発明の一実施形態では、本方法は、したがって、植物細胞から小植物及び／又は植物を再生するさらなるステップを含む。

一実施形態では、本明細書で定義した植物細胞は、サイトカイニンを含む培地においてインキュベートされる。培地中のサイトカイニンは、１種類のみのサイトカイニンであり得る。或いは、植物細胞はまた、サイトカイニンの混合物中でインキュベートすることもできる。例えば、植物細胞は、少なくとも１、２、３、４又は５つの異なるタイプのサイトカイニンを含む培地においてインキュベートすることができる。

少なくとも２つのサイトキニンの混合物は、例えば、キネチン及びゼアチン、キネチン及びトランス－ゼアチン、キネチン及びシス－ゼアチン、キネチン及びジヒドロゼアチン、キネチン及び６－ベンジルアミノプリン、キネチン及び２ｉＰ、ゼアチン及びトランスゼアチン、ゼアチン及びシス－ゼアチン、ゼアチン及びジヒドロゼアチン、ゼアチン及び６－ベンジルアミノプリン、ゼアチン及び２ｉＰ、トランス－ゼアチン及びシス－ゼアチン、トランス－ゼアチン及びジヒドロゼアチン、トランス－ゼアチン及び６－ベンジルアミノプリン、トランス－ゼアチン及び２ｉＰ、シス－ゼアチン及びジヒドロゼアチン、シス－ゼアチン及び６－ベンジルアミノプリン、シス－ゼアチン及び２ｉＰ、ジヒドロゼアチン及び６－ベンジルアミノプリン、ジヒドロゼアチン及び２ｉＰ、並びに６－ベンジルアミノプリン及び２ｉＰからなる群から選択される。当業者は、１つ又は複数の追加のタイプの１つ又は複数のサイトカイニンを、少なくとも２つのサイトカイニンの混合物に加えることができることが分かる。添加されるサイトカイニンのタイプは植物細胞のタイプによって決まることが当技術分野において知られており、また当業者は適切な１つ又は複数の適切なサイトカイニンを直接選択することができる。

一実施形態では、培地は、植物細胞の再生を促進する追加の化合物を含有することができる。そのような追加の化合物は、例えば１つ又は複数の成長調節物質、例えば１つ又は複数の植物ホルモンであり得る。植物ホルモン（ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅ）（植物ホルモン（ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ）又は「植物成長物質」としても知られている）は、植物の成長を調節することができる化学物質である。植物ホルモンは、植物の形状、種子の成長、開花期、花の性別、葉の老化、及び果実の老化の少なくとも１つに影響を及ぼし得る。或いは又はさらに、植物ホルモンは、組織の上方成長、組織の下方成長、葉の形成、茎の成長、果実の発達、果実の成熟、植物の寿命、及び植物の死滅のうちの少なくとも１つに影響を及ぼし得る。

本発明の方法において使用するためのさらなる植物ホルモンは、オーキシン、アブシジン酸、エチレン及びジベレリンのうちの少なくとも１つであり得る。或いは又はさらに、さらなる植物ホルモンは、ブラシノステロイド、サリチル酸、ジャスモン酸、植物ペプチドホルモン、ポリアミン、一酸化窒素、ストリゴラクトン、カリキン及びトリアコンタノールのうちの少なくとも１つであり得る。

少なくとも１つのさらなる植物ホルモンは、オーキシンであり得る。オーキシンは、モルフォゲン様の特性を有することができる植物ホルモンのクラスである。オーキシンは、内因的に合成されたオーキシンであり得る。内因的に合成されたオーキシンは、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、４－クロロインドール－３－酢酸、フェニル酢酸、インドール－３－酪酸、及びインドール－３－プロピオン酸からなる群から選択することができる。

オーキシンは、合成オーキシン、例えばオーキシン類似体であり得る。合成オーキシンは、１－ナフタレン酢酸、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、α－ナフタレン酢酸（α－ＮＡＡ）、２－メトキシ－３，６－ジクロロ安息香酸（ジカンバ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（トルドン又はピクロラム）、１－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、及び２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）のうちの少なくとも１つであり得る。オーキシンは、１－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）であり得る。

さらに又は或いは、さらなる植物ホルモンは、少なくともジベレリンであり得る。ジベレリンは、１９炭素ジベレリン又は２０炭素ジベレリンであり得る。ジベレリンは、ジヒドロキシル化ジベレリンであり得る。ジベレリンは、ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４、及びＧＡ７のうちの少なくとも１つであり得る。

培地中の少なくとも１つのさらなる植物ホルモン（例えばオーキシン）の濃度は、サイトカイニン濃度と同じであるか、又は同様であり得る（例えば、約１：１の比率）。或いは、少なくとも１つのさらなる植物ホルモンの濃度は、培地中のサイトカイニン濃度よりも低い可能性がある。少なくとも１つのさらなる植物ホルモンとサイトカイニンとの比は、約０．９：１．０；０．８：１．０；０．７：１．０；０．６：１．０；０．５：１．０；０．：１．０；０．３：１．０；０．２：１．０；０．１：１．０；０．０１：１．０、又は約０．００１：１．０であり得る。

或いは、少なくとも１つのさらなる植物ホルモンの濃度は、培地中のサイトカイニンの濃度よりも高い可能性がある。少なくとも１つのさらなる植物ホルモンとサイトカイニンとの比は、１：０．９；１：０．８；１：０．７；１：０．６；１：０．５；１：０．４；１：０．３；１：０．２；１：０．１；１：０．０１又は約１：０．００１であり得る。

培地中のサイトカイニン濃度は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１７５ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２７５ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３２５ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３７５ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４２５ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、４７５ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、５２５ｎｇ／ｍｌ、５５０ｎｇ／ｍｌ、５７５ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、６２５ｎｇ／ｍｌ、６５０ｎｇ／ｍｌ、６７５ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、８５０ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、９５０ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、１１００ｎｇ／ｍｌ、１２００ｎｇ／ｍｌ、１３００ｎｇ／ｍｌ、１４００ｎｇ／ｍｌ、１５００ｎｇ／ｍｌ、１７５０ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、２２２５ｎｇ／ｍｌ、２５００ｎｇ／ｍｌ、２７５０ｎｇ／ｍｌ、３０００ｎｇ／ｍｌ、３２５０ｎｇ／ｍｌ、３５００ｎｇ／ｍｌ、３７５０ｎｇ／ｍｌ、４０００ｎｇ／ｍｌ、４２５０ｎｇ／ｍｌ、４５００ｎｇ／ｍｌ、４７５０ｎｇ／ｍｌ又は少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌであり得る。

或いは又はさらに、培地中のサイトカイニン濃度は、最大で約５０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１７５ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２７５ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３２５ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３７５ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４２５ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、４７５ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、５２５ｎｇ／ｍｌ、５５０ｎｇ／ｍｌ、５７５ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、６２５ｎｇ／ｍｌ、６５０ｎｇ／ｍｌ、６７５ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、８５０ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、９５０ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、１１００ｎｇ／ｍｌ、１２００ｎｇ／ｍｌ、１３００ｎｇ／ｍｌ、１４００ｎｇ／ｍｌ、１５００ｎｇ／ｍｌ、１７５０ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、２２２５ｎｇ／ｍｌ、２５００ｎｇ／ｍｌ、２７５０ｎｇ／ｍｌ、３０００ｎｇ／ｍｌ、３２５０ｎｇ／ｍｌ、３５００ｎｇ／ｍｌ、３７５０ｎｇ／ｍｌ、４０００ｎｇ／ｍｌ、４２５０ｎｇ／ｍｌ、４５００ｎｇ／ｍｌ、４７５０ｎｇ／ｍｌ、又は約５０００ｎｇ／ｍｌであり得る。

一実施形態では、培地中のサイトカイニン濃度は、約５０～５０００ｎｇ／ｍｌ、７５～４０００ｎｇ／ｍｌ、１００～３０００ｎｇ／ｍｌ、１２５～２０００ｎｇ／ｍｌ、１３０～１５００ｎｇ／ｍｌ、１４０～１２５０ｎｇ／ｍｌ、１５０～１０００ｎｇ／ｍｌ、１７５～８００ｎｇ／ｍｌ、２００～６００ｎｇ／ｍｌ、又は約２５０～５００ｎｇ／ｍｌの範囲である。

培地中のサイトカイニン濃度は、好ましくは、植物細胞の再生を可能にするのに最適な濃度である。当業者は、例えば日常的な実験を通じてそのような最適濃度を確立する方法を知っており、又はこれらの濃度は当技術分野においてこれまでに開示されている。好ましい最適濃度は、約１０００ｎｇ／ｍｌである。

本明細書で定義した植物細胞をインキュベートするための培地は、液体培地又は固体培地であり得る。培地は、好ましくは滅菌されている。

異なる態様における本明細書で定義した本発明の方法及び使用では、植物細胞は、多細胞組織の一部分であり得る。植物多細胞組織は、分化細胞を含むことができる。或いは又はさらに、多細胞組織は、未分化細胞を含むことができる。一実施形態では、多細胞組織のすべての細胞は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有する。或いは、多細胞組織の細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は約９９％は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加した発現又はデノボ発現を有する。

多細胞組織は、カルス組織、植物器官又は外植片であり得る。

本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの誘導又は導入した発現を有する植物細胞は、カルスの一部分であり得る。カルスは、好ましくは成体細胞に由来した未分化細胞の群である。カルス細胞は、胚形成及び完全に新しい植物の形成を経ることができる。植物カルスは、組織化されていない植物の柔組織細胞の成長している塊と考えられる。カルスは単一の分化細胞から生成することができ、カルス細胞は全能性であり、植物体全体を再生することが可能である。植物カルスは、１つ又は複数の体細胞組織、例えば、外植片培養に利用可能な組織に由来し得る。カルス及び体細胞胚を生じさせる細胞は、好ましくは、迅速な分裂を経て、及び／又は分裂組織のように部分的に未分化である。本発明の方法で使用されるカルス細胞は、もろくなり得るか、又はコンパクトになり得る。さらに又は或いは、カルス細胞は、根状、シュート状、又は胚形成性のカルスであり得る（Ｉｋｅｕｃｈｉ Ｍ、 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． ２０１３ Ｓｅｐ；２５（９）：３１５９～３１７３）。

一実施形態では、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有する植物細胞は、植物器官の一部分であり得る。植物器官は、栄養器官又は生殖器官であり得る。栄養器官は、シュート系又は根系に由来し得る。器官は、根、茎、及び葉のうちの少なくとも１つであり得る。再生植物器官は、花、種子、果実、球果、胞子嚢、毬果及び茎葉体からなる群から選択することができる。

一実施形態では、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有する植物細胞は、外植片の一部分であり得る。外植片は、本明細書では、植物の一部分から得られた試料として定義することができる。植物試料は、固体培養培地又は液体培地に置くことができる。外植片は、シュート、葉、茎、花、根、単一の未分化細胞の一部分を含む植物の多くの異なる部分から、及び成熟細胞から採取することができる。細胞は、好ましくは、生存する細胞質及び核を含有しており、脱分化して細胞分裂を再開することができる。外植片は、植物の分裂組織末端、例えば、茎先端、腋芽先端若しくは根先端であり得るか、又はそこから得ることが可能であるか、若しくは得ることができる。一実施形態では、外植片は、胚軸外植片、茎外植片、子葉外植片、根外植片、葉外植片、花外植片、及び分裂組織からなる群から選択される。一実施形態では、外植片は胚軸外植片である。

本発明の方法によって再生された植物は、続いて交配され、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を除去することができる。したがって、この方法は、再生された植物を交配して、以前に増加又は導入されたヒスチジンキナーゼの発現を除去するステップを含むことができる。植物は、異なる種の植物又は同じ種の植物と交配させることができ、ヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現をもはや有していない後代を選択することができる。

第３の態様では、本発明は、本明細書で定義した本発明の方法によって得ることが可能な、又は得られる植物又は植物部分に関する。植物又は植物部分は、器官形成又は体細胞胚形成のプロセスによって得ることが可能であるか、又は得られる。植物又は植物部分から得られる植物細胞は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有する。本発明の方法によって得ることが可能であるか、又は得られる植物は、好ましくは、オオムギ、キャベツ、キャノーラ、カッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、ナタネ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ライムギ、モロコシ、西洋カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、アマトウガラシ、トマト、スイカ、コムギ、ズッキーニ、ダイズ、キク、及びシロイヌナズナからなる群から選択される。植物、植物部分又は植物細胞は、すべての細胞において、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は誘導された発現を有し得る。或いは、植物細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は約９９％は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有する。一実施形態では、植物部分は、種子、果実、又は非増殖材料である。

一実施形態では、本発明の植物又は植物細胞は遺伝子改変を含み、その改変は、対照植物と比較して、ヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現をもたらす。好ましい遺伝子改変は、本明細書の上記に示されている。本発明の植物又は植物細胞は、好ましくは、本明細書で定義した第８の態様の核酸及び／又は本明細書で定義した第９の態様の発現構築物を含む。

第４の態様では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能であるか、又は得られる植物又は植物部分に由来する産物、例えば、果実、葉、植物器官、植物脂肪、植物油、植物デンプン、及び他の材料と混合され、乾燥、凍結された、破砕、粉砕されているかそのままの植物タンパク質画分などに関する。これらの産物は、非増殖性であり得る。好ましくは、前記植物産物は遺伝子改変を含み、その改変は、対照植物と比較して、ヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現をもたらす。好ましい遺伝子改変は、本明細書の上記に示されている。前記植物産物は、本明細書で定義した第８の態様の核酸及び／又は本明細書で定義した第９の態様の発現構築物を含み得る。好ましくは、これらの産物は、前記遺伝子改変、核酸及び／又は構築物の少なくとも一部を含み、これは、植物産物が、本明細書で定義した本発明の第１及び／又は第２の態様の方法によって得られる植物に由来することを評価することを可能にする。

第５の態様では、本発明は、本発明の方法によって得ることが可能であるか、又は得られる植物細胞、小植物又は植物の後代に関する。したがって、後代の植物細胞は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの増加又は誘導された発現を有し、改良されたサイトカイニン誘導性再生能力を有する。前記後代は、本明細書で定義した本発明の第３の態様の植物又は植物の部分の遺伝子改変、核酸及び／又は発現構築物を含み得る。

第６の態様では、本発明は、植物のサイトカイニン誘導性再生能力を改良するための、本明細書で定義したＣＨＫ２、ＣＨＫ３及び／又はＣＨＫ４ヒスチジンキナーゼの使用に関する。一実施形態では、本発明は、植物のサイトカイニン誘導性再生能力を改良するための、本明細書で定義したＣＨＫ２及び／又はＣＨＫ４ヒスチジンキナーゼの使用に関する。さらなる実施形態では、本発明は、植物のサイトカイニン誘導性再生能力を改良するための、本明細書で定義した少なくともＣＨＫ４ヒスチジンキナーゼの使用に関する。植物は、好ましくは、本明細書の上記で定義したような植物である。

第７の態様では、本発明は、植物のサイトカイニン誘導性再生能力を改良する方法における、本明細書の上記で定義したＣＨＫ２、ＣＨＫ３及び／又はＣＨＫ４ヒスチジンキナーゼの使用に関する。好ましくは、ＣＨＫ２、ＣＨＫ３及び／又はＣＨＫ４ヒスチジンキナーゼは、植物のサイトカイニン誘導性再生能力を改良するために、本発明の第１及び／又は第２の態様で定義した方法で使用される。

第８の態様では、本発明は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼをコードする核酸に関する。好ましい実施形態では、核酸は、本明細書で定義したＣＨＫ２、ＣＨＫ３及びＣＨＫ４のうちの少なくとも１つをコードする。好ましくは、核酸は、本明細書で定義したＣＨＫ２及びＣＨＫ４のうちの少なくとも１つをコードする。好ましくは、核酸は、本明細書で定義したＣＨＫ４をコードする。

一実施形態では、核酸の配列は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は約１００％の配列同一性を有し得る。

或いは、核酸の配列は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のうちの少なくとも１つと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は約１００％の配列同一性を有し得る。

核酸は、その自然環境から単離することができる。さらに又は或いは、少なくとも１、２、３又は４つのヌクレオチドは、本明細書で定義した核酸に隣接することができ、前記ヌクレオチドは、自然環境においてその核酸には隣接せず、すなわち、天然に存在しない核酸をもたらす。

第９の態様では、本発明は、本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの発現のための発現構築物に関する。一実施形態では、発現構築物は、第８の態様において本明細書の上記で定義した核酸の配列を含む。発現構築物は、本明細書の第８の態様において上記で定義した少なくとも１、２、３、４又は５つの核酸の配列を含み得る。

発現構築物は、同じ核酸の少なくとも２つ以上のコピーの配列を含むことができ、及び／又は本明細書で定義した少なくとも２つの異なる核酸の配列を含むことができる。

非限定的な例として、発現構築物は、配列番号１と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は約１００％の配列同一性を有する核酸の配列、並びに配列番号３と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は約１００％の配列同一性を有する核酸の配列を含み得る。

別の非限定的な例として、発現構築物は、配列番号７と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は約１００％の配列同一性を有する核酸の配列、並びに配列番号９と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は約１００％の配列同一性を有する核酸の配列を含み得る。

発現構築物は、本明細書で定義した１つの核酸配列又は複数の核酸配列に作動可能に連結されている１つ又は複数の調節エレメントをさらに含むことができる。好ましい調節エレメントはプロモーターである。植物細胞における発現のためのプロモーターは、本明細書では、植物又は植物細胞において活性であるプロモーターとして理解され、すなわち、プロモーターは、植物又は植物細胞内の転写を駆動する一般的な能力を有する。

プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターであり得る。「構成的」プロモーターは、ほとんどの組織において、ほとんどの生理学的条件及び発達的条件下で活性であるプロモーターであると本明細書では理解される。「誘導性」プロモーターは、生理学的に（例えば、ある特定の化合物の外部適用によって）又は発達的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織又は細胞においてのみ活性がある。

プロモーターは、カリモウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター又はオクトピンシンターゼプロモーターなどであり得る。

プロモーターは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の少なくとも１つと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は約１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、プロモーターは、配列番号１２と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は約１００％の配列同一性を有し得る。

本発明は、図面に示したようないくつかの例示的な実施形態に関連させて上記で説明してきた。いくつかの部分又は構成要素の変更及び代替の実施は可能であり、添付の特許請求の範囲において定義されたような保護の範囲に含まれる。

実施例１：シロイヌナズナＣＨＫ２遺伝子のクローニング
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＣＨＫ２遺伝子（ＡＴ５Ｇ３５７５０）のコード配列は、テンプレートとしてのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ－０ゲノムＤＮＡからのＣＨＫ２特異的フォワードプライマー１４＿０４１０９及びリバースプライマー１４＿０４１１０を使用し、ＰＣＲにより増幅させた。第２のＰＣＲ増幅は、プライマー１４＿０４１１６（フォワード）及び１４＿０４１１７（リバース）で実施して、断片の末端にＧａｔｅｗａｙクローニングａｔｔＢ部位を組み込んだ。増幅産物をゲルから精製し、標準のＧａｔｅｗａｙ ＢＰ反応クローニング（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって、ｐＤＯＮＲ２２１ドナーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））にクローニングした。

ＡｔＣＨＫ２遺伝子（ＡＴ５Ｇ３５７５０）の上流にある２．０ｋｂのプロモーター配列は、遺伝子合成（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により合成した。合成された断片は、フォワードプライマー１５＿０００８３及びリバースプライマー１５＿０００８４を使用してＰＣＲ増幅し、ｐＥＮＴＲ（商標）５’－ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して、エントリーベクターｐＥＮＴＲ（商標）５’－ＴＯＰＯにクローニングした。

実施例２：シロイヌナズナＣＨＫ４遺伝子のクローニング
シロイヌナズナＣＨＫ４遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１８３０）のコード配列は、テンプレートとしてのシロイヌナズナＣｏｌ－０ゲノムＤＮＡからのＣＨＫ４特異的フォワードプライマー１４＿０４１０６及びリバースプライマー１４＿０４１０７を使用し、ＰＣＲにより増幅させた。第２の増幅は、プライマー１４＿０４１１４（フォワード）及び１４＿０４１１５（リバース）で実施して、断片の末端にＧａｔｅｗａｙクローニングａｔｔＢ部位を組み込んだ。増幅産物をゲルから精製し、標準のＧａｔｅｗａｙ ＢＰ反応クローニング（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって、ｐＤＯＮＲ２２１ドナーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））にクローニングした。

ＡｔＣＨＫ４遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１８３０）の上流にある２．０ｋｂのプロモーター配列は、遺伝子合成（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により合成した。合成された断片は、フォワードプライマー１５＿０００８７及びリバースプライマー１５＿０００８８を使用してＰＣＲ増幅し、ｐＥＮＴＲ（商標）５’－ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して、エントリーベクターｐＥＮＴＲ（商標）５’－ＴＯＰＯにクローニングした。

実施例３：発現構築物ｐＫＧ９７８５及びｐＫＧ９７９１の構築
そのネイティブ２ｋｂプロモーターの調節下にあるシロイヌナズナＣＨＫ２遺伝子の発現構築物は、実施例１で説明したエントリーベクターからのＣＨＫ２プロモーター断片及びＣＨＫ２コード配列断片を、シングルステップＬＲクローニング反応（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により、マルチサイトＧａｔｅｗａｙデスティネーションベクターｐＫ７ｍ２４ｇｗ，３に組み合わせることによって得られた。

そのネイティブ２ｋｂプロモーターの調節下にあるシロイヌナズナＣＨＫ４遺伝子の発現構築物は、実施例２で説明したエントリーベクターからのＣＨＫ４プロモーター断片及びＣＨＫ４コード配列断片を、シングルステップＬＲクローニング反応（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により、マルチサイトＧａｔｅｗａｙデスティネーションベクターｐＫ７ｍ２４ｇｗ，３に組み合わせることによって得られた。

そのネイティブプロモーターの調節下にあるＣＨＫコード配列を含む、得られたプラスミド構築物は、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１株に形質転換する前に、ＮｃｏＩ及びＳａｃＩの組合せ、又はＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの組合せを用いた制限酵素消化を使用してチェックした。最終構築物は、ＣＨＫ２発現カセットについてはｐＫＧ９７８５、ＣＨＫ４発現カセットについてはｐＫ９７９１とそれぞれ命名された。個々のアグロバクテリウムコロニーを選択し、植物の形質転換に使用してトランスジェニック株を得た。

実施例４：シロイヌナズナの形質転換
ＣＨＫ構築物のいずれか（ｐＫＧ９７８５又はｐＫＧ９７９１）が安定的に組み込まれたトランスジェニック植物は、Ｃｌｏｕｇｈ及びＢｅｎｔ（Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６ （６）：７３５～７４３、１９９８）のプロトコルに従い、フローラルディップ法を使用して、シロイヌナズナＣｏｌ－０植物を形質転換することにより得た。陽性形質転換体は、気相（Ｃｌｏｕｇｈ及びＢｅｎｔ、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６（６）：７３５～７４３）を使用してＴ１後代種子を滅菌し、５０ｍｇ．Ｌ^－１のカナマイシンを補充した０．５ＭＳ１０培養培地（これは１００ｇ．Ｌ^－１のスクロースを含有する、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３～４９７に従ったＭＳ培地濃度の半分である）上でｉｎ ｖｉｔｒｏで種子を発芽させ、カナマイシン耐性苗を選択することによって得た。続いて、各構築物の複数の独立したカナマイシン耐性苗を土壌に移し、自家受粉させてＴ２種子を得た。種子は気相を使用して滅菌し、５０ｍｇ．Ｌ^－１のカナマイシンを補充した０．５ＭＳ１０プレートに播種した。２週間後、実生がカナマイシン耐性又は感受性について単離されなかったＴ３株はホモ接合体であると考えられ、再生アッセイにおいて使用した。選択されたトランスジェニック株における導入遺伝子の発現レベルは、全インビトロ実生から抽出されたＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲによりチェックされ、非形質転換のＣｏｌ－０対照植物における内因性ＣＨＫ遺伝子の発現レベルと比較した。ｑＲＴ－ＰＣＲで使用したプライマーは、ＡｔＣＨＫ４については１７＿０３８９４（フォワードプライマー）及び１７＿０３８９５（リバースプライマー）であり、ＡｔＣＨＫ２については１７＿０３８９０（フォワードプライマー）及び１７＿０３８９１（リバースプライマー）であった。それぞれの構築物について、ホモ接合体植物株は、それらの再生能力について試験される中程度発現から強発現レベルで選択した。

実施例５：ＣＨＫ遺伝子を発現するシロイヌナズナ株の再生アッセイ
使用される再生アッセイは、Ｔｏら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：６５８～６７１、２００４、これは参照により本明細書に組み込まれる）によって開示されているシュート開始アッセイに基づいている。試験された株のシロイヌナズナの実生を、３～４日間暗所にて、次いで３日間薄明りにおいて、垂直に置かれた正方形プレート中の０．５ＭＳ１０培養培地で成長させ、伸長した堅い胚軸を得た。長さが約７ｍｍの胚軸を実生から切除した。胚軸外植片を、キネチン（３００ｎｇ．ｍＬ^－１）及びＮＡＡ（１００ｎｇ．ｍＬ^－１）を含有する１％（ｗ／ｖ）スクロース及び０．４％（ｗ／ｖ）フィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）を補充したＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３～４９７）に移し、７週間２５℃で、１６時間明期／８時間暗期で維持した。それぞれのトランスジェニック株について、１０個の個々の外植片を、５個のシロイヌナズナＣｏｌ－０の非形質転換（陰性）対照外植片と、再生の陽性対照として有用である５個のシロイヌナズナａｒｒ３，４，５，６，８，９六重変異体の外植片も含まれている単一の正方形プレートで試験した。この変異体は、これらの条件下で、高効率で再生することが知られている（Ｔｏら、２００４、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：６５８～６７１）。それぞれの実験において、４つの独立したプレートをアッセイし、実験を二つ組で実施した。シュート再生率は、７週間の成長後に形成された花序シュートの数に基づいて決定された。

再生実験は、７週間にわたりモニターし、画像化し、スコアリングした。すべてのトランスジェニック株は、対照のＣｏｌ－０株と比較して、増強された再生を示した（表２）。再生効率は、培養された外植片の総数の中から、花序シュートの形成を示す外植片のパーセンテージとして表した。表２からは、ネイティブプロモーターの制御下でＣＨＫ２遺伝子又はＣＨＫ４遺伝子を発現する植物材料の再生効率が、陽性対照（六重ａｒｒ変異体）の再生効率より優れていることが明らかである。全体として、ＣＨＫ２遺伝子又はＣＨＫ４遺伝子のいずれかの増強された発現が、再生能力を改良することは明らかである。

ＣＨＫ２、ＣＨＫ３、及びＣＨＫ４の間のアミノ酸同一性のパーセンテージを表３に示す。

実施例６：トマトＣＨＫ２オルソログの同定
オルソロジー検索は、複数のタンパク質配列アラインメントソフトウェアＪａｃｋＨＭＭＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｏｒｇ，バージョン３．２．１；２０１８年６月；Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１１：４３１、２０１０、 ｄｏｉ： １０．１１８６／１４７１－２１０５－１１－４３１）を使用して、１５の植物プロテオームデータベースでＡｔＣＨＫ２遺伝子及びＡｔＣＨＫ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ３５７５０及びＡＴ２Ｇ０１８３）のクエリーにより実施した。ＪａｃｋＨＭＭＥＲブラスト検索は、ＭＥＭＥ Ｓｕｉｔｅモチーフベース配列分析（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ－ｓｕｉｔｅ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ； Ｍｅｍｅ Ｓｕｉｔｅ ４．１２．０．、２０１７年６月； Ｂａｉｌｅｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３７： Ｗ２３０２－Ｗ２０８、２００９、 ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ３３５）により補い、既知のタンパク質ドメインを同定及び視覚化した。オルソロジー検索により、クエリーとしてのＡｔＣＨＫ２遺伝子及びＡｔＣＨＫ４遺伝子の両方に対するトマトゲノム内の単一候補遺伝子が明らかになり、アミノ酸同一性は＞５０％であった。これらのトマト遺伝子は、ＡｔＣＨＫ２及びＡｔＣＨＫ４の最も可能性のある相同体として、それぞれ、Ｓｏｌｙｃ０７ｇ０４７７７０（ＳｌｙＣＨＫ２）及びＳｏｌｙｃ０７ｇ００８１ １０（ＳｌｙＣＨＫ４）である。Ｓｏｌｙｃ０７ｇ０４７７７０（ＳｌｙＣＨＫ２）をさらなる研究のために選択した。

実施例７：トマトＣＨＫ発現カセットの構築
２ｋｂのそのネイティブプロモーター配列を含むＳｌｙＣＨＫ２の機能的発現カセットをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計した。ノパリンシンターゼターミネーター及びＧａｔｅｗａｙアダプターを配列に追加して、Ｇａｔｅｗａｙデスティネーションベクターに直接クローニングするためのクローニング断片を作製した。カセットの合成は、ＧｅｎｅＡＲＴ（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）に発注した。カセットの完全配列を配列番号３２に示す。断片は、シングルステップＬＲクローニング反応（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）によって、ＧａｔｅｗａｙバイナリーデスティネーションベクターｐＫｍ４３ＧＷ（Ｋａｒｉｍｉら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４５：１１４４～１１５４、２００７， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０４／ｐｐ．１０７．１０６９８９）に導入された。ｐＫｍ４３ＧＷは、細菌選択用のストレプトマイシン耐性マーカー及びスペクチノマイシン耐性マーカーと、カナマイシンで植物組織を選択するためのｎｐｔｌｌ遺伝子を含むＧａｔｅｗａｙマルチサイトバイナリーデスティネーションベクターである。得られたプラスミド構築物をｐＫＧ１０８６７と命名し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にクローニングし、ＥｃｏＲＶとＮｈｅＩの組合せを使用する制限酵素消化によってチェックした。ＭｉｎｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡは、アグロバクテリウム・チュメファシエンスＧＶ３１０１株にエレクトロポレーションした。

実施例８：トマト形質転換
そのネイティブプロモーター下のＳｌｙＣＨＫ２を、アグロバクテリウム媒介性形質転換によって、トマト栽培品種Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ－Ｐｌｕｓ（ＴＭＶ耐性）に導入した。約５０個のトマト種子を滅菌し、１／２ＭＳ１０培地で１１日間、発芽させた。実生からの子葉外植片を切除し、４０μｇ．ｌ^－１のアセトシリンゴンを補充した２Ｎ１Ｂ培地（＝２ｍｇ．ｌ^－１のＮＡＡ及び１ｍｇ．ｌ^－１のＢＡＰを含有するＭＳ２０培地）で２４時間前培養した。外植片を、２０ｍｇ．ｌ^－１のストレプトマイシン及び５０ｍｇ．ｌ^－１のスペクチノマイシンを含有するＴＹ培地で一晩増殖させたｐＫＧ１０８６７を担持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１の懸濁液に沈め、ＯＤ６００ ０．１３８に希釈した。外植片を拭き取って乾燥させ、４０μｇ．ｌ^－１のアセトシリンゴンを含む２Ｎ１Ｂプレート上で２日間共培養した。続いて、外植片を、１ｍｇ．ｌ^－１のゼアチン、２００ｍｇ．ｌ^－１のバンコマイシン、２００ｍｇ．ｌ^－１のセフォタキシム及び１００ｍｇ．ｌ^－１のカナマイシンを含むＭＳ２０培地からなる選択培地ＭＳ２０ＺＶＣＫに移し、グロースチャンバー内で２５℃及び３０００ルクス（光周期１６／８時間）にて培養した。外植片は、３週間ごとに新鮮な培地に継代培養した。カルスが選択培地上に形成された場合、カルスを継代培養し、元の外植片は廃棄した。

実施例９：形質転換率の記録
３週間ごとに新鮮な培地ＭＳ２０ＺＣＶＫに継代培養されたトマトのカルスは、実験の１１４日目からシュート分裂組織及びシュートの生成が開始された。長さが５ｍｍを超えるシュートをカルスから採取し、ＭＳ２０からなる発根培地にいずれの添加剤も加えずに移した。このように回収されたシュートの累積数を記録し（表４）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスと接触されておらず、カナマイシン非含有培地で成長させて同様に栽培したトマトＭｏｎｅｙｂｅｒｇ子葉外植片と比較した。ｐＫＧ１０８６７形質転換後にカナマイシン耐性カルスから回収されたシュートは、対照のトマト外植片から再生するシュートよりも、より速く多数出現することが明らかである。この効果は、ＳｌｙＣＨＫ２遺伝子の異所性発現に起因する。

Claims (23)

1. 植物細胞のサイトカイニン誘導性デノボシュート形成を改良する方法であって、
   （ａ）植物細胞におけるヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップ、
   （ｂ）（ａ）の植物細胞をサイトカイニン含有培地に曝露するステップ、
   （ｃ）いくつかのシュートのデノボ形成を可能にするステップ、
   （ｄ）デノボ形成されたシュートを切除するステップ、並びに
   （ｅ）根形成を誘導するステップを含み、
   ヒスチジンキナーゼがＣＨＫ４及びＣＨＫ２のうちの少なくとも１つであり、前記少なくとも１つのヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有していない同一の植物細胞と比較して、デノボ形成されたシュートの数が増加している、方法。
2. ヒスチジンキナーゼがＣＨＫ４である、請求項１に記載の方法。
3. ヒスチジンキナーゼＣＨＫ４が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされている、並びに/又はヒスチジンキナーゼＣＨＫ２が、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされている、請求項１又は２に記載の方法。
4. ヒスチジンキナーゼＣＨＫ４のアミノ酸配列が、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、並びに／又はヒスチジンキナーゼＣＨＫ２のアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. ヒスチジンキナーゼの発現が植物細胞において一過的に増加又は導入される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. ヒスチジンキナーゼの発現が植物細胞において連続的に増加又は導入される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
7. 植物細胞がオオムギ、キャベツ、キャノーラ、カッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、ナタネ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ライムギ、モロコシ、西洋カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、アマトウガラシ、トマト、スイカ、コムギ、ズッキーニ、ダイズ、キク、及びシロイヌナズナからなる群から選択される植物から得ることができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. サイトカイニンがアデニン型サイトカイニンである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. アデニン型サイトカイニンがキネチン、ゼアチン、トランス－ゼアチン、シス－ゼアチン、ジヒドロゼアチン、６－ベンジルアミノプリン及び２ｉＰからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 請求項１～９のいずれか一項で定義した植物細胞をインキュベートするステップと、
    植物細胞を植物に再生させるステップと
    を含む、植物を再生する方法。
11. 培地が少なくとも１つのさらなる植物ホルモンを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. １つのさらなる植物ホルモンがオーキシンである、請求項１１に記載の方法。
13. 植物細胞が多細胞組織の一部である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 多細胞組織がカルス組織、植物器官又は外植片である、請求項１３に記載の方法。
15. 外植片が胚軸外植片、茎部外植片、子葉外植片、根外植片、葉外植片、花外植片及び分裂組織のうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載の方法。
16. 培地中のサイトカイニン濃度が１００～３０００ｎｇ／ｍｌである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. サイトカイニン濃度が２００～６００ｎｇ／ｍｌである、請求項１６に記載の方法。
18. 配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のヌクレオチド配列と、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のヌクレオチド配列とを含む、発現構築物。
19. ＣＨＫ４ヒスチジンキナーゼをコードする第１のヌクレオチド配列と、ＣＨＫ２ヒスチジンキナーゼをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む、発現構築物。
20. 第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１８又は１９に記載の発現構築物。
21. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる植物又は植物部分。
22. 植物部分が種子、果実、又は非増殖材料である、請求項２１に記載の植物部分。
23. 植物のサイトカイニン誘導性デノボシュート形成を改良するための、ＣＨＫ４及び／又はＣＨＫ２ヒスチジンキナーゼ或いは請求項１８～２０のいずれか一項に記載の発現構築物の使用。