JP2015500651A - 作物収量の向上方法 - Google Patents
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Abstract
植物成長および収量を増加させるための組成物および方法を提供する。組成物は高収量遺伝子TEL、プロモーター、および目的の植物におけるTEL遺伝子の発現を増加させるエンハンサーを含む。植物における少なくとも1つのTEL遺伝子の発現を増大させることにより、植物成長および収量は向上が達成され、こうした植物を栽培する畑における作物収量は増加する。目的の植物は、TEL遺伝子のコード配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動することができるプロモーターを含む、DNA構築物で形質転換することができる。DNA構築物は、TELコード配列の発現を増加させるように作用する少なくとも1つのエンハンサーを含むことができる。プロモーターまたはエンハンサーは、目的の植物のゲノム中、植物における内因性TELコード配列の発現を増加させる部位に挿入することができる。
Description
本発明は分子生物学の分野に関する。植物成長および収量の増大方法を提供する。
世界人口の増加により作物収量の向上は農業の重要な目標となった。作物および園芸改良の従来の手段は、望ましい特性を有する株を識別する選抜育種技術を用いる。しかしながら、こうした選抜育種技術はいくつかの欠点を有する。すなわち、これらの技術は一般的には労働集約的であり、植物は親株から受け継がれている望ましい形質を常にもたらすとは限らない異種の遺伝成分をしばしば含むことがある。収量は何十年間も多遺伝子性形質であると考えられている。伝統的な植物育種のいくらかの進歩により収量は向上した。こうした方法は、近縁または遠縁の個体を交配させ、所望の特性を有する新規作物品種または株を作製することを含む。植物バイオテクノロジーは、病気および害虫に強い植物を開発することにより、作物収量を向上させるのに役立っている。加えて、トランスジェニック除草剤耐性植物が作物の収量を増加させるのに役立っている。
多くの植物の栽培化は収量の劇的な増加と相関してきた。自然集団において起こるほとんどの表現型変異は連続的であり、同義遺伝子の影響により引き起こされる。栽培化植物における収量に劇的な差をもたらす特定の遺伝子の同定は、農業研究の重要な焦点となった。多くの植物の種子は人間および動物の栄養にとって重要であるので、種子収量はとくに重要な形質である。トウモロコシ、コメ、コムギ、キャノーラおよびダイズのような作物は、種子自体の直接消費によって、または加工された種子で育てられた肉製品の消費によって人間のカロリー摂取量合計の半分を超える量を占める。それらは糖、油および産業プロセスに用いられる多くの種類の代謝産物の供給源でもある。種子は胚(新梢および根の供給源)および胚乳(発芽中および幼苗の初期成長中の胚成長のための栄養の供給源)を含む。種子の発育には多くの遺伝子が関わり、根、葉および幹からの代謝産物の成長中の種子への輸送を要する。胚乳は、とくに、炭水化物、油およびタンパク質の代謝前駆体を吸収し、それらを貯蔵高分子に合成し、穀実を太らせる。植物収量を増加させる能力は、観賞植物の生産を含む農業、樹芸、園芸および林業のような分野において多くの用途を有するだろう。収量の増加は、(医薬品、抗体もしくはワクチンのような物質のバイオテクノロジーを用いた製造のための、または有機廃棄物の生物変換のための)バイオリアクターに用いられる藻類の生産、および他のこうした分野において用いることもできる。
Mei2はシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)の減数分裂を促進するのに重要な遺伝子である。植物におけるMei2様遺伝子の存在は最初にアラビドプシスMei2様1(AML1)の同定および特性解明により明らかとなった。AML1は葉、根、花、および長角果を含む多数の組織において発現する。Mei2様遺伝子はトウモロコシから単離され、TERMINAL EAR1(TE1)遺伝子と称された。特性解明の際、トウモロコシ遺伝子は葉間期および分裂組織での葉の分化において葉の分化部位の数および位置を下方調節することにより示された。研究は、Mei2様遺伝子が多種多様な群からなる植物において広く存在していることを明らかにした。Mei2は3つのRNA認識モチーフ(RRM)を含有するタンパク質であり、RNAに結合することができる。Mei2のホモログも植物において同定された。
作物の収量の増加は農業にとって非常に重要である。収量が向上した品種の開発は、各種作物の品種開発のもっとも重要な目標の1つである。伝統的な育種の進歩により作物収量は向上したが、各種作物の収量をさらに向上させる新規の作物収量の向上方法は依然として大いに望まれている。従って、収量の増加方法が必要とされている。
植物成長および収量を増加させるための組成物および方法を提供する。組成物は高収量遺伝子(Terminal ear1様(TEL)遺伝子)、プロモーター、および目的の植物におけるTEL遺伝子の発現を増加させるエンハンサーを含む。本発明は、植物における少なくとも1つのTEL遺伝子の発現を増大させることにより、植物成長および収量は向上し、こうした植物を栽培する畑における作物収量は増加することを認識する。植物におけるTEL遺伝子の発現を増加させるためのいずれの方法も本発明に含まれる。目的の植物は、TEL遺伝子のコード配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動することができるプロモーターを含む、DNA構築物で形質転換することができる。任意で、DNA構築物は、TELコード配列の発現を増加させるように作用する少なくとも1つのエンハンサーを含むことができる。別の実施形態では、プロモーターまたはエンハンサーは、目的の植物のゲノム中、植物における内因性TELコード配列の発現を増加させる部位に挿入することができる。
本発明の組成物は、TELポリペプチドの配列、プロモーターの配列、および/またはエンハンサーの配列をエンコードする核酸分子、それらの核酸分子を含むベクター、ならびにベクターを含む宿主細胞を含む。組成物はTELポリペプチド配列およびそれらのポリペプチドに対する抗体も含む。ヌクレオチド配列は、目的の植物における形質転換および発現のため、DNA構築物または発現カセットに用いることができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、特定の植物における発現のために設計された合成配列であってもよい。組成物は形質転換植物、植物細胞、組織、および種子も含む。
よって、本発明は一般的には分子生物学の分野に関し、対照植物と比較して植物収量を増加させるための方法に関する。より具体的には、本発明は、TEL遺伝子またはそのホモログをエンコードする核酸の植物における発現を調節するステップを含む、植物収量の増加方法に関する。本発明はまた、TEL遺伝子、またはそのホモログをエンコードする核酸の発現を増加させた植物に関し、その植物は対照植物と比較して増加した収量を有する。本発明は、本発明の方法において有用な構築物も提供する。
とくに、目的の植物におけるTELコード配列の発現を増大させるための方法を提供する。こうした発現の増大は植物の成長の増加、種子生産の増加、および収量の増加をもたらす。試料中のTEL核酸およびポリペプチドを検出するための方法およびキットも含まれる。
本発明は以下の実施形態を含む:
1.目的の植物における植物成長および/または収量の増加方法であって、前記方法が前記植物におけるTEL配列の発現を増加させるステップを含む、方法。
2.前記方法が、TELヌクレオチド配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むDNA構築物で前記植物を形質転換するステップにおいて、前記TEL配列が以下の特性の少なくとも1つを有するアミノ酸を含むタンパク質をエンコードする、ステップを含む、実施形態1の方法:
i)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
ii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも70%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iv)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも90%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
v)前記アミノ酸配列は4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが前記植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む;
vi)前記アミノ酸配列はRRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存されるアミノ酸配列を含む:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);
vii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
viii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
ix)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
i)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
ii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも70%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iv)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも90%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
v)前記アミノ酸配列は4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが前記植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む;
vi)前記アミノ酸配列はRRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存されるアミノ酸配列を含む:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);
vii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
viii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
ix)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
3.前記DNA構築物が前記プロモーターと操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも1つのエンハンサーおよびTEL配列をさらに含む、実施形態2の方法。
4.前記少なくとも1つのエンハンサーがカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)からの35Sエンハンサーである、実施形態3の方法。
5.前記TEL配列が合成配列である、実施形態1〜4いずれか1つの方法。
6.前記プロモーターがTELプロモーターである、実施形態2〜5のいずれか1つの方法。
7.前記TEL配列がSEQ ID NO:4と少なくとも58%の同一性を有し、少なくとも1つのTELモチーフを含む、実施形態2〜6のいずれか1つの方法。
8.TEL配列の発現が少なくとも2倍〜少なくとも50倍増加される、実施形態1〜7のいずれか1つの方法。
9.DNA構築物であって、前記構築物がTELヌクレオチド配列と操作可能に連結し、さらに植物における発現を増大させる少なくとも1つのエンハンサーと操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含む、DNA構築物を含む発現カセットにおいて、前記TEL配列が以下の特性の少なくとも1つを有するアミノ酸を含むタンパク質をエンコードする、発現カセット:
i)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
ii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも70%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iv)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも90%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
v)前記アミノ酸配列は4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが前記植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む;
vi)前記アミノ酸配列はRRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存されるアミノ酸配列を含む:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);
vii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
viii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
ix)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
i)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
ii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも70%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iv)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも90%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
v)前記アミノ酸配列は4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが前記植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む;
vi)前記アミノ酸配列はRRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存されるアミノ酸配列を含む:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);
vii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
viii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
ix)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
10.前記エンハンサーがCaMVからの35Sエンハンサーである、実施形態9の発現カセット。
11.前記TEL配列が合成配列である、実施形態9〜10いずれか1つの発現カセット。
12.前記プロモーターがTELプロモーターである、実施形態9〜11のいずれか1つの発現カセット。
13.実施形態9〜12のいずれか1つの発現カセットで形質転換された植物。
14.実施形態13の植物の形質転換種子。
15.前記TEL配列が内因性配列である、実施形態1の方法。
16.前記目的の植物がそのゲノム中に前記TEL遺伝子の約30kb以内で組み入れられた少なくとも1つのエンハンサーを有する、実施形態15の方法。
17.前記少なくとも1つのエンハンサーがCaMVからの35Sエンハンサーである、実施形態16の方法。
18.TEL配列の発現が少なくとも2倍〜少なくとも50倍増大される、実施形態15〜17のいずれか1つの方法。
19.対照植物と比較して増加したTEL配列の発現を示す形質転換植物。
20.前記植物がそのゲノム中にTELヌクレオチド配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むDNA構築物を安定に組み入れた、実施形態19の形質転換植物において、前記TEL配列が以下の特性の少なくとも1つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする、形質転換植物:
i)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
ii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも70%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iv)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも90%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
v)前記アミノ酸配列は4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが前記植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む;
vi)前記アミノ酸配列はRRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存されるアミノ酸配列を含む:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);
vii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
viii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
ix)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
i)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
ii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも70%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iii)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
iv)前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:4と少なくとも90%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;
v)前記アミノ酸配列は4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが前記植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む;
vi)前記アミノ酸配列はRRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存されるアミノ酸配列を含む:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);
vii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;
viii)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
ix)前記アミノ酸配列はイネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
21.前記DNA構築物が前記TEL配列と操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも1つのエンハンサーをさらに含む、実施形態20の形質転換植物。
22.前記少なくとも1つのエンハンサーがCaMVからの35Sエンハンサーである、実施形態21の形質転換植物。
23.前記TEL配列が合成配列である、実施形態20〜22のいずれか1つの形質転換植物。
24.前記プロモーターがTELプロモーターである、実施形態20〜23のいずれか1つの形質転換植物。
25.前記TELプロモーターが前記TEL配列と同種である、実施形態24の形質転換植物。
26.TEL配列の発現が少なくとも2倍〜少なくとも50倍増加される、実施形態19〜25のいずれか1つの形質転換植物。
27.前記TEL配列が内因性配列である、実施形態19の形質転換植物。
28.前記目的の植物がそのゲノム中に前記TEL遺伝子の約30kb以内で組み入れられた少なくとも1つのエンハンサーを有する、実施形態27の形質転換植物。
29.前記少なくとも1つのエンハンサーがCaMVからの35Sエンハンサーである、実施形態28の形質転換植物。
30.TEL配列の発現が少なくとも2倍〜少なくとも50倍増加される、実施形態27〜29のいずれか1つの形質転換植物。
31.実施形態19〜30のいずれか1つの植物からの形質転換種子。
32.前記植物がトウモロコシ、モロコシ、コムギ、アブラナ科植物、ワタ、イネ、ダイズ、オオムギ、ヒマワリ、サトウキビ、針葉樹、ススキ、スイッチグラス、およびナタネからなる群から選択される、実施形態19〜30のいずれか1つの形質転換植物。
33.前記植物が単子葉植物である、実施形態13、14、および20〜32のいずれか1つの植物。
34.前記植物が双子葉植物である、実施形態13、14、および20〜32のいずれかの1つの植物。
本発明は、植物または植物細胞におけるTEL遺伝子またはコード配列の発現を増加させるための方法に関する。植物におけるTEL配列の発現を増加または増大させることにより、植物は植物成長およびひいては作物収量の向上を示す。「TEL配列」とは、以下の特性の少なくとも1つを有する核酸分子を指す:SEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;SEQ ID NO:4と少なくとも70%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする; SEQ ID NO:4と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;SEQ ID NO:4と少なくとも90%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;SEQ ID NO:4を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;RRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存されるアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);イネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;イネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;およびイネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする。
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);イネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;イネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする;およびイネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする。
すなわち、本発明のTEL配列は少なくともRRM3モチーフ、および全長TEL配列まで、少なくとも約15個の追加のアミノ酸、少なくとも約20個の追加のアミノ酸、少なくとも約25個の追加のアミノ酸、少なくとも約30個の追加のアミノ酸、少なくとも約40個の追加のアミノ酸、少なくとも約50個の追加アミノ酸を含む。1つの実施形態では、TEL配列はアミノ酸配列:
dtrttvmirnipnkysqklllnmldnhcilsnqqieascedeaqpfssydflylpidfnnkcnvgygfvnltspeaavrlykafhkqpwevfnsrkicqvtyarvqgldalkehfknskfpcdsdeylpvvfspprdgklltepvpl SEQ ID NO:62
を含むアミノ酸配列をエンコードする。他の実施形態では、TEL配列はSEQ ID NO:62と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列をエンコードする配列を含む。
dtrttvmirnipnkysqklllnmldnhcilsnqqieascedeaqpfssydflylpidfnnkcnvgygfvnltspeaavrlykafhkqpwevfnsrkicqvtyarvqgldalkehfknskfpcdsdeylpvvfspprdgklltepvpl SEQ ID NO:62
を含むアミノ酸配列をエンコードする。他の実施形態では、TEL配列はSEQ ID NO:62と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列をエンコードする配列を含む。
C末端RRM(RRM3)はMei2様タンパク質に特有であり、3つのRRMのうちもっとも高度に保存される。RRM3はまた、他のRRMドメインでは見られない保存配列要素をそのC末端に含有する。Jeffares et al.(2004)Dev Genes Evol.214(3):149−58を参照されたい。
TEL配列の発現の増加は、収穫指数を低減することなく、植物成長、強度、活力、および収量を増加させる。形質転換植物は丈が高く、幹または茎が大きく、成長が早く、成長活力を示し、大きなバイオマスを生産し、増加した種子生産を有する。植物は大きく強い根を有する。本発明の形質転換植物を栽培すれば作物収量が増加するだろう。「作物収量」とは、土地面積の単位当たりに収穫される作物の量を指す。作物収量は穀物、または豆に用いられることが多い評価方法であり、通常ヘクタール当たりのメトリックトン(またはヘクタール当たりのキログラム)で測定される。作物収量は植物からの種子生産量も指す。「植物成長」とは、植物の大きさ、高さ、周径、強度、質量、種子生産数、等を指す。
本方法は目的の植物におけるTEL遺伝子の発現の増加または増大を含む。植物におけるTEL遺伝子の発現を増加させるためのいずれの方法も本発明に含まれる。目的の植物は、TEL遺伝子またはその変異体もしくはトランケーション体のコード配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動することができるプロモーターを含む、DNA構築物で形質転換することができる。任意で、DNA構築物は、コード配列の発現を増加させるように作用する、少なくとも1つの操作可能に連結したエンハンサーを含むことができる。別の実施形態では、プロモーターまたはエンハンサーは目的の植物のゲノム中、植物における天然TELコード配列の発現を増加させる部位に挿入することができる。
植物におけるTEL配列の発現を増大または増加させることにより、植物成長、種子生産、および一般的な収量の増加が見られる。「TEL遺伝子の発現の増大または増加」とは、目的の植物において、対照植物と比較して、mRNAまたはTELタンパク質の産生により測定される発現が少なくとも約2倍、約5倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍またはそれより大きく増加されることを指す。「対照植物」とは、TEL配列の発現を変化もしくは増大させていない、または追加のTEL配列で形質転換していない植物、すなわち、当該植物または植物細胞と遺伝子的には同一であるが、TEL遺伝子の発現を誘発する条件または刺激に曝露されていない植物または植物細胞を指す。すなわち、本発明の変異植物はTELmRNA、TELタンパク質、または両方の発現の増大を示す。
いずれの理論にも縛られないが、TELタンパク質の極度の過剰産生は望ましくない表現型を有する植物をもたらし得ると考えられる。従って、形質転換植物におけるTEL配列の発現を駆動するのに用いられるプロモーターの選択により、発現を制御することができる。TELプロモーターは所望のレベルでの組換え遺伝子の発現において良好な結果をもたらす。後述するように、強い構成的プロモーターを含む、いずれのプロモーターを用いてもよい。しかしながら、強いプロモーターが用いられる場合、得られる植物を所望の表現型に基づき選択することができる。よって、本発明の方法は形質転換植物の所望の表現型の選択を含む。こうした所望の植物は、成長および活力の増加、大きな幹および根による強度の増加、または穀実もしくはバイオマス収量の増加を示すだろう。所望の形質転換植物は表現型に基づき選択することができるが、こうした植物は少なくとも2倍〜60倍のTEL発現の増加、少なくとも10倍〜50倍の発現の増加、少なくとも20倍、少なくとも30倍、または少なくとも40倍の発現の増加を示すだろうと考えられる。
こうした所望の植物を栽培し、適切な植物と交配し、所望の表現型を有する種子を作製することができる。すなわち、少なくとも1つのエンハンサーの挿入によりその発現が増加された組換えTEL遺伝子または内因性TEL遺伝子を目的の植物に導入することができる。こうした植物は増大した割合で成長し、作物を生産するだろう。
「TEL遺伝子」または「TEL配列」とは、TELタンパク質またはTELタンパク質の変異体もしくはトランケーション体の全アミノ酸配列をエンコードする配列を指す。こうしたトランケーション体は上述したRRM3保存領域を含む。目的の植物を形質転換するのに用いられるTEL遺伝子はその植物と同種または異種であってもよい。多くのTEL遺伝子が当技術分野において知られているが、本発明の実施では、フラグメントおよび変異体が植物成長を促進し、収量を増加させる所望の活性を保持する限り、既知のTEL遺伝子のフラグメントおよび変異体を含む、いずれを用いることもできる。TEL遺伝子は、酵母のMei2とアミノ酸配列類似性を共有する植物および菌類からの遺伝子のグループである(Watanabe and Yamamoto 1994,Cell 78:487−498)。すべての植物は多数のMei2様遺伝子を有し、それらの配列類似性に基づき2つのグループに分けることができる(Jeffares et al.2004,Dev.Genes.Evol 214:149−158)。1つは、もとはシロイヌナズナから同定されたAMLタンパク質と類似する、AMLグループである(Hirayama et al.(1997)FEBS Lett.413:16−20)。
Mei2様遺伝子の2つめのグループは、トウモロコシからのTerminal Ear1(TE1)遺伝子と類似する、TELグループである(Veit et al.(1998)Nature 393:166−168)。植物Mei2様遺伝子がTELまたはAML遺伝子であるかどうかは、エンコードされたアミノ酸配列の分析により決定することができる。例えば、図1はVector NTIにより構築されたさまざまな植物Mei2様遺伝子の系統樹を示す。この系統樹では、植物Mei2様遺伝子は2つの異なるグループ、AMLグループおよびTELグループを明確に形成した。TEL様タンパク質は通常、N末端領域に2つのRNA認識モチーフ(RRM)、およびそのC末端領域に1つのRNA認識モチーフ(RRM3)を含有する。C末端のRRM3は植物に高度に保存され、TELタンパク質の機能にとって重要な役割を果たす。AMLタンパク質と比較して、TELタンパク質に特有の特性は、RRM3モチーフ内に挿入されたTEL特異的ペプチドである(図2)。すべてのAMLタンパク質はこのモチーフを有さない。TELタンパク質に特有の別の特性は、RRM3のC末端外の保存領域である(図2)。これはすべてのAMLタンパク質に含まれない。本発明のTELアミノ酸配列は、この保存領域内で少なくとも約60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれより高い配列同一性を共有する。
よって、本発明のTELまたはTEL様タンパク質としては、TELモチーフの少なくとも1つを有するものが挙げられる。本発明のTELまたはTEL様タンパク質としては、SEQ ID NO:4、保存領域と少なくとも約60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれより高い配列同一性を有するものが挙げられる。保存領域を有するTEL配列を同定するため、イネ保存モチーフを用い、NCBI配列データベースを後述するデフォルトパラメーターを用いて検索することができる。イネ配列が用いられ、TEL配列がアラインされる場合、配列は約60%またはそれより高い配列同一性を共有する。同様に、TELまたはTEL様タンパク質としては、TELモチーフの少なくとも1つを有し、本発明のTELタンパク質と少なくとも50%、少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するものが挙げられる。TELまたはTEL様タンパク質としては、保存領域内で少なくとも60%の配列同一性を有し、本発明のTELタンパク質と少なくとも50%、少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するものが挙げられる。
多くのTEL遺伝子が本明細書において開示され、当技術分野において知られているが、これらのTEL配列のいずれか、ならびにその変異体およびトランケーション体はいずれの目的の植物にも用いることができる。後述するように、本明細書における配列は、本発明の実施において有用な他のTEL遺伝子を単離するのに用いることができる。本発明のTELタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列としては、SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、31、33、37、39、41、43、45に記載される配列、ならびにその変異体、フラグメント、および補体が挙げられる。当技術分野において知られ、本発明の実施において有用な他の配列としては、シロイヌナズナ(例えば、NP_189242.1、BAB01438.1、NP_176943.1、BAA22374.1、NP_568946.1、NP_174902.1、NP_196346.1、ABE65689.1、BAF02107.1、AAG51742.1);トウモロコシ(例えば、NP_001104903.1、DAA56253.1、NP_001151419.1、DAA40614.1、NP_001132246.1、AFW58118.1、ACN26476.1、AFW86252.1、NP_001169543.1、AFW75193.1);ヨーロッパブドウ(例えば、XP_002282117.1、XP_002271386.1、CBI17716.3、CBI16829.3、XP_003634410.1、CBI19075.3、CBI31752.3、CBI38012.3、XP_002279792.2);ダイズ(例えば、XP_003552800.1、XP_003537555.1、XP_003532096.1、XP_003551918.1、XP_003522450.1、XP_003546575.1);タルウマゴヤシ(Medicago truncatula)(例えば、XP_003601878.1、XP_003595582.1、XP_003595581.1、AAT38998.1、XP_003602750.1、XP_003630595.1);ヒロハハコヤナギ(例えば、XP_002311749.1、XP_002314579.1、XP_002301014.1、XP_002328959.1、XP_002334130.1、XP_002297875.1);ヒメツリガネゴケ(例えば、XP_001778423.1、AEN71547.1、XP_001764176.1、AEN71548.1、XP_001780082.1、XP_001765627.1);セイヨウミヤマハタザオ(例えば、XP_002875310.1、XP_002887144.1、XP_002866463.1、XP_002871262.1、XP_002893925.1);トウゴマ(例えば、XP_002515045.1、XP_002512974.1、XP_002513823.1、XP_002534743.1、XP_002511091.1);イヌカタヒバ(例えば、XP_002960552.1、XP_002969195.1、XP_002969607.1、XP_002965317.1、XP_002982799.1);モロコシ(例えば、XP_002456810.1、XP_002462714.1、XP_002437661.1、XP_002452169.1);セイヨウヤマカモジ(Brachypodium distachyon)(例えば、XP_003567374.1、XP_003576762.1、XP_003579645.1、XP_003569150.1);イネ、ジャポニカ種(例えば、NP_001045139.1、EAZ14552.1、NP_001063754.1、NP_001172988.1);ヨーロッパヤマナラシ×ウラジロハコヤナギ(例えば、ABR19818.1、ABR19817.1);オオムギ(Hordeum vulgare subsp.vulgare)(例えば、BAJ85875.1、AAL85701.1);イネ、インディカ種(例えば、A2WY46.1、EEC84932.1);トマト(Solanum lycopersicum)(例えば、NP_001234547.1);パンコムギ(Triticum aestivum)(例えば、AAT39003.1);クサビコムギ(Aegilops speltoides)(例えば、AAT39000.1);ヨツヒメゾウリムシ(Paramecium tetraurelia)d4−2株(例えば、XP_001432620.1、XP_001436478.1);ウンシュウミカン(Citrus unshiu)(例えば、AAT39004.1);テーダマツ(Pinus taeda)(例えば、AAT38996.1);ボルボックス(Volvox carteri f.nagariensis)(例えば、XP_002957664.1);クラミドモナス・ラインハーディ(Chlamydomonas reinhardtii)(例えば、XP_001700078.1);オストレオコッカス・タウリ(例えば、XP_003079264.1);オストレオコッカス・ルシマリヌス(Ostreococcus lucimarinus)CCE9901(例えば、XP_001417970.1);クロレラ・バリアビリス(Chlorella variabilis)(例えば、EFN52088.1);シトカトウヒ(Picea sitchensis)(例えば、ABR16149.1);ネグレリア・グルベリ(Naegleria gruberi)(例えば、XP_002670292.1);テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)(例えば、XP_001032018.1);およびアルブゴ・ライバキ(Albugo laibachii)(例えば、CCA21771.1)が挙げられる。こうした配列はすべて本明細書に参照により組み入れられる。「補完」とは、所定のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、これにより安定な二本鎖を形成することができるように、所定のヌクレオチド配列と十分に相補的なヌクレオチド配列を指す。
TELタンパク質をエンコードするこれらのヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子も本発明に含まれる。「フラグメント」とは、TELタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列の一部分を指す。ヌクレオチド配列のフラグメントはTELタンパク質の生物学的に活性な部分をエンコードすることができ、または他のTEL様配列を単離するのに有用なハイブリダイゼーションプローブもしくはPCRプライマーとして用いることができるフラグメントであってもよい。一般的には、本発明のヌクレオチド配列のトランケーションフラグメントは、RRM3保存領域を含み、TELタンパク質の生物学的活性を保持し、ひいてはTEL活性を保持するタンパク質フラグメントをエンコードする。「活性を保持する」とは、フラグメントがTELタンパク質のTEL活性の少なくとも約50%、少なくとも約70%、80%、90%、95%またはそれより高い割合を有することを指す。「TEL活性」とは植物成長または収量の増加を指す。TEL活性の測定方法は、タンパク質レベルまたはmRNAレベルを測定するステップ、および成長表現型の増加について変異植物を成長させるステップを含む。
TEL核酸分子の変異体はさまざまな方法により作製することができる。これらの変異は、本発明のTELタンパク質によりエンコードされるものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードするDNA配列をもたらすことができる。よって、タンパク質は、1つ以上のアミノ酸の置換、欠失、トランケーション、および挿入を含むさまざまな方法で変性させることができる。こうした操作の方法は一般的には当技術分野において知られている。例えば、TELタンパク質のアミノ酸配列変異体はDNAの変異により調製することができる。これは変異誘発および/または指向性進化におけるいくつかの形態の1つにより達成することもできる。いくつかの態様では、アミノ酸配列においてエンコードされる変化はタンパク質の機能に実質的には影響を及ぼさない。方法としては、DNA複製中の塩基の誤取り込み、例えばXL−1 Red(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ);DNAシャッフリング(Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747−10751;Stemmer(1994)Nature 370:389−391;Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15:436−438;Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272:336−347;Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504−4509;Crameri et al.(1998)Nature 391:288−291;ならびに米国特許第5,605,793号および第5,837,458号);等が挙げられる。タンパク質配列に対する変異は、PCR、変異誘発、組換え、等のような分子方法により導入される挿入、欠失、または変異により行うことができる。こうした変異体は所望のTEL活性を有する。しかしながら、TELタンパク質のTEL活性を与える能力は、本発明の組成物にこうした技術を用いることにより向上させることができることが理解される。
本発明の好適なTELタンパク質は、本明細書に挙げられる、または配列表に含まれるTEL配列のいずれかのヌクレオチド配列と同一の、または配列同一性を有するヌクレオチド配列によりエンコードされる。標準的なパラメーターを用いて本明細書に記載されるアラインメントプログラムの1つを用い、参照TEL配列と比較して、少なくとも約50%、約60%または65%の配列同一性、約70%または75%の配列同一性、約80%または85%の配列同一性、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより高い配列同一性を有する変異体アミノ酸またはヌクレオチド配列は本発明に含まれる。当業者であれば、コドンの縮退、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置、等を考慮することにより、これらの値を適切に調節し、2つのヌクレオチド配列によりエンコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができることを認識するだろう。
2つのアミノ酸配列または2つの核酸の同一性パーセントを決定するため、配列は最適な比較を目的としてアラインされる。2つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数である(すなわち、同一性パーセント=同一位置の数/位置の総数(例えば、重複位置)×100)。1つの実施形態では、2つの配列は同じ長さである。別の実施形態では、同一性パーセントは参照配列の全体にわたって計算される。2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容して、または許容せずに、後述するものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際には、一般的には完全マッチが数えられる。
2つの配列間の同一性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの非限定的な例としては、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877において修正された、Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264のアルゴリズムがある。こうしたアルゴリズムはAltschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403のBLASTNおよびBLASTXプログラムに組み入れられる。本発明のTEL様核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るには、BLASTヌクレオチド検索をBLASTNプログラム、スコア=100、語長=12で行うことができる。本発明のTELタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るには、BLASTタンパク質検索をBLASTNXプログラム、スコア=50、語長=3で行うことができる。比較を目的としてギャップを有するアラインメントを得るには、Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389に記載されるように、GappedBLAST(BLAST2.0)を用いることができる。あるいは、PSI−BLASTを用い、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。Altschul et al.(1997)同上を参照されたい。BLAST、GappedBLAST、およびPSI−BLASTプログラムを用いる場合、各プログラム(例えば、BLASTXおよびBLASTN)のデフォルトパラメーターを用いることができる。アラインメントは精査により手動で行うこともできる。
配列の比較にはClustalWアルゴリズム(Higgins et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:4673−4680)を含む他の数学的アルゴリズムを用いてもよい。ClustalWは配列を比較し、アミノ酸またはDNA配列の全体をアラインし、よって全アミノ酸配列の配列保存についてのデータを提供することができる。ClustalWアルゴリズムはいくつかの市販のDNA/アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばVector NTIプログラムスイート(Invitrogen Corporation、カリフォルニア州カールスバッド)のALIGNXモジュールに用いられている。ClustalWでのアミノ酸配列のアラインメント後、アミノ酸同一性パーセントを評価することができる。ClustalWアラインメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例としてはGENEDOC(商標)がある。GENEDOC(商標)(Karl Nicholas)は複数のタンパク質間のアミノ酸(またはDNA)類似性および同一性の評価を可能にする。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の非限定的な例としては、Myers and Miller(1988)CABIOS 4:11−17のアルゴリズムがある。こうしたアルゴリズムは、GCG Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ、バージョン10(Accelrys, Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ、スクラントン・ロード9685から市販)の一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み入れられている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを用いる場合、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、ギャップペナルティ4を用いることができる。
他に記載のない限り、配列同一性または類似性を決定するには、以下のパラメーターを用い、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443−453のアルゴリズムを用いるGAPバージョン10が用いられる:ヌクレオチド配列の同一性%および類似性%にはギャップ重量50および長さ重量3、ならびにnwsgapdna.cmpスコアリングマトリックス;アミノ酸配列の同一性%または類似性%にはギャップ重量8および長さ重量2、ならびにBLOSUM62スコアリングプログラム。同等のプログラムを用いることもできる。「同等のプログラム」とは、いずれかの問題の2つの配列について、GAPバージョン10により生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチド残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する、いずれかの配列比較プログラムを指す。
示したように、本発明の実施では変異体TEL核酸分子を用いてもよい。ヌクレオチド配列をエンコードするTELタンパク質の「変異体」は、本明細書に開示されるTELタンパク質をエンコードするが、遺伝コードの縮退のためわずかに異なる配列、および上述したように十分に同一である配列を含む。天然発生対立変異体は周知の分子生物学技術、例えばポリメラーゼ鎖反応(PCR)および後述するハイブリダイゼーション技術を用いて同定することができる。変異体ヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的変異誘発を用いることにより生成されたが、後述するように依然として本発明に開示されるTELタンパク質をエンコードする、合成誘導ヌクレオチド配列も含む。本発明に含まれる変異体タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわち、TEL活性を有し続ける。
当業者であれば、本発明のヌクレオチド配列の変異により変化を導入し、これにより、タンパク質の生物学的活性を変えることなく、エンコードされたTELタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることをさらに理解するだろう。よって、変異体単離核酸分子は、1つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がエンコードされたタンパク質に導入されるように、1つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を本明細書に開示される対応するヌクレオチド配列に導入することにより作製することができる。変異は標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発により導入することができる。こうした変異体ヌクレオチド配列も本発明に含まれる。
例えば、保存アミノ酸置換は、1つ以上の予測された非必須アミノ酸残基で行うことができる。「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要であるが、「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変えることなく、TELタンパク質の野生型配列から変異させることができる残基である。「保存アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リシン、アラギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。
アミノ酸置換は機能を保持する非保存領域において行ってもよい。一般的には、こうした置換は保存アミノ酸残基、またはこうした残基がタンパク質活性に必須である、保存モチーフ内に存在するアミノ酸残基については行われない。保存され、タンパク質活性に必須であり得る残基の例としては、例えば、本発明の配列と類似または関連したタンパク質のアラインメントに含まれるすべてのタンパク質間で同一である残基(例えば、相同タンパク質のアラインメントにおいて同一である残基)が挙げられる。保存されるが、保存アミノ酸置換が可能であり得、依然として活性を保持し得る残基の例としては、例えば、本発明の配列と類似または関連した高収量タンパク質のアラインメントに含まれるすべてのタンパク質間に保存置換のみを有する残基(例えば、相同タンパク質のアラインメントに含まれるすべてのタンパク質間に保存置換のみを有する残基)が挙げられる。しかしながら、当業者であれば、機能的変異体が保存残基において小さな保存または非保存変異を有し得ることを理解するだろう。1つの実施形態では、アミノ酸配列における変化は、図2に記載される保存モチーフまたはそのモチーフの周りの領域では行われない。
あるいは、変異体ヌクレオチド配列は、変異をコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することにより、例えば飽和変異誘発により生成することができ、得られた変異体はTEL活性を与える能力についてスクリーニングし、活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後、エンコードされたタンパク質は組換え発現することができ、タンパク質の活性は標準的なアッセイ技術を用いて決定することができる。
本発明のポリペプチド、またはその変異体もしくはフラグメントに対する抗体も含まれる。抗体の作製方法は当技術分野において周知である(例えば、Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY;米国特許第4,196,265号参照)。
本明細書において挙げられるTELタンパク質に加えて、本発明は、植物、コケ、および菌類を含む他の生物において新規TEL遺伝子をクローニングおよび使用する方法も提供する。例えば、本明細書において提供される配列を用いることにより、新規TEL遺伝子をPCRおよび核酸ハイブリダイゼーションのような方法でクローニングすることができる。PCRプライマーはTEL遺伝子のDNA配列の保存領域に応じて設計することができる。また、保存アミノ酸配列を用い、PCRの縮重プライマーを設計することができる。PCRから部分的に知られる遺伝子を用い、Tail−PCR、5’RACE、3’RACE、等のようなさまざまな既知の方法を用いて全長遺伝子をクローニングすることができる。例えば、Singer and Burke(2003)Methods Mol Biol 236:241−272;および市販のキットを参照されたい。後述するように、本発明および他の文献において提供される遺伝子を用い、ゲノムまたはcDNAライブラリーをハイブリダイズするプローブを調製し、TEL遺伝子をクローニングすることができる。TEL様遺伝子がクローニングされると、そのエンコードされたアミノ酸配列を用い、これが図1に例示されるようなTEL遺伝子のオルソログであるかを決定することができる。
さまざまな配列決定プロジェクトの急速な進歩に伴い、新規TEL遺伝子は、本発明により提供されるTELアミノ酸配列および/または核酸配列を用いてさまざまなデータベースを検索することにより同定することができる。こうしたデータベースとしては、これらに限定されないが、ゲノム配列、ETS、およびcDNA配列のデータベースが挙げられる。BLAST法(Altschul et al.1990 J.Mol.Biol.215,403-410)が広く用いられている。例えば、Jeffares et al.は検索によりデータベースから15個のMei2様遺伝子を同定し、そのいくつかはさらにTELグループのメンバーと同定された(Jeffares et al.2004,Dev.Genes.Evol.214:149−158)。
Mei2様タンパク質がTELグループのタンパク質であるかを決定するため、そのアミノ酸配列を調査することができる。本発明のTELタンパク質は収量増大に有用となる以下の特性の少なくとも1つを有する:SEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;SEQ ID NO:4と少なくとも70%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;SEQ ID NO:4と少なくとも80%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;SEQ ID NO:4と少なくとも90%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む;4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む;RRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存されるアミノ酸配列を含む:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);イネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;イネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;イネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);イネTELタンパク質と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;イネTELタンパク質と少なくとも約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;イネTELタンパク質と少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
よって、PCR、ハイブリダイゼーション、等のような方法を用い、対応するTEL配列、本発明の配列と実質的な同一性を有する配列を同定することができる。例えば、Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)およびInnis,et al.(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,NY)を参照されたい。
ハイブリダイゼーション方法では、本明細書において開示されるTELヌクレオチド配列のすべてまたは一部を用い、本発明に用いられる追加のTEL配列についてcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。こうしたcDNAおよびゲノムライブラリーの構築方法は当技術分野において一般的に知られ、Sambrook and Russell,2001,同上において開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムDNAフラグメント、cDNAフラグメント、RNAフラグメント、または他のオリゴヌクレチドであってもよく、32P、またはその他の検出可能なマーカー、例えば他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子のような検出可能な基で標識することができる。ハイブリダイゼーションのプローブは、合成オリゴヌクレオチドを本明細書において開示される既知のTELタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列に基づき標識することにより作製することができる。ヌクレオチド配列またはエンコードされたアミノ酸配列中の保存ヌクレオチドまたはアミノ酸残基に基づき設計された縮重プライマーをさらに用いることができる。プローブは一般的には、ストリンジェントな条件下で本発明のTELタンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体をエンコードするヌクレオチド配列の少なくとも約12個、少なくとも約25個、少なくとも約50個、75個、100個、125個、150個、175個、または200個の連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製方法は一般的には当技術分野において知られ、本明細書に参照により組み入れられるSambrook and Russell,2001,同上において開示されている。
例えば、本明細書において開示される全TEL核酸配列、またはその一部分以上は、対応するTEL様配列およびメッセンジャーRNAと特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして用いることができる。さまざまな条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するため、こうしたプローブは特有の、好適には少なくとも約10個のヌクレオチドの長さ、または少なくとも約20個のヌクレオチドの長さの配列を含む。こうしたプローブを用い、PCRにより選択された生物からの対応するTEL配列を増幅することができる。所望の生物からの追加のコード配列を単離するため、または生物中のコード配列の存在を決定する診断アッセイとしてこの技術を用いることができる。ハイブリダイゼーション技術としては、導入されたDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングが挙げられる(プラークまたはコロニー;例えばSambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)参照)。
こうした配列のハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、その下でプローブがその標的配列と、他の配列より検出可能に大きい程度(例えば、バックグラウンドの少なくとも2倍)までハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと100%相補的な標的配列を同定することができる(相同プロ―ビング)。あるいは、ストリンジェンシー条件は、低い程度の類似性が検出されるように、配列中のいくらかのミスマッチを許容するよう調節することができる(非相同プロ―ビング)。一般的には、プローブは約1000個未満のヌクレオチドの長さ、好適には500個未満のヌクレオチドの長さである。
一般的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がpH7.0〜8.3で約1.5M未満のNaイオン、一般的には約0.01〜10MのNaイオン(または他の塩)であり、温度が短いプローブ(例えば、10〜50個のヌクレオチド)について少なくとも約30℃、長いプローブ(例えば、50個より多いヌクレオチド)について少なくとも約60℃であるものである。ストリンジェントな条件はホルムアミドのような脱安定化剤の添加で達成することもできる。例となる低ストリンジェンシー条件は、30〜35%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、37℃のバッファー溶液でのハイブリダイゼーション、および50〜55℃の1倍〜2倍SSC(20倍SSC=3.0M NaCl/0.3M クエン酸三ナトリウム)での洗浄を含む。例となる中ストリンジェンシー条件は、40〜45%ホルムアミド、1.0M NaCl、1%SDS、37℃でのハイブリダイゼーション、および55〜60℃の0.5倍〜1倍SSCでの洗浄を含む。例となる高ストリンジェンシー条件は、50%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS、37℃でのハイブリダイゼーション、および60〜65℃の0.1倍SSCでの洗浄を含む。任意で、洗浄バッファーは約0.1%〜約1%のSDSを含むことができる。ハイブリダイゼーション時間は一般的には約24時間未満、通常は約4時間〜約12時間である。
特異性は一般的にはポストハイブリダイゼーション洗浄の機能であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。DNA−DNAハイブリッドについて、TmはMeinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267−284の式:Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(%GC)− 0.61(%form)−500/Lから概算することができ;式中、Mは一価カチオンのモル濃度であり、%GCはDNA中のグアノシンおよびサイトシンヌクレオチドの割合であり、%formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Lは塩基対中のハイブリッドの長さである。Tmは、相補的標的配列の50%が完全マッチプローブとハイブリダイズする温度(定義されたイオン強度およびpH下)である。Tmはミスマッチ1%毎に約1℃低下し;よって、Tm、ハイブリダイゼーション、および/または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするよう調節することができる。例えば、≧90%同一性を有する配列が求められる場合、Tmを10℃低下させることができる。一般的には、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびpHで特定の配列およびその補体について熱融点(Tm)より約5℃低くなるよう選択される。しかしながら、激しくストリンジェントな条件は熱融点(Tm)より1、2、3、または4℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を用いることができ;中程度にストリンジェントな条件は熱融点(Tm)より6、7、8、9、または10℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を用いることができ;低ストリンジェンシー条件は熱融点(Tm)より11、12、13、14、15、または20℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を用いることができる。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のTmを用い、当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける多様性が本質的に説明されていることを理解するだろう。所望のミスマッチの程度が45℃(水溶液)または32℃(ホルムアミド溶液)未満のTmをもたらす場合、より高い温度を用いることができるように、SSC濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについてのさらなる説明は、Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I,Chapter 2(Elsevier,New York);およびAusubel et al.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2(Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York)において見られる。Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)を参照されたい。
上述したように、植物におけるTEL遺伝子の発現を増加させるための1つ方法は、本発明のTEL配列をエンコードする核酸分子を含むDNA構築物で目的の植物を形質転換することである。植物およびよって作物においてTEL遺伝子を導入および発現する一般的な方法が現在利用可能である。一般的には、目的の植物の形質転換は以下のステップを含む:1)TEL遺伝子の発現カセットを構築するステップ(構築物に用いられるポリヌクレオチドはコード配列を含有するゲノムフラグメント、または全長cDNA、もしくは人工的に合成されたaDNAフラグメントとすることができる。プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターのような制御配列はコードDNAと操作可能に連結し、機能的発現カセットを作製することができる。通常、プロモーターはコードDNAの5’端と連結し、ターミネーターはコードDNAの3’端と連結している。発現カセットは、天然プロモーター、コード配列およびターミネーターを含むゲノムTEL DNAフラグメントを含むことができる。);2)TEL発現カセットを有する形質転換ベクターを構築するステップ(例えば、pCambia1300またはその修飾バージョンを用い、アグロバクテリウム媒介形質転換のTEL発現カセットをクローニングすることができる。);および3)標的作物を形質転換し、形質転換イベントを選択するステップ(ウエスタン分析法を用い、TEL導入遺伝子の発現を検出することができる。)。
本発明の実施では天然または内因性TEL遺伝子の発現カセットを用いることができる。こうした発現カセットはプロモーター、コード配列およびターミネーターを、すべてゲノムDNAの1つのフラグメント中に含有する。TEL遺伝子のプロモーターは通常、コード配列の5’端に位置し、開始コドンの最大2〜3kb上流である。ターミネーターは通常、コード配列の3’端に約1.0kb以内で位置する。AATAAAのようなポリAシグナル配列はターミネーターの端で用いることができる。
さらに、本発明はさまざまな植物ゲノムからの多くの天然TEL発現カセットも提供する。これらのカセットの核酸配列は、SEQ ID NO:5、7、9、13、15、17、19、21、23、27、29、および45に挙げられる。形質転換植物におけるこれらのTELの発現を増大させるため、エンハンサーをこれらの発現カセットの上流または下流に挿入することができる。1つのよく用いられるエンハンサーはカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sエンハンサーである(Benfey et al.1990,EMBO J.9:1685−1696)。
示したように、本発明のTEL配列は、目的の植物における発現のためのDNA構築物または発現カセットにおいて提供することができる。「植物発現カセット」とは、植物細胞においてオープンリーディングフレームからのタンパク質の発現をもたらすことができるDNA構築物を指す。一般的にはこれらはプロモーターおよびコード配列を含有する。こうした構築物は3’非翻訳領域も含有することが多い。こうした構築物は、植物におけるTELコード配列の発現を増大または増加させるエンハンサーを含有することができる。
「植物形質転換ベクター」とは、植物細胞の効率的な形質転換に必要なDNA分子を指す。こうした分子は1つ以上の植物発現カセットで構成することができ、2つ以上の「ベクター」DNA分子に組織化することができる。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換に必要なすべてのシス作用性およびトランス作用性機能をエンコードするのに2つの隣接しないDNAベクターを用いる植物形質転換ベクターである(Hellens and Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5:446−451)。「ベクター」とは、異なる宿主細胞間での導入のために設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」とは、外来細胞において異種DNA配列またはフラグメントを導入、挿入および発現する能力を有するベクターを指す。カセットは本発明の配列と操作可能に連結した5’および3’制御配列を含む。「操作可能に連結した」とは、プロモーターと第2配列との間の機能的連結を指し、そこではプロモーター配列が第2配列に対応するDNA配列の転写を開始および媒介する。一般的には、操作可能に連結しているとは、連結した核酸配列が隣接し、2つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合は隣接し、かつ同じリーディングフレーム内にあることを意味する。カセットは、生物に共形質転換する少なくとも1つの追加の遺伝子をさらに含有することができる。あるいは、追加の遺伝子は複数の発現カセット上に提供することができる。
「プロモーター」とは、下流コード配列の転写を指示するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは、他の転写および翻訳制御核酸配列(別名「コントロール配列」)とともに、目的のDNA配列の発現に必要である。本発明の実施では構成的または組織特異的プロモーターを用いることができる。コアCaMV35Sプロモーター(Odell et al.(1985)Nature 313:810−812);イネアクチン(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163−171);ユビキチン(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619−632およびChristensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675−689);pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581−588);MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723−2730);ALSプロモーター(米国特許第5,659,026号)、ルビスコスモールサブユニットからのプロモーター、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼのようなアグロバクテリウム・ツメファシエンスT−DNAから誘導されるプロモーター、等を含む、多くのプロモーターが知られ、これらを用いることができる。組織特異的プロモーターとしては、分裂組織特異的プロモーター(Ito et al.(1994)Plant Mol Biol 24:863−878;Verma and Kumar(2005)Indian J Biotechnology 4:516−521;Shimizu et al(2009)Plant Physiol 149:841−850);トウモロコシホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのような緑色組織特異的プロモーター(米国特許第5,856,177号);等が挙げられる。これらの参照文献のすべては本明細書に参照により組み入れられる。
TEL遺伝子のプロモーターを用い、目的の植物における他のTEL遺伝子のコード配列の発現を駆動することができる。例えば、トウモロコシTEL遺伝子プロモーターを用い、イネ、コムギ、モロコシ、トウモロコシ、等におけるイネTEL遺伝子発現を駆動することができる。さまざまな植物からのプロモーターはSEQ ID NO:52〜55に提供される。クローニングされたいずれかの遺伝子からプロモーター領域を単離することは周知の技術である。
遺伝子発現の制御に用いられるプロモーターについてはよく研究されている。例えば、Potenza et al.2004,In.Vitro.Cell.Dev.Biol−Plant.40:1−2を参照されたい。構造的発現および組織特異的発現のためのすべてのプロモーターは、収量増大のため植物におけるTEL遺伝子の発現を駆動するのに用いることができる。本発明においてTEL遺伝子の発現を指示するのに用いられるプロモーターは、組織特異的プロモーター(米国特許第5880330号)、ARSK1根特異的プロモーター、AP1開花プロモーター(Bai et al.2008,Transgenic Res.17:1035−1043)のような、さまざまな異種プロモーターとすることができる。これらのプロモーターは組織特異的発現増大をもたらすことができ、これは組織特異的成長増大をもたらすことができる。
DNA構築物または発現カセットはTEL配列の挿入を制御領域の転写制御下とするため複数の制限部位を備える。
示したように、DNA構築物にはTELコード配列の発現を増加させるエンハンサーを用いることができる。こうしたエンハンサーとしては、35Sエンハンサー、トランケーテッド35Sエンハンサー、および他の転写アクチベーターが挙げられる。構築物には1つ以上のエンハンサーエレメントを用いることができ、多くの場合少なくとも2つのエレメントが用いられ得る。エンハンサーはTEL配列の発現を駆動するプロモーターに対して5’または3’であり、発現カセットにおけるエレメントと操作可能に連結することができる。
発現カセットは、5’−3’の転写方向で、転写および翻訳開始領域(すなわち、プロモーター)、本発明のDNA配列、ならびに植物において機能的な翻訳および転写終止領域(すなわち、終止領域)を含む。プロモーターはネイティブもしくはアナログ、または植物宿主および/もしくは本発明のDNA配列に対して外来もしくは異種であってもよい。加えて、プロモーターは天然配列またはあるいは合成配列であってもよい。プロモーターが植物宿主に対して「ネイティブ」または「同種」であるとは、プロモーターが、プロモーターが導入される天然植物に見られることを意味する。プロモーターが本発明のDNA配列に対して「外来」または「異種」であるとは、プロモーターが、操作可能に連結した本発明のDNA配列に対してネイティブまたは天然に発生するプロモーターではないことを意味する。
終止領域は転写開始領域にネイティブであってもよく、操作可能に連結した目的のDNA配列にネイティブであってもよく、植物宿主にネイティブであってもよく、または別の供給源由来(すなわち、プロモーター、目的のDNA配列、植物宿主、またはこれらのいずれかの組み合わせに対して外来または異種)であってもよい。TEL発現カセットに用いられるターミネーターはTELのネイティブターミネーターとすることができるが、他のターミネーターとすることもできる。よく用いられるターミネーターとしては、CaMVの35Sターミネーターが挙げられる。他のターミネーターとしては、Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141−144; Proudfoot(1991)Cell 64:671−674;Sanfacon et al.(1991)Genes Dev 5:141−149;Mogen et al.(1990)Plant Cell 2:1261−1272;Munroe et al.(1990)Gene 91:151−158;Ballas et al.(1989)Nucleic.Acids.Res.17:7891−7903;およびJoshi et al.(1987)Nucleic.Acids.Res.15:9627−9640において開示されるものが挙げられる。オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終止領域のような便利な終止領域はA.ツメファシエンスのTiプラスミドから入手可能である。
適切な場合、遺伝子は形質転換宿主細胞における発現の増加のため最適化することができる。すなわち、遺伝子は発現増大のための特定の植物特異的コドンを用いて合成することができる。当技術分野では植物特異的遺伝子の合成方法が利用可能である。例えば、本明細書に参照により組み入れられる、米国特許第5,380,831号および第5,436,391号、ならびにMurray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:477−498を参照されたい。発現を増大させるため、導入遺伝子として用いるTEL遺伝子を修飾することができる。例えば、コドン使用を最適化することができ、イントロンを削除することができ、未成熟なポリAシグナルを除去することができる。
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入するステップを含む。「導入する」とは、ヌクレオチド構築物を植物に、構築物が植物の細胞の内部へのアクセスを得るような方法でもたらすことを指す。本発明の方法は、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも1つの細胞の内部へのアクセスを得ることのみを必要とし、ヌクレオチド構築物を植物に導入するための特定の方法が用いられることを必要としない。これらに限定されないが、安定形質転換方法、一過性形質転換方法、およびウイルス媒介方法を含む植物へのヌクレオチド構築物の導入方法が当技術分野において知られている。
「植物」とは、全植物、植物器官(例えば、葉、幹、根、等)、種子、植物細胞、珠芽、胚およびその子孫を指す。植物細胞は分化または未分化(例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞、花粉)であり得る。
「形質転換植物」または「安定に形質転換された」植物、細胞もしくは組織とは、植物細胞に外因性核酸配列またはDNAフラグメントを導入または挿入した植物を指す。これらの核酸配列としては、外因性であり、または未形質転換植物細胞中に存在しないもの、および内因性であり、または未形質転換植物細胞中に存在し得るものが挙げられる。「異種」とは一般的には、細胞に内因性またはそれらが存在する天然ゲノムの一部ではなく、インフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクション、等により細胞に付加された核酸配列を指す。
植物細胞の形質転換は、当技術分野において知られるいくつかの技術の1つにより達成することができる。本発明のTEL遺伝子を修飾し、植物細胞において発現を得る、または増大させることができる。一般的には、こうしたタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を駆動するプロモーター、ならびに転写終止およびポリアデニレーションを可能にする3’非翻訳領域を含有する。
一般的には、この「植物発現カセット」は「植物形質転換ベクター」に挿入される。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するのに必要な1つ以上のDNAベクターで構成することができる。例えば、バイナリーベクターおよびヘルパープラスミドを有するベクターは、効率的な形質転換を達成するのに必要なDNAセグメントがかなり大きく複雑であり、別のDNA上に機能を分けることが有利なアグロバクテリウム媒介形質転換にもっともよく用いられる。バイナリーベクターは一般的には、T−DNA導入に必要なシス作用性配列(例えば左境界および右境界)、植物細胞における発現が可能となるよう構成される選択性マーカー、および「目的の遺伝子」(形質転換植物の作製が望まれる植物細胞における発現が可能となるよう構成される遺伝子)を有するプラスミドベクターを含む。このプラスミドベクター上には細菌複製に必要な配列も存在する。シス作用性配列は、植物細胞への効率的な導入およびそこでの発現を可能にするよう配置される。例えば、選択性マーカー遺伝子およびTEL遺伝子は左右境界間に位置することができる。多くの場合、第2プラスミドベクターはアグロバクテリウムから植物細胞へのT−DNA導入を媒介するトランス作用性因子を含有する。このプラスミドは、当技術分野において理解されるように、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染、境界配列での開裂によるDNAの導入およびvir媒介DNA導入を可能にする毒性機能(vir遺伝子)を有することが多い(Hellens and Mullineaux (2000)Trends in Plant Science 5:446−451)。植物形質転換にはいくつかのタイプのアグロバクテリウム株(例えば、LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105、等)を用いることができる。第2プラスミドベクターはマイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、等のような他の方法により植物を形質転換するには必要ない。
一般的には、植物形質転換方法は、異種DNAを標的植物細胞(例えば、未成熟または成熟胚、懸濁培養物、非分化カルス、プロトプラスト、等)に導入するステップ、およびその後(選択性マーカー遺伝子に従って)適切な選択を行い、未形質転換細胞集団の群から形質転換植物細胞を回収するステップを含む。外植片は一般的には新たに供給される同じ培地に移し、定期的に培養する。その後、形質転換細胞は最大閾値レベルの選択剤を補充した再生培地に入れ、シュートに分化する。シュートは次に発根したシュートまたは小植物を回収するため選択的発根培地に移す。形質転換小植物はその後成熟植物に成長し、稔性種子を生産する(例えば、Hiei et al.(1994)The Plant Journal 6:271−282;Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology 14:745−750)。外植片は一般的には新たに供給される同じ培地に移し、定期的に培養する。形質転換植物を作製するための技術および方法についての一般的な説明は、Ayres and Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13:219−239およびBommineni and Jauhar(1997)Maydica 42:107−120において見られる。形質転換物質は多くの細胞を含有するため、対象標的カルスのいずれの片、組織、または細胞集団にも形質転換および非形質転換細胞の両方が存在する。非形質転換細胞を殺滅し、形質転換細胞を増殖させる能力は形質転換植物培養物をもたらす。多くの場合、非形質転換細胞を除去する能力は形質転換植物細胞の急速回収および形質転換植物の作製成功を制限している。
形質転換プロトコルおよびヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的とされる植物または植物細胞のタイプ、すなわち、単子葉植物または双子葉植物に応じて異なり得る。形質転換植物の作製は、これらに限定されないが、マイクロインジェクション(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4:320 334)、エレクトロポレーション(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602 5606)、アグロバクテリウム媒介形質転換(米国特許第5,563,055号および米国特許第5,981,840号)、直接遺伝子導入(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3:2717 2722)、弾道粒子加速(例えば、米国特許第4,945,050号;米国特許第5,879,918号;米国特許第5,886,244号;および米国特許第5,932,782号;Tomes et al.(1995)in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer−Verlag,Berlin);McCabe et al.(1988) Biotechnology 6:923 926参照);およびLec1形質転換(国際公開第WO00/28058号)を含むいくつかの方法の1つにより行うことができる。また、Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421 477;Christou et al.(1988)Plant Physiol.87:671 674;Datta et al.(1990)Biotechnology 8:736 740(イネ);Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305 4309;Klein et al.(1988)Biotechnology 6:559 563を参照されたい。また、米国特許第5,240,855号;第5,322,783号;第4,945,050号;第5,324,646号;米国特許出願公開第20010026941号;第2002015066号;および国際公開第WO91/00915号を参照されたい。
形質転換させた細胞は従来の方法に従って植物中で成長させることができる。例えば、McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5:81−84を参照されたい。これらの植物を次に成長させ、同じ形質転換株または異なる株で受粉させることができ、所望の表現型特性の構造的発現を有する得られたハイブリッドを同定することができる。所望の表現型特性の発現が達成されるように、所望の表現型特性の発現が安定に維持され、受け継がれるように2世代以上栽培した後、種子を収穫することができる。このようにして、本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば、本発明の発現カセットをそれらのゲノム中に安定に組み入れた形質転換種子(別名「トランスジェニック種子」)を提供する。
異種外来DNAを植物細胞に導入後、植物ゲノムにおける異種遺伝子の形質転換または挿入は、挿入遺伝子に関連する核酸およびタンパク質の分析のようなさまざまな方法により確認される。分子技術としては、PCR(Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)、ゲノムDNAのサザンブロット分析、ノーザンブロット分析およびウエスタンブロット(Sambrook and Russell,2001,同上)が挙げられる。
クロラムフェニコール耐性、アミノグリコシドG418、ヒグロマイシン、等のような、植物細胞に用いられる多数の選択性マーカーが開発された。クロロプラスト代謝に関与する産物をエンコードする他の遺伝子を選択性マーカーとして用いてもよい。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、またはイミダゾリノンのような除草剤に対する耐性をもたらす遺伝子は特定の用途を有し得る。こうした遺伝子は報告されている(Stalker et al.(1985)J.Biol.Chem.263:6310−6314(ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子);およびSathasivan et al.(1990) Nucl.Acids Res.18:2188(AHASイミダゾリノン耐性遺伝子)。植物、植物器官(例えば、葉、幹、根、等)、種子、植物細胞、珠芽、胚またはその子孫における導入遺伝子の存在を検出するための方法は当技術分野において周知である。
TELタンパク質を発現する稔性植物をTEL活性について試験し、最適な活性を示す植物をさらなる育種のために選択することができる。コード配列の発現の増大についてアッセイする方法が当技術分野において利用可能である。このようにして、植物をスクリーニングし、TEL配列の発現のレベルに基づき選択することができる。さらに、形質転換種子を栽培し、好ましい表現型に基づき選択することができる。
論じたように、植物におけるTEL配列の発現を増大させるためのいずれの方法も本発明に含まれる。作物収量を向上させる別の方法は、他の植物遺伝子工学技術により作物における内因性TEL遺伝子またはコード配列の発現を増大させることである。すなわち、発現カセットを用いて第2TELコード配列を導入する代わりに、目的の植物における内因性TEL遺伝子の発現を増加させることができる。この方法では、エンハンサー(例えばCaMVの35Sエンハンサー)を植物における内因性TEL遺伝子の近くに挿入し、内因性配列の発現を増加させることができる。35Sエンハンサーは、遺伝子の上流または下流の領域に挿入された場合、目的の遺伝子から20kb、30kb、またはそれより離れて挿入された場合であっても、遺伝子発現を増大させることができることが見出されている(Jeong et al.2006,Plant J.45:123−132)。よって、エンハンサーはTEL遺伝子のすぐ上流および/または下流のTEL配列の領域に挿入することができる。他の実施形態では、エンハンサーはTEL遺伝子のゲノム上流および/または下流の領域にTEL遺伝子の約1kb、約5kb、約10kb、約15kb、約20kb、約30kb以内で、またはこれより離れて挿入することができる。当業者であれば、いずれの場合にエンハンサーがTEL配列から離れすぎ、増大効果を有さないかを判断することができる。1つの例では、少なくとも1つの35Sエンハンサーを含有するT−DNAはTEL遺伝子の約5kb下流に挿入され、TEL配列の発現を顕著に増大させ、結果として収量を実質的に増加させた。
ゲノム中へのヌクレオチド分子の部位特異的標的化の方法は知られ、TALENに基づく挿入(Li et al.(2012)Nature Biotech 30:390−392、Cermak et al.(2011)Nucleic Acids Res Epub 14 April 2011;doi:10.1093/nar/gkr218、Bogdanove and Voytas(2011)Science 333:1843−1846、Miller et al.(2011)Nature Biotech 29:143−150、Scholze and Boch(2011)Curr Opinion in Microbiol 1447−53);Cre−lox部位特異的組換え(Dale et al.(1995)Plant J 7:649−659、Lyznik et al.(2007)Transgenic Plant J 1:1−9);FLP−FRT組換え(Li et al.(2009)Plant Physiol 151:1087−1095);Bxb1媒介挿入(Yau et al. Plant J(2011)701:147−166);ジンクフィンガー媒介挿入(Wright et al.(2005)Plant J 44:693−705、Cai et al.(2009)Plant Mol Biol 69:699−709);同種組換え(Lieberman−Lazarovich and Levy(2011)Methods Mol Biol 701:51−65、Puchta,H.(2002)Plant Mol Biol 48:173−182);等を含む。これらの参照文献のすべては本明細書に参照により組み入れられる。
TALEN技術は遺伝子工学における配列特異的標的化のために開発された。TAL(転写アクチベーター様)エフェクターは、予測可能な特異性を有する新規クラスのDNA結合タンパク質を構成する。植物細胞内では、TALは核に局在化し、標的プロモーターに結合し、植物遺伝子の発現を誘発する。TALのDNA結合特異性はタンデムリピートの中央ドメインにより決定される。Scholze and Boch 同上。TALEN技術を用い、エンハンサー配列をTEL遺伝子の近くに特異的に挿入することができる。従って、TALEN技術を用い、少なくとも1つのエンハンサーエレメントをTEL遺伝子の下流または上流のゲノム中の所望の場所に挿入することができる。例えば、TAL技術を用い、CaMVの35SエンハンサーをイネTEL遺伝子の下流の5kb以内に挿入することができる。
TEL発現はデノボ設計転写アクチベーター様エフェクター(TALE)を用いることにより増大させることもできる。キサントモナス(Xanthomonas)からのTALEは、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する調節タンパク質である(Boch and Bonas(2010)Annu Rev Phytopathol 48:419−436)。TALEのDNA結合ドメインは、それらが特定のDNA配列に結合するようにデノボ設計することができる。こうしたデノボ設計TALEを用い、その特定の配列の下流遺伝子を活性化することができる。この遺伝子発現増大方法は、植物において成功裏に実施された(Morbitzer et al.(2010),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:21617−21622)。イネ、トウモロコシ、コムギ、およびダイズのTEL遺伝子のプロモーター領域はすべて知られており、本明細書において提供される。TALEは、転写開始部位の近くの上流の部位に特異的に結合するように修飾することができる。これらの植物におけるこうしたデノボ設計TALEの形質転換は、それらのTEL遺伝子の発現を増大させ、ひいては作物収量を増大させるだろう。このようにして、TALE媒介挿入はいずれかの目的の植物におけるTEL遺伝子について設計することができる。TEL遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列を用い、コード配列から上流または下流のDNA領域を配列することができる。こうした配列を用い、TALE技術を用いる挿入のためにエンハンサーを標的化することができる。
配列特異的挿入技術はジンクフィンガータンパク質を用いて開発された(Urnov et al.(2010)Nat.Rev.Genet.11:636−646;Davis & Stokoe(2010)BMC Med.8:42;Camenisch et al.(2008)Mini Rev.Med.Chem.8:669−676)。従って、ジンクフィンガー法を転写エンハンサーの配列特異的挿入に用い、植物におけるTEL遺伝子の発現およびよって収量を増大させることができる。
本発明の方法は、これらに限定されないが、単子葉植物および双子葉植物を含むいずれの植物種に用いてもよい。目的の植物の例としては、これらに限定されないが、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、トウガラシ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、アブラナ属、ムラサキウマゴヤシ、ライムギ、キビ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観葉植物、および針葉樹が挙げられる。
野菜としては、これらに限定されないが、トマト、レタス、サヤインゲン、アオイマメ、エンドウマメ、キュウリ属のメンバー、例えばキュウリ、カンタループ、およびマスクメロンが挙げられる。観葉植物としては、これらに限定されないが、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクが挙げられる。好適には、本発明の植物は作物植物(例えば、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、トウガラシ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、ススキ、スイッチグラス、ジャトロファ、等)および針葉樹である。
植物収量の増加方法を提供する。本方法は植物におけるTELコード配列の発現を増加または増大させ、植物成長、活力、および収量の増加をもたらすステップを含む。本明細書において定義されるように、植物の「収量」とは、植物により生産されるバイオマスおよび/または種子の質および/または量を指す。「バイオマス」とはいずれかの測定された植物産物である。バイオマス生産の増加は測定された植物産物の収量のいずれかの向上である。収量の増加は、TEL配列を発現しない植物と比較して、これらに限定されないが、収量の少なくとも1%の増加、少なくとも3%の増加、少なくとも5%の増加、少なくとも10%の増加、少なくとも15%の増加、少なくとも18%の増加、少なくとも20%の増加、少なくとも30%の増加、少なくとも50%の増加、少なくとも70%の増加、少なくとも100%の増加またはこれより大きな増加を含む、いずれかの統計的に有意な増加を含むことができる。目的の植物における種子生産は、対照植物と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも100%、またはこれより大きく増加させることができる。
以下の実施例は限定としてではなく例示として提供する。
(実施例1)収量増大遺伝子としてのイネTEL遺伝子の同定
(1)高収量を有するイネのT−DNA挿入変異体の分子特性解析
形質転換イネ株、HSA−20は、予想外だが大いに望ましい、高収量という農業形質を有すると同定した。非形質転換親株「WYG−7」の植物と比較して、HSA−20株のもっとも驚くべき表現型はそれらの劇的に増大した種子である。形質転換に用いた親株の千粒重は26.1gだったが、HSA−20株の千粒重は36.5gであり、39.8%高かった。HSA−20種子は対照植物の種子より約20%長く、7%幅広だった。HSA−20植物は丈も顕著に高く、稈径も顕著に大きかった。HSA−20成熟植物の平均草丈は、非形質転換植物の97cmに対して107cmだった。主穂当たりの種子数はHSA−20と対照植物との間で統計的に同じだった。主穂の平均重量は非形質転換親株の3.6gに対して4.8gである。HSA−20と非形質転換対照との間で出穂期には有意な差はなかった。
(1)高収量を有するイネのT−DNA挿入変異体の分子特性解析
形質転換イネ株、HSA−20は、予想外だが大いに望ましい、高収量という農業形質を有すると同定した。非形質転換親株「WYG−7」の植物と比較して、HSA−20株のもっとも驚くべき表現型はそれらの劇的に増大した種子である。形質転換に用いた親株の千粒重は26.1gだったが、HSA−20株の千粒重は36.5gであり、39.8%高かった。HSA−20種子は対照植物の種子より約20%長く、7%幅広だった。HSA−20植物は丈も顕著に高く、稈径も顕著に大きかった。HSA−20成熟植物の平均草丈は、非形質転換植物の97cmに対して107cmだった。主穂当たりの種子数はHSA−20と対照植物との間で統計的に同じだった。主穂の平均重量は非形質転換親株の3.6gに対して4.8gである。HSA−20と非形質転換対照との間で出穂期には有意な差はなかった。
HSA−20のT−DNA挿入のサザンブロット分析は、これがシングルコピーのみのT−DNA挿入による形質転換イベントであることを示した。PCR検出による200株のHSA−20の隔離されたT1集団の試験は、種子増大の表現型を有する植物の100%がT−DNA挿入に陽性であり、普通の大きさの種子を有する植物がすべてPCR陰性であることを示し、T−DNAの挿入が高収量の表現型の理由であることを示した。
(2)T−DNA挿入部位の特性解析
HSA−20におけるT−DNA挿入部位の特性を解析するため、イネゲノム中のT−DNAの境界配列をTAIL−PCR法により決定した(Liu and Chen,2007,BioTechniques 43:649−656)。T−DNAが染色体1の長腕に挿入され、両側のその境界配列はそれぞれSEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51であることが見出された。
HSA−20におけるT−DNA挿入部位の特性を解析するため、イネゲノム中のT−DNAの境界配列をTAIL−PCR法により決定した(Liu and Chen,2007,BioTechniques 43:649−656)。T−DNAが染色体1の長腕に挿入され、両側のその境界配列はそれぞれSEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51であることが見出された。
この挿入はいずれの既知のまたは理論上の遺伝子内にあるとも考えられなかった。これはterminal ear1様遺伝子(OsTEL)とRabGAP/TBCドメインタンパク質をエンコードする推定遺伝子との間の領域に挿入された。挿入はOsTEL遺伝子の約4.5kb下流およびRabGAP/TBCドメインをエンコードする推定遺伝子の5.4kb上流である(図3)。
(3)HSA−20植物におけるOsTEL遺伝子の発現増大
OsTELおよびRabGAP/TBCドメインをエンコードする推定遺伝子のmRNAレベルを、RT−PCR分析を用い、1か月の幼苗のHSA−20株と非形質転換親株との間で比較した。OsTELmRNAは非形質転換対照植物よりHSA−20植物において顕著に高いが、RabGAP/TBCドメインタンパク質をエンコードする推定遺伝子のmRNAはほぼ同じであることが見出された。HSA−20植物におけるOsTELの発現増大は、OsTEL遺伝子から4.9kb下流に挿入されたT−DNA内のCaMV35Sエンハンサーのためであると考えられた。
OsTELおよびRabGAP/TBCドメインをエンコードする推定遺伝子のmRNAレベルを、RT−PCR分析を用い、1か月の幼苗のHSA−20株と非形質転換親株との間で比較した。OsTELmRNAは非形質転換対照植物よりHSA−20植物において顕著に高いが、RabGAP/TBCドメインタンパク質をエンコードする推定遺伝子のmRNAはほぼ同じであることが見出された。HSA−20植物におけるOsTELの発現増大は、OsTEL遺伝子から4.9kb下流に挿入されたT−DNA内のCaMV35Sエンハンサーのためであると考えられた。
(実施例2)イネ形質転換のためのOsTEL発現ベクターの構築
形質転換ベクターpCambia1300−35S−G10はpCambia1300の修飾形態である。具体的には、ハイグロマイシン耐性遺伝子htpIIをXhoI酵素によりpCambia1300から消化した後、グリホサート耐性遺伝子G10evo(EPSPシンターゼ)の発現カセットで置換した。G10evo発現カセットはトウモロコシユビキチンプロモーター、pUbi、グリホサート耐性遺伝子G10evo(EPSPS)およびその下流ターミネーターで構成される。ベクターpCambia1300−35S−G10およびEPSPSのポリヌクレオチド配列はそれぞれSEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48として示される。ベクターpCambia1300−35S−G10中のプロモーターp35Sは、イネOsTEL遺伝子の発現を増大させるエンハンサーを提供する。
形質転換ベクターpCambia1300−35S−G10はpCambia1300の修飾形態である。具体的には、ハイグロマイシン耐性遺伝子htpIIをXhoI酵素によりpCambia1300から消化した後、グリホサート耐性遺伝子G10evo(EPSPシンターゼ)の発現カセットで置換した。G10evo発現カセットはトウモロコシユビキチンプロモーター、pUbi、グリホサート耐性遺伝子G10evo(EPSPS)およびその下流ターミネーターで構成される。ベクターpCambia1300−35S−G10およびEPSPSのポリヌクレオチド配列はそれぞれSEQ ID NO:47およびSEQ ID NO:48として示される。ベクターpCambia1300−35S−G10中のプロモーターp35Sは、イネOsTEL遺伝子の発現を増大させるエンハンサーを提供する。
OsTELの全長遺伝子は、推定プロモーター領域、コード配列および推定ターミネーターで構成される(SEQ ID NO:1に示される)。これはPCR増幅により得られた。1.8kbの推定プロモーターおよびコード領域は、約4.0kbのターミネーターを含め、PCRによりイネ(ジャポニカ種)から単離されたゲノムDNAから別々に得られた。
PCRに用いたプライマーを表1に挙げる。
PCRに用いたプライマーを表1に挙げる。
プロモーター内のBamHI部位を削除するため、プロモーターの2つのフラグメントを、それぞれプライマーpOsTEL−F/pOsTEL−MRおよびpOsTEL−R/pOsTEL−MFにより増幅させた。これらの2つのフラグメントを次に、プライマーpOsTEL−FおよびpOsTEL−Rを用い、OsTELの全長プロモーターを得るため、次回のPCRのテンプレートとして組み合わせた。HindIIIおよびBamHI部位をそれぞれその5’および3’端に導入した。1.8kb長のこのプロモーター領域DNAをP−Easyベクター(Transgene Inc.、北京)にクローニングし、配列により確認し、pOsTELと名付けた。
コード配列および推定ターミネーターを含むフラグメントを、プライマーOsTELcod−FおよびOsTELter−Rを用いるPCRにより得た。BamHIおよびKpnI部位をそれぞれその5’および3’端に導入した。4.0kbのPCR産物をP−Easyベクター(Transgene Inc.、北京)にクローニングし、配列により確認し、OsTEL−TERと名付けた。
タカラ(宝生物工程有限公司、中国大連)からの高忠実度DNAポリメラーゼPrimer starおよびそのコンパニオン試薬を用いてPCRを行った。PCR反応条件および手順は以下のとおりである:
天然OsTEL遺伝子および35Sエンハンサーを含むT−DNAを有するベクターの構築:
T−Easyベクターにおいてクローニングした2つのPCR産物を、二重酵素消化、それぞれHindIII/BamHIおよびBamHI/KpnIによりベクターから消化した。2つの得られたフラグメントを、そのHindIIIおよびKpnI部位の間で、同時にpCambia1300−35S−G10にクローニングし、ベクターpCambia1300−35S−G10−OsTEL(図4Aに示す)を作製し、これはOsTEL遺伝子の下流に35Sプロモーター(p35S)を有する。クローンイネOsTEL遺伝子の全長ポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO:1に示す。
T−Easyベクターにおいてクローニングした2つのPCR産物を、二重酵素消化、それぞれHindIII/BamHIおよびBamHI/KpnIによりベクターから消化した。2つの得られたフラグメントを、そのHindIIIおよびKpnI部位の間で、同時にpCambia1300−35S−G10にクローニングし、ベクターpCambia1300−35S−G10−OsTEL(図4Aに示す)を作製し、これはOsTEL遺伝子の下流に35Sプロモーター(p35S)を有する。クローンイネOsTEL遺伝子の全長ポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO:1に示す。
天然OsTEL遺伝子を含むが35Sエンハンサーを含まないT−DNAを有するベクターの構築:
35SプロモーターおよびhptII遺伝子の両方を、EcoR1およびXhoIでの消化によりプラスミドpCambia1300から除去した。次に、適切な端のEcoRIおよびXhoIの消化部位で固定された、グリホサート耐性発現カセットpUbi−EPSPSを上述したように消化したpCambia1300DNAにライゲーションした。得られたベクターpCambia1300−G10(配列はSEQ ID NO:49として示される)は、ベクターpCambia1300−35S−G10(実施例2の第1段落に記載)と比較して、p35Sプロモーターを含まない。pCambia1300−G10をHindIIIおよびKpnIで消化した後、pCambia1300−35S−G10−OsTELを同様にHindIIIおよびKpnIで消化することにより得られたOsTEL遺伝子のフラグメントにライゲーションした。得られたベクターはpCambia1300−G10−OsTELである。このベクターのT−DNA構造は図4Bに示す。
35SプロモーターおよびhptII遺伝子の両方を、EcoR1およびXhoIでの消化によりプラスミドpCambia1300から除去した。次に、適切な端のEcoRIおよびXhoIの消化部位で固定された、グリホサート耐性発現カセットpUbi−EPSPSを上述したように消化したpCambia1300DNAにライゲーションした。得られたベクターpCambia1300−G10(配列はSEQ ID NO:49として示される)は、ベクターpCambia1300−35S−G10(実施例2の第1段落に記載)と比較して、p35Sプロモーターを含まない。pCambia1300−G10をHindIIIおよびKpnIで消化した後、pCambia1300−35S−G10−OsTELを同様にHindIIIおよびKpnIで消化することにより得られたOsTEL遺伝子のフラグメントにライゲーションした。得られたベクターはpCambia1300−G10−OsTELである。このベクターのT−DNA構造は図4Bに示す。
OsTELの発現を駆動するp35Sを用いるベクターの構築:
CaMVの35Sプロモーターを、それぞれその5’および3’端にHindIIIおよびBamHI部位を有するようにPCRにより修飾した。このプロモーターをBamHIおよびKpnIで消化したOsTEL−TERフラグメントにライゲーションした。35SプロモーターおよびOsTEL−TERを次にHindIIIおよびKpnIで予め消化したpCambia1300−G10にライゲーションし、形質転換ベクターpCambia1300−G10−p35S−OsTEL(図4C)を作製した。
CaMVの35Sプロモーターを、それぞれその5’および3’端にHindIIIおよびBamHI部位を有するようにPCRにより修飾した。このプロモーターをBamHIおよびKpnIで消化したOsTEL−TERフラグメントにライゲーションした。35SプロモーターおよびOsTEL−TERを次にHindIIIおよびKpnIで予め消化したpCambia1300−G10にライゲーションし、形質転換ベクターpCambia1300−G10−p35S−OsTEL(図4C)を作製した。
トウモロコシZmTELの形質転換ベクター構築物:
そのプロモーターおよびターミネーターを含む、トウモロコシ天然ZmTEL遺伝子をPCR増幅により得た。用いたPCRプライマーの配列を表3に示す。
そのプロモーターおよびターミネーターを含む、トウモロコシ天然ZmTEL遺伝子をPCR増幅により得た。用いたPCRプライマーの配列を表3に示す。
まず、トウモロコシZmTEL遺伝子の3つのDNAフラグメント、ZmTEL−A、ZmTEL−BおよびZmTEL−Cを、それぞれプライマー対、ZmTE−A−FとZmTE−A−R、ZmTE1−B−FとZmTE−B−RおよびZmTE1−C−FとZmTE−C−Rを用いるPCRによりトウモロコシゲノムから増幅させた。次に、ZmTEL−BおよびZmTEL−Cの複合フラグメントを、1回目の複合PCR産物ZmTEL−BおよびZmTEL−Cをテンプレートとして、ZmTE−B−FおよびZmTE−C−Rをプライマーとして用いるPCRにより作製した。この複合フラグメントをHindIIIおよびKpnIにより消化し、HindIIIで消化したフラグメントZmTEL−Aとともに、HindIIIおよびKpnIで予め消化したプラスミドpCambia1300−35S−G10にライゲーションした。ZmTEL−Aがベクターと正しい配向性で連結したクローンを選択し、pCambia1300−35S−G10−ZmTEL(図5)と名付けた。トウモロコシZmTEL遺伝子のポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO:5として示される。
(実施例3)イネ形質転換
アグロバクテリウム媒介方法によるイネ形質転換は当技術分野において周知である。例えば、そのすべてを本明細書に参照により組み入れる、Hiei et al.(1997)Plant Mol Biol 35:205−218;Hiei et al.(1994)Plant J 6:271−282;Nishimura et al.(2007)Nature Protocols 1:2796−2802を参照されたい。
アグロバクテリウム媒介方法によるイネ形質転換は当技術分野において周知である。例えば、そのすべてを本明細書に参照により組み入れる、Hiei et al.(1997)Plant Mol Biol 35:205−218;Hiei et al.(1994)Plant J 6:271−282;Nishimura et al.(2007)Nature Protocols 1:2796−2802を参照されたい。
実施例2に記載したように構築された4つのベクターを、アグロバクテリウム媒介形質転換方法(Lu & Gong(1998)Chinese Bulletin of Life Sciences 10:125−131 and Liu et al.(2003)Molecular Plant Breeding 1:108−115)を用いて「Xiushui134」に形質転換した。手順はグリホサート耐性遺伝子を選択マーカーとして含めるよう少し変更した。「Xiushui134」の成熟種子から誘導したカルスをレシピエントとして用いた。それぞれpCambia1300−35S−G10−OsTEL、pCambia1300−G10−OsTEL、pCambia1300−G10−p35S−OsTELおよびpCambia1300−35S−G10−ZmTEL1のバイナリーベクターを含有するEHA4404の単クローンを、カルスを感染させるため別々に培養した。用意したカルスを100μMのアセトシリンゴンを含有する細菌細胞懸濁液(OD595で0.4)に浸漬し、30分間(ときどき振盪しながら)共培養した。次に、カルスを共培養培地に移し、暗室で2〜3日間28℃でインキュベートした。共培養後、カルスを無菌水ですすぎ、次に適切な濃度のハイグロマイシンを有する選択的培地において2か月間28℃で暗培養した(中期に入ったら連続的に培養した)。選択後、勢いよく成長する形質転換カルスを予備分化培地に移し、約10日間インキュベートした。次に、予備分化したカルスを分化培地に移し、分化および発芽のため30℃、16時間の光周期でインキュベートした。2〜3週間後、耐性のある再生中の小植物を、生育、活性化および発根のため0.1mg/Lのグリホサートを含有する発根培地に移した。よく成長した再生小植物を洗浄し、寒天を除去し、同定のため温室において水中に移植した。このパートに記載した培地の特定の成分は付録1に示す。
(実施例4)収量増大についての形質転換イネの分析
T−DNAベクターpCambia1300−35S−G10−OsTEL、pCambia1300−G10−OsTEL、pCambia1300−G10−p35S−OsTEL、およびpCambia1300−35S−G10−ZmTELを、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いる形質転換イネXS134(ジャポニカ種)に用いた。各構築物について少なくとも100個の独立した形質転換イベントが得られた。各構築物について次の表現型の1つ以上を示すイベントがあった:高い草丈、大きい種子、少ない分げつ数、および大きい稈径。多くのイベントが種子を生産し、その平均重量は対照植物からの種子の平均重量より30%、40%、50%、および60%大きかった。表4は異なる構築物に見られた表現型をまとめる。
T−DNAベクターpCambia1300−35S−G10−OsTEL、pCambia1300−G10−OsTEL、pCambia1300−G10−p35S−OsTEL、およびpCambia1300−35S−G10−ZmTELを、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いる形質転換イネXS134(ジャポニカ種)に用いた。各構築物について少なくとも100個の独立した形質転換イベントが得られた。各構築物について次の表現型の1つ以上を示すイベントがあった:高い草丈、大きい種子、少ない分げつ数、および大きい稈径。多くのイベントが種子を生産し、その平均重量は対照植物からの種子の平均重量より30%、40%、50%、および60%大きかった。表4は異なる構築物に見られた表現型をまとめる。
結果は、その発現が各種プロモーターの制御下にある場合、OsTELが収量を増大させることができることを示した。天然プロモーターおよび構成的プロモーターの両方が作用した。さらに、OsTELまたはZmTEL遺伝子の下流のCaMV35Sエンハンサーは形質転換イベントにおける表現型の頻度を増加させる。また、イネにおけるトウモロコシからの異種TEL遺伝子の発現は、イネからの内因性プロモーターと同様にイネ収量を増大させることができる。
pCambia1300−35S−G10−OsTELで形質転換したイベントOsX−2は、同じ播種条件および播種密度下で非形質転換対照植物と比較して18.6%の収量増加を示した。
(実施例5)トウモロコシ形質転換および形質転換トウモロコシの分析
1)トウモロコシ形質転換
アグロバクテリウム媒介方法によるトウモロコシ形質転換はよく構築されている(Frame et al.2002,Plant Physiol.129:13−22)。この実験では選択剤としてグリホサートを用いた。簡潔に、それぞれT−DNA構築物pCambia1300−35S−G10−ZmTELおよびpCambia1300−35S−G10−OsTELを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株を調製し、トウモロコシ胚を受粉の8〜10日後に形質転換した(長さ1.0〜1.5mm)。胚を2〜3日間22℃でアグロバクテリウムとインキュベートした後、200mg/Lのチメンチンを含有するカルス誘導培地へ移した。10〜14日間28℃での暗培養後、2mMのグリホサートを含有する選択培地へカルスを移し、2〜3週間28℃で培養を続けた。新しくしたグリホサート選択培地でさらに2〜3週間培養後、生き残ったカルスを再生培地へ移し、10〜14日間培養した後、新鮮な再生培地へ移し、さらに10日〜14日間培養した。発生したシュートを、次は0.1mMのグリホサートを含有する発根培地へ移した。生き残った小植物を生育および種子生産のため温室へ移した。
1)トウモロコシ形質転換
アグロバクテリウム媒介方法によるトウモロコシ形質転換はよく構築されている(Frame et al.2002,Plant Physiol.129:13−22)。この実験では選択剤としてグリホサートを用いた。簡潔に、それぞれT−DNA構築物pCambia1300−35S−G10−ZmTELおよびpCambia1300−35S−G10−OsTELを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株を調製し、トウモロコシ胚を受粉の8〜10日後に形質転換した(長さ1.0〜1.5mm)。胚を2〜3日間22℃でアグロバクテリウムとインキュベートした後、200mg/Lのチメンチンを含有するカルス誘導培地へ移した。10〜14日間28℃での暗培養後、2mMのグリホサートを含有する選択培地へカルスを移し、2〜3週間28℃で培養を続けた。新しくしたグリホサート選択培地でさらに2〜3週間培養後、生き残ったカルスを再生培地へ移し、10〜14日間培養した後、新鮮な再生培地へ移し、さらに10日〜14日間培養した。発生したシュートを、次は0.1mMのグリホサートを含有する発根培地へ移した。生き残った小植物を生育および種子生産のため温室へ移した。
2)形質転換トウモロコシの分析
pCambia1300−35S−G10−ZmTELおよびpCambia1300−35S−G10−OsTELのそれぞれについて約120個のイベントが得られた。両構築物からの約80個のイベントは次の表現型の1つ以上を示した:早く力強い成長;高い草丈;大きな穂;および大きな粒(図12)。
pCambia1300−35S−G10−ZmTELおよびpCambia1300−35S−G10−OsTELのそれぞれについて約120個のイベントが得られた。両構築物からの約80個のイベントは次の表現型の1つ以上を示した:早く力強い成長;高い草丈;大きな穂;および大きな粒(図12)。
pCambia1300−35S−G10−ZmTELで形質転換されたイベントTE13およびTE31は、対照トウモロコシ植物より25.5%および21.9%大きな、穂当たりの重量を示した。ZmTEL遺伝子発現のリアルタイムPCR分析は、ZmTELの発現がTE13およびTE31の両方において顕著に増大したことを示した。TE13およびTE31両方におけるZmTELのmRNAの量は、開花期に対照植物の葉に見られるレベルの約40倍だった。
(実施例6)異なる植物種からのTEL遺伝子のクローニングおよびベクター構築
異なる植物の遺伝子のデータベースを検索して見つけたTELと相同な遺伝子の分析に基づき、TEL遺伝子ホモログのクローニングのためのPCRプライマーを設計した(表5に示される)。テンプレートおよび適切なプライマーとして異なる植物のゲノムを用い、プロモーター領域、コード配列、およびターミネーターを含む全長TEL遺伝子を、さま各種植物からのPCRによって別々に増幅させた。植物ゲノム抽出の技術は前に説明されている(Allen GC et al.2006,Nat.Protoc.1:2320−2325)。PCR反応は、本質的には実施例1に記載したような、標準的な手順に従って行った。
異なる植物の遺伝子のデータベースを検索して見つけたTELと相同な遺伝子の分析に基づき、TEL遺伝子ホモログのクローニングのためのPCRプライマーを設計した(表5に示される)。テンプレートおよび適切なプライマーとして異なる植物のゲノムを用い、プロモーター領域、コード配列、およびターミネーターを含む全長TEL遺伝子を、さま各種植物からのPCRによって別々に増幅させた。植物ゲノム抽出の技術は前に説明されている(Allen GC et al.2006,Nat.Protoc.1:2320−2325)。PCR反応は、本質的には実施例1に記載したような、標準的な手順に従って行った。
ワタからのTEL相同遺伝子のクローニング:
配列アラインメントによってオンラインで公開されているゴシピウム・レモンディ(Gossypium raimondii)のゲノムからTELの2つの相同遺伝子を見出した。2対のプライマーGhTEL1−F/GhTEL1−RおよびGhTEL2−F/GhTEL2−R(表5参照)を、これらの2つ遺伝子の配列に基づき設計した。地方産のワタ種ゴシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)のゲノムDNAをテンプレートとして用い、それぞれプライマー対GhTEL1−F/GhTEL1−RおよびGhTEL2−F/GhTEL2−RでのPCRによってGhTEL1およびGhTEL2の2つのTEL DNAフラグメントを増幅させた。プロモーター、コード領域、およびターミネーターを含む得られたDNAフラグメントをそれぞれpGhTEL1−GhTEL1−terおよびpGhTEL2−GhTEL2−terとした(配列はSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:19に示される)。
配列アラインメントによってオンラインで公開されているゴシピウム・レモンディ(Gossypium raimondii)のゲノムからTELの2つの相同遺伝子を見出した。2対のプライマーGhTEL1−F/GhTEL1−RおよびGhTEL2−F/GhTEL2−R(表5参照)を、これらの2つ遺伝子の配列に基づき設計した。地方産のワタ種ゴシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)のゲノムDNAをテンプレートとして用い、それぞれプライマー対GhTEL1−F/GhTEL1−RおよびGhTEL2−F/GhTEL2−RでのPCRによってGhTEL1およびGhTEL2の2つのTEL DNAフラグメントを増幅させた。プロモーター、コード領域、およびターミネーターを含む得られたDNAフラグメントをそれぞれpGhTEL1−GhTEL1−terおよびpGhTEL2−GhTEL2−terとした(配列はSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:19に示される)。
pGhTEL1−GhTEL1−terの端をPCRによってPstIおよびKpnI部位に別々に固定した。同様にHindIIIおよびKpnI部位をpGhTEL2−GhTEL2−terの端に付加した。pGhTEL1−GhTEL1−terフラグメントをPstIおよびKpnIの二重酵素消化により切断した後、そのPstIおよびKpnIの間でプラスミドpCambia1300−35S−G10にクローニングし、新たなプラスミドpCambia1300−35S−G10−GhTEL1を作製し、そのT−DNA構造は図6(A)に示した。同様に、HindIIIおよびKpnIを用い、pGhTEL2−GhTEL2−terフラグメントを二重消化した後、pCambia1300−35S−G10のHindIIIおよびKpnI部位にクローニングし、ベクターpCambia1300−35S−G10−GhTEL2を作製し、そのT−DNA構造は図6(B)に示した。
シロイヌナズナからのTEL遺伝子のクローニング:
配列アラインメントによってTELの2つの相同遺伝子をシロイヌナズナのゲノム(オンライン公開)から見出した。2対のプライマーAtTEL1−FとAtTEL1−RおよびAtTEL2−FとAtTEL2−R(表5参照)をこの2つの遺伝子の配列に基づき設計した。シロイヌナズナのゲノムDNAをテンプレートとして用いた。AtTEL1およびAtTEL2の2つのTEL−1様遺伝子を、それぞれAtTEL1−FとAtTEL1−RおよびAtTEL2−FとAtTEL2−Rのプライマー対でのPCRによって増幅させた。プロモーター、コード領域、およびターミネーターを含む得られたDNAフラグメントをそれぞれpAtTEL1−AtTEL1−terおよびpAtTEL2−AtTEL2−terとし、その配列をSEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:23に示した。
配列アラインメントによってTELの2つの相同遺伝子をシロイヌナズナのゲノム(オンライン公開)から見出した。2対のプライマーAtTEL1−FとAtTEL1−RおよびAtTEL2−FとAtTEL2−R(表5参照)をこの2つの遺伝子の配列に基づき設計した。シロイヌナズナのゲノムDNAをテンプレートとして用いた。AtTEL1およびAtTEL2の2つのTEL−1様遺伝子を、それぞれAtTEL1−FとAtTEL1−RおよびAtTEL2−FとAtTEL2−Rのプライマー対でのPCRによって増幅させた。プロモーター、コード領域、およびターミネーターを含む得られたDNAフラグメントをそれぞれpAtTEL1−AtTEL1−terおよびpAtTEL2−AtTEL2−terとし、その配列をSEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:23に示した。
pAtTEL1−AtTEL1−terの両端をPCRによってKpnI部位で固定した。pAtTEL1−AtTEL1−terフラグメントをKpnIにより消化した後、pCambia1300−35S−G10のプラスミドにそのKpnI部位で挿入した。新たなプラスミドpCambia1300−35S−G10−AtTEL1を作製し、そのT−DNA構造は図7(A)に示す。同様にHindIII部位をpAtTEL2−AtTEL2−terの両端に付加した。HindIIIが消化したフラグメントpAtTEL2−AtTEL2−terをプラスミドpCambia1300−35S−G10にそのHindIII部位で挿入した。得られたベクターはpCambia1300−35S−G10−AtTEL2であり、そのT−DNA構造は図7(B)に示した。
ブラッシカからのTEL遺伝子のクローニング:
配列のブラスト検索によって1つのTEL遺伝子をブラッシカ・ラパのゲノムから見出した。BrTEL遺伝子をPCRクローニングのため2つの部分に分け、1つ(BrTEL−A)はプロモーターおよびコード領域の一部を含み、もう1つ(BrTEL−B)はコード領域の残りの部分およびターミネーターを含む。2対のプライマー、BrTEL−F/BrTEL−MRおよびBrTEL−MF/BrTEL−R(表5)をBrTEL遺伝子に基づき設計した。ブラッシカ・ラパのゲノムDNAからBrTEL−AおよびBrTEL−BをそれぞれBrTEL−F/BrTEL−MRおよびBrTEL−MF/BrTEL−Rのプライマー対で別々に増幅させた。
配列のブラスト検索によって1つのTEL遺伝子をブラッシカ・ラパのゲノムから見出した。BrTEL遺伝子をPCRクローニングのため2つの部分に分け、1つ(BrTEL−A)はプロモーターおよびコード領域の一部を含み、もう1つ(BrTEL−B)はコード領域の残りの部分およびターミネーターを含む。2対のプライマー、BrTEL−F/BrTEL−MRおよびBrTEL−MF/BrTEL−R(表5)をBrTEL遺伝子に基づき設計した。ブラッシカ・ラパのゲノムDNAからBrTEL−AおよびBrTEL−BをそれぞれBrTEL−F/BrTEL−MRおよびBrTEL−MF/BrTEL−Rのプライマー対で別々に増幅させた。
PCRにより、BrTEL−Aの端をそれぞれHindIIIおよびBamHI部位で固定した。同時に、BrTEL−Bの端をそれぞれBamHIおよびKpnI部位で固定した。HindIII/BamHI二重消化BrTEL−AおよびBamHI/KpnI二重消化BrTEL−Bを次に、3重ライゲーションでpCambia1300−35S−G10のプラスミドにHindIIIおよびKpnIの間でクローニングした。ベクターpCambia1300−35S−G10−BrTELを構築し、そのT−DNA構造を図8に示した。クローンBrTEL遺伝子の全ヌクレオチド配列をSEQ ID NO:45として示した。
コムギからのTEL遺伝子のクローニング:
コムギにおけるTEL遺伝子の検索およびPCRプライマー設計の方法は上述したものと同じだった。コムギTaTEL遺伝子をPCR増幅のため2つの部分に分け、1つ(TaTEL−A)はプロモーターおよびコード領域の一部を含み、もう1つ(TaTEL−B)はコード領域の残りの部分およびターミネーターを含む。2対のプライマー、TaTEL−F/TaTEL−MRおよびTaTEL−MF/TaTEL−R(表5)を設計し、それぞれTaTEL−F/TaTEL−MRおよびTaTEL−MF/TaTEL−Rのプライマー対でコムギのゲノムからTaTEL−AおよびTaTEL−Bを別々に増幅させた。
コムギにおけるTEL遺伝子の検索およびPCRプライマー設計の方法は上述したものと同じだった。コムギTaTEL遺伝子をPCR増幅のため2つの部分に分け、1つ(TaTEL−A)はプロモーターおよびコード領域の一部を含み、もう1つ(TaTEL−B)はコード領域の残りの部分およびターミネーターを含む。2対のプライマー、TaTEL−F/TaTEL−MRおよびTaTEL−MF/TaTEL−R(表5)を設計し、それぞれTaTEL−F/TaTEL−MRおよびTaTEL−MF/TaTEL−Rのプライマー対でコムギのゲノムからTaTEL−AおよびTaTEL−Bを別々に増幅させた。
PCRを用い、TaTEL−Aの端をそれぞれHindIIIおよびApaLI部位で固定した。同時に、TaTEL−Bの端をそれぞれApaLIおよびKpnI部位で固定した。HindIIIおよびApaLIにより二重消化されたTaTEL−AならびにApaLIおよびKpnIにより二重消化されたTaTEL−Bを次に、3重ライゲーションでpCambia1300−35S−G10のプラスミドにHindIIIおよびKpnI部位の間でクローニングした。得られたベクターpCambia1300−35S−G10−TaTELを構築し、そのT−DNA構造を図9に示した。クローンTaTEL遺伝子の全ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:9として示す。
ダイズからのTEL遺伝子のクローニング:
ダイズゲノムには2つのTEL遺伝子がある。2つの遺伝子を、それぞれGmTEL1−F/GmTEL1−RおよびGmTEL2−F/GmTEL2−R(表5参照)のプライマー対でPCRを用い、ダイズのゲノムDNAから増幅させた。それらのプロモーター領域、コード領域、およびターミネーターを含む得られたDNAフラグメントを、それぞれpGmTEL1−GmTEL1−terおよびpGmTEL2−GmTEL2−terとし、それらの全ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:15に示す。
ダイズゲノムには2つのTEL遺伝子がある。2つの遺伝子を、それぞれGmTEL1−F/GmTEL1−RおよびGmTEL2−F/GmTEL2−R(表5参照)のプライマー対でPCRを用い、ダイズのゲノムDNAから増幅させた。それらのプロモーター領域、コード領域、およびターミネーターを含む得られたDNAフラグメントを、それぞれpGmTEL1−GmTEL1−terおよびpGmTEL2−GmTEL2−terとし、それらの全ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:15に示す。
両フラグメントの端をPCRによってSalI部位で固定した。フラグメントpGmTEL1−GmTEL1−terをSalIで消化した後、プラスミドpCambia 1300−35S−G10にそのSalI部位で挿入した。結果、植物形質転換ベクターpCambia1300−35S−G10−GmTEL1が構築され、そのT−DNA構造を図10(A)に示す。同様に、HindIII siteおよびSalI部位をそれぞれpGmTEL2−GmTEL2−terの端に付加した。HindIII/SalI二重消化フラグメントpGmTEL2−GmTEL2−terをプラスミドpCambia1300−35S−G10にそのHindIIIおよびSalI部位の間で挿入した。得られたベクターはpCambia1300−35S−G10−GmTEL2であり、そのT−DNA構造は図10(B)に示す。
上で概説した技術的手順または当技術分野において知られる同等の手順を用い、TEL遺伝子ホモログは、これらに限定されないが、単子葉植物、双子葉植物、被子植物、および裸子植物を含むいずれかの植物種から単離および特性解析することができる。目的の植物の例としては、これらに限定されないが、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、トウガラシ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、アブラナ属、アルファルファ、ライムギ、キビ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、リンゴ、ナシ、モモ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観葉植物、および針葉樹が挙げられる。
野菜としては、これらに限定されないが、トマト、レタス、サヤインゲン、アオイマメ、エンドウマメ、キュウリ属のメンバー、例えばキュウリ、カンタループ、およびマスクメロンが挙げられる。観葉植物としては、これらに限定されないが、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクが挙げられる。好適には、本発明の植物は作物植物(例えば、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、トウガラシ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネ、等)、ならびにエネルギー作物、例えば、これらに限定されないが、スイッチグラス、アルンド、カメリア、ジャトロファ、およびススキである。
(実施例7)植物からのTEL遺伝子の配列分析
データベースを検索し、PCRベースのクローニングを用いることにより、さまざまな植物種から推定Mei2様遺伝子を得た。これらのTEL遺伝子のエンコードされたアミノ酸配列はSEQ ID NO:2、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、および46に挙げている。上で挙げたように、データベースにおいて同定することができる各種植物からのAML遺伝子はたくさんある。選択されたAMLタンパク質およびTELタンパク質のアミノ酸配列アラインメントに基づきVectorNTにより系統樹を構築した(図1)。系統樹には2つの異なるグループ、AMLグループおよびTELグループがある。従って、植物からのTEL遺伝子およびAML遺伝子は、それらのアミノ酸配列に基づく系統樹分析により区別することができる。
データベースを検索し、PCRベースのクローニングを用いることにより、さまざまな植物種から推定Mei2様遺伝子を得た。これらのTEL遺伝子のエンコードされたアミノ酸配列はSEQ ID NO:2、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、および46に挙げている。上で挙げたように、データベースにおいて同定することができる各種植物からのAML遺伝子はたくさんある。選択されたAMLタンパク質およびTELタンパク質のアミノ酸配列アラインメントに基づきVectorNTにより系統樹を構築した(図1)。系統樹には2つの異なるグループ、AMLグループおよびTELグループがある。従って、植物からのTEL遺伝子およびAML遺伝子は、それらのアミノ酸配列に基づく系統樹分析により区別することができる。
さまざまな植物種から発見されたTELタンパク質は互いに顕著な類似性を共有する。しかしながら、植物からのTELタンパク質のもっとも保存される部分はRRM3領域(図2)である。AMLタンパク質と比較して、TELタンパク質のもっとも驚くべき特性の2つは、RRM3ドメイン内のTEL特異的モチーフの追加の領域(図2)およびRRM3のC末端外の保存要素(図2)である。AMLタンパク質および酵母Mei2タンパク質はこれらの2つの特性のいずれも有さない。興味深いことに、O・タウリからのMei2様タンパク質は保存C末端TEL配列モチーフを含有するが、RRM3ドメイン内にTEL特異的モチーフは有さない。O・タウリは海洋緑藻の単細胞種であり、プラシノ藻綱に属し、緑色植物系列のなかでも早くに分化した種類である。同様に、O・タウリからのMei2様タンパク質は、近代植物のTELおよびAMLタンパク質両方の共通の祖先を代表している。
RRM3および保存領域外のそのC末端の一部からなるモチーフ(イネTELにおけるSEQ ID NO:4)は異なる植物TELタンパク質間でも高度に保存される。異なる植物種からの異なるTELタンパク質間でのこのモチーフの配列同一性は68%以上である。イネTELからのこのモチーフはO・タウリMei2様タンパク質からのモチーフと59%の同一性を共有する。しかしながら、このモチーフはいずれかの植物AMLタンパク質からのいずれのモチーフとも58%未満のアミノ酸配列同一性を共有する。
酵母Mei2タンパク質のRRM3ドメインは機能にとって重要なドメインである。よって、植物TELタンパク質のRRM3は収量向上においても重要な役割を果たし得る。しかしながら、RRM3のみが形質転換イネ研究においてTEL機能を保持していない。よって、RRM3ドメインに加えて、RRM3のC末端外の保存領域もその生物学的機能にとって重要であり得る。
(実施例8)植物TELタンパク質に対する抗体の作製およびTELタンパク質検出におけるそれらの使用
OsTELタンパク質の全長をエンコードするcDNAを、プライマーOsTEL−f (5’GGATCCATGGAGGAAGGAGGTGGGAGTGGC)およびOsTEL−r(5’CTCGAGCTAGTCAGTGTAGCCTAGGCGCTGTAGC)を用いるPT−PCRにより得た。PCR産物を、制限酵素部位BamHIおよびXhoIを用いてpET32b(Novagen)にクローニングし、発現ベクターpET32b−OsTELを得た。cDNA配列を完全に決定し(SEQ ID NO:56)、大腸菌における発現に用いた。発現したタンパク質はその後精製し、杭州市にある抗体作製会社がウサギ免疫するのに用いた。
OsTELタンパク質の全長をエンコードするcDNAを、プライマーOsTEL−f (5’GGATCCATGGAGGAAGGAGGTGGGAGTGGC)およびOsTEL−r(5’CTCGAGCTAGTCAGTGTAGCCTAGGCGCTGTAGC)を用いるPT−PCRにより得た。PCR産物を、制限酵素部位BamHIおよびXhoIを用いてpET32b(Novagen)にクローニングし、発現ベクターpET32b−OsTELを得た。cDNA配列を完全に決定し(SEQ ID NO:56)、大腸菌における発現に用いた。発現したタンパク質はその後精製し、杭州市にある抗体作製会社がウサギ免疫するのに用いた。
得られた抗血清を用い、追加のOsTEL遺伝子を発現する形質転換イネおよび内因性OsTEL発現のみを有する非形質転換イネの両方においてOsTELタンパク質を検出した。意義深いことに、形質転換イネ株ではより多くのOsTELタンパク質が検出された。
(実施例9)キャノーラの遺伝子形質転換
アブラナ形質転換の技術は当技術分野において周知である。アブラナの子葉、胚軸および茎はすべて、さまざまな研究者により形質転換の標的組織として用いられてきた。例えば、Moloney et al.(1989)は、子葉ペチオールの切断端はアグロバクテリウムバイナリーベクターを用いて容易に形質転換されることを見出した。Pua et al.(1987)は、最大10%の形質転換率の茎部の再生系を開発した。Moloney et al.(1989)は、標的組織としてペチオールを用い、形質転換率を55%まで上げた。
アブラナ形質転換の技術は当技術分野において周知である。アブラナの子葉、胚軸および茎はすべて、さまざまな研究者により形質転換の標的組織として用いられてきた。例えば、Moloney et al.(1989)は、子葉ペチオールの切断端はアグロバクテリウムバイナリーベクターを用いて容易に形質転換されることを見出した。Pua et al.(1987)は、最大10%の形質転換率の茎部の再生系を開発した。Moloney et al.(1989)は、標的組織としてペチオールを用い、形質転換率を55%まで上げた。
本明細書において用いたアブラナ形質転換の詳細な手順は以下のとおりである。アブラナの種子を0.5%の塩化第二水銀を用いて10分間殺菌した後、無菌水で3〜4回洗浄し、MS培地(30g/Lスクロースおよび6g/L寒天)でインキュベートした。暗室で2日間インキュベート後、種子を明16時間:暗8時間の光周期のインキュベーターへ移した。6〜8日後、無菌幼苗の胚軸を遺伝子形質転換のレシピエントとして切り落とした。胚軸を予備インキュベーション固体MS培地(1.0mg/L2.4−D、1.0mg/L6BA、30g/Lスクロース、および6g/L寒天)へ移し、72時間暗室でインキュベートした。予備インキュベートした胚軸を、pCambia1300−35S−G10−BrTELのプラスミドを含有するアグロバクテリウムの細胞懸濁液に8〜10分間浸漬した後、固体MS培地(1.0mg/L2.4−D、1.0mg/6BA、100MA、30g/Lスクロース、および6g/L寒天)(過剰なアグロバクテリウム懸濁液を、無菌吸収紙を用いて吸収後)へ移し、その後48時間暗室で培養した。
500mg/Lのセファログリシンを含有する無菌水で洗浄後、共インキュベートした胚軸を選択的固体MS培地(1.0mg/L2.4−D、1.0mg/L6BA、12mMグリホサート、500mg/Lセファログリシン、30g/Lスクロース、および8g/Lcanakeo)上に移し、少なくとも14日間光に当てながら培養後、分化固体MS培地(2.0mg/LZT、4.0mg/L6BA、5mg/LAgNO3、12mMグリホサート、500mg/Lセファログリシン、30g/Lスクロース、および8g/Lcanakeo)上で、耐性苗が育つまで2週間毎に培地を替えながら連続的に二次明培養した。耐性苗を茎分化固体MS培地(2.0mg/LZT、3.0mg/L6BA、5mg/LAgNO3、2mMグリホサート、500mg/Lセファログリシン、30g/Lスクロース、および8g/Lcanakeo)へ移し、光に当てながらキュベートした。茎が1cmまで伸びたら切り、発根固体MS培地(0.2mg/LIBA、30g/Lスクロース、および8g/Lcanakeo)で茎から根が出るまで7日間インキュベートした。
(実施例10)ダイズ形質転換
本明細書において用いた形質転換ダイズを得る手順は現行の技術(Deng et al.,1998,Plant Physiology Communications 34:381−387;Ma et al.,2008,Scientia Agricultura Sinica 41:661−668;Zhou et al.,2001,Journal of Northeast Agricultural University 32:313−319)である。健康で丸々と成熟したダイズを選択し、80%エタノールで2分間殺菌し、無菌水で洗浄し、塩素(50mlのNaClOおよび2mLの濃HClの化学反応で生成)で満たした乾燥機で4〜6時間殺菌した。殺菌したダイズをB5培地に播き、25℃で5日間90〜150μmolの光子m−2s−1の光強度でインキュベートした。子葉が緑色になり種子の殻が割れたら、無菌の発芽豆を取り出した。上胚軸および胚軸を取った発芽豆を縦半分に切り、2つの外植片と上胚軸および胚軸を得た。外植片に上胚軸および胚軸の節で7〜8回傷をつけ、インフェクションの標的組織として用いた。
本明細書において用いた形質転換ダイズを得る手順は現行の技術(Deng et al.,1998,Plant Physiology Communications 34:381−387;Ma et al.,2008,Scientia Agricultura Sinica 41:661−668;Zhou et al.,2001,Journal of Northeast Agricultural University 32:313−319)である。健康で丸々と成熟したダイズを選択し、80%エタノールで2分間殺菌し、無菌水で洗浄し、塩素(50mlのNaClOおよび2mLの濃HClの化学反応で生成)で満たした乾燥機で4〜6時間殺菌した。殺菌したダイズをB5培地に播き、25℃で5日間90〜150μmolの光子m−2s−1の光強度でインキュベートした。子葉が緑色になり種子の殻が割れたら、無菌の発芽豆を取り出した。上胚軸および胚軸を取った発芽豆を縦半分に切り、2つの外植片と上胚軸および胚軸を得た。外植片に上胚軸および胚軸の節で7〜8回傷をつけ、インフェクションの標的組織として用いた。
ベクターpCambia1300−35S−G10−GmTEL1およびpCambia1300−35S−G10−GmTEL2を含有するアグロバクテリウムの単一コロニーを別々に培養して用いた。用意した外植片をアグロバクテリウム細胞懸濁液に30分間浸漬した。次に感染した組織を、過剰な細胞懸濁液をきれいな無菌ろ紙で除去した後の1/10B5共培養培地に移し、25℃で3〜5日間暗室でインキュベートした。
共培養した組織をB5液媒で洗浄し、アグロバクテリウムを除去した後、固体B5培地に入れ、発芽のため5日間25℃でインキュベートした。発芽した組織を0.1〜0.5mMのグリホサートを含有する選択的B5培地へ移し、25℃で光に当てながら4週間、2週間毎に培地を替えてインキュベートした。選択された幼芽組織を光に当てながら25℃での生育培養のため固体MS培地に移した。次に、形質転換幼苗は発根培養のため1/2B5培地へ移した。最後に、作製された小植物を洗浄して寒天を除去し、さらなる特性解析のため温室に植えた。
(実施例11)内因性遺伝子の近くへのエンハンサーの挿入によるTEL遺伝子発現の増大
遺伝子学では、エンハンサーは、遺伝子集団における遺伝子の転写レベルを(その名のとおり)向上させるための、タンパク質と結合することができるDNAの短い領域(すなわち、転写因子にかなり近い、トランス作用性因子)である。エンハンサーは通常シス作用性であるが、作用する遺伝子にとくに近づく必要はなく、場合によっては同じ染色体上にある必要もない(Spilianakis et al.(2005)Nature 435(7042):637-45.doi:10.1038/nature03574.PMID15880101)。エンハンサーは制御する遺伝子の上流または下流に位置していてもよい。さらに、エンハンサーは、出発部位の塩基対数十万個分も上流または下流に位置するものがいくつか見出されているように、転写に影響を与えるために転写開始部位の近くに位置する必要はない。エンハンサーはプロモーター領域自体には作用しないが、アクチベータータンパク質に結合される。これらのアクチベータータンパク質は、ポリメラーゼIIおよび一般的な転写因子をリクルートし、遺伝子の転写を開始するメディエーター複合体と相互作用する。エンハンサーはイントロン内で見ることもできる。エンハンサーの配向性はその機能に影響することなく逆でさえあり得る。加えて、エンハンサーは染色体のどこで消費および挿入してもよく、遺伝子転写に依然として影響を及ぼす。
遺伝子学では、エンハンサーは、遺伝子集団における遺伝子の転写レベルを(その名のとおり)向上させるための、タンパク質と結合することができるDNAの短い領域(すなわち、転写因子にかなり近い、トランス作用性因子)である。エンハンサーは通常シス作用性であるが、作用する遺伝子にとくに近づく必要はなく、場合によっては同じ染色体上にある必要もない(Spilianakis et al.(2005)Nature 435(7042):637-45.doi:10.1038/nature03574.PMID15880101)。エンハンサーは制御する遺伝子の上流または下流に位置していてもよい。さらに、エンハンサーは、出発部位の塩基対数十万個分も上流または下流に位置するものがいくつか見出されているように、転写に影響を与えるために転写開始部位の近くに位置する必要はない。エンハンサーはプロモーター領域自体には作用しないが、アクチベータータンパク質に結合される。これらのアクチベータータンパク質は、ポリメラーゼIIおよび一般的な転写因子をリクルートし、遺伝子の転写を開始するメディエーター複合体と相互作用する。エンハンサーはイントロン内で見ることもできる。エンハンサーの配向性はその機能に影響することなく逆でさえあり得る。加えて、エンハンサーは染色体のどこで消費および挿入してもよく、遺伝子転写に依然として影響を及ぼす。
TALEN法により、トウモロコシのTEL遺伝子の下流の領域を選択し、二重35Sエンハンサーを含有する発現カセットを挿入した。標的領域は:Ctgtttatacaagagccctatcaatgatggcctaaatacggagactactagatcaactaac(SEQ ID NO:58)とした。他の近くの領域もエンハンサー挿入には十分である。G10evo遺伝子(EPSPS、SEQ ID NO:48)の発現カセットは、2つの35Sエンハンサーを含有する二重35Sプロモーターを有する。G10evoEPSPシンターゼは形質転換の選択性マーカーとしてグリホサート耐性をもたらすが、35Sプロモーターは隣接する領域に位置するTEL遺伝子の発現を増大させるエンハンサーエレメントをもたらす。
形質転換ベクターを構築するため、G10evo発現カセットおよびトウモロコシにおける標的配列のどちらの側にも隣接する配列を含むDNAフラグメントを構築した(SEQ ID NO:59)。このフラグメントはその端にXhI部位およびKpnI部位を有し、同じ2つの酵素、XhoIおよびKpnIで予め消化したpCambia1300にクローニングした。得られたベクターはpCambia1300−35S−G10−Recとした。
トウモロコシゲノムにおいて標的化された配列(SEQ ID NO:58)はTEL遺伝子の約3kb下流である。この標的配列に基づき、1対のデザイナーTALEN、TALEN−FおよびTALEN−Rを設計および合成する。TALEN−FおよびTALEN−Rの発現カセットをそれぞれCaMV35Sプロモーターおよびイネアクチンプロモーターを用いて構築する。TALEN−LおよびTALEN−Rを含有する発現カセットのDNA配列は、それぞれSEQ ID NO:60およびSEQ ID NO:61に示す。その端にHindIIIおよびEcoRI制限部位を有するTALEN−FカセットのDNAフラグメント、ならびにその端にEcoRIおよびKpnI制限部位を有するTALEN−RカセットのDNAフラグメントは3重ライゲーションでHindIIIおよびKpnIにより予め消化したpCambia1300−35S−G10−Recにライゲーションする。得られたベクターpCambia1300−35S−G10−Rec−TALEN−FRは、TALEN−FおよびTALEN−Rの両方の発現カセットを含有する(図10)。
pCambia1300−35S−G10−Rec−TALEN−FRをアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404に形質転換し、トウモロコシを形質転換するのに用いる。2mMのグリホサートを含有する選択培地をカルス培養選択に用いる。得られた形質転換トウモロコシ植物をPCR法により標的領域に正しく挿入されたイベントについてスクリーニングする。
当技術分野において知られる標的化遺伝子挿入の他の方法を用い、転写エンハンサーを所望の植物種のTEL遺伝子の近くの領域に導入することができる。このようにして、内因性遺伝子の発現を通常の内因性のレベルを超えて増加させ、植物活力の増大および収量の増加をもたらすことができる。収量を増大させるこの方法は単独で、または活力および/または収量が増加した植物を作製するように異種遺伝子と組み合わせて用いることができる。
以下の配列を配列表に含める。
本発明は分子生物学、生物化学および組織培養学における多くの技術を用いた。これらの技術は当技術分野において利用可能である。技術の詳細な方法についてはCurrent Protocols in Molecular Biology(ed.by Ausubel,John Wiley and Sons Pres)およびMolecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED(ed.by J.Sambrook,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)を参照することができる。
本明細書に記載したすべての文献および特許文献は当業者のレベルを示すものである。すべての文献および特許文献は本明細書に参照により、各個別の文献または特許文献が具体的にかつ個別に本明細書に参照により組み入れられるのと同じ程度に組み入れられる。
前述の発明は明確な理解を目的として例示のためいくらか詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正を行うことができることは明らかである。
Claims (19)
- 目的の植物における植物成長および/または収量の増加方法であって、前記方法がTEL配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むDNA構築物で前記植物を形質転換するステップを含み、前記TEL配列が以下の特性の少なくとも1つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする、方法:
i)SEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列;
ii)4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが前記植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列;
iii)RRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを含むアミノ酸配列を有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存される、前記アミノ酸配列:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);および
iv)SEQ ID NO:1と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列。 - 前記DNA構築物が、前記プロモーターおよびTEL配列と操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも1つのエンハンサーをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのエンハンサーが、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)からの35Sエンハンサーである、請求項2に記載の方法。
- 前記TEL配列が、合成配列である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモーターが、TELプロモーターである、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TEL配列が、SEQ ID NO:4と少なくとも58%の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードし、少なくとも1つのTELモチーフを含む、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 目的の植物における植物成長および/または収量の増加方法であって、前記方法が、前記少なくとも1つのエンハンサーのゲノムをTEL遺伝子の約30kb以内に組み入れるステップを含む方法。
- 前記少なくとも1つのエンハンサーが、CaMVからの35Sエンハンサーである、請求項7に記載の方法。
- 対照植物と比較して増加したTEL配列の発現を示す形質転換植物であって、前記植物がそのゲノム中にTEL配列と操作可能に連結した植物における発現を駆動するプロモーターを含むDNA構築物を安定に組み入れ、前記TEL配列が以下の特性の少なくとも1つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質をエンコードする、形質転換植物:
i)SEQ ID NO:4と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列;
ii)4つの残基Asn−His−Cys−Ileの少なくとも3つが前記植物に保存されるTEL RNA認識モチーフ(RRM3)を有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列;
iii)RRM3ドメインのC末端外にTEL特異的保存モチーフを含むアミノ酸配列を有し、以下のペプチド中の10個の残基の少なくとも7個が保存される、前記アミノ酸配列:
Lys/Arg−Phe−Pro/Ala−Cys−Asp/Glu−N−Asp/Glu−N−Tyr−Leu−Pro−Leu/Val(Nはいずれかの残基を表す);および
iv)SEQ ID NO:1と少なくとも58%の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列。 - 前記DNA構築物が、前記TEL配列と操作可能に連結した植物における遺伝子の発現を増大させる少なくとも1つのエンハンサーをさらに含む、請求項9に記載の形質転換植物。
- 前記少なくとも1つのエンハンサーが、CaMVからの35Sエンハンサーである、請求項10に記載の形質転換植物。
- 前記TEL配列が、合成配列である、請求項9〜11のいずれか1項に記載の形質転換植物。
- 前記プロモーターが、TELプロモーターである、請求項9〜12のいずれか1項に記載の形質転換植物。
- 前記TELプロモーターが、前記TEL配列と相同である、請求項13に記載の形質転換植物。
- 前記TEL配列が、内因性配列である、請求項14に記載の形質転換植物。
- 対照植物と比較して増加したTEL配列の発現を示す形質転換植物であって、前記植物が、そのゲノム中に少なくとも1つのエンハンサーを前記TEL遺伝子の約30kb以内で組み入れられた、形質転換植物。
- 前記少なくとも1つのエンハンサーが、CaMVからの35Sエンハンサーである、請求項16に記載の形質転換植物。
- 請求項9〜17のいずれか1項に記載の植物からの形質転換種子。
- 前記植物が、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、アブラナ科植物、ワタ、イネ、ダイズ、オオムギ、ヒマワリ、サトウキビ、針葉樹、ススキ、スイッチグラス、およびナタネからなる群から選択される、請求項9〜17のいずれか1項に記載の形質転換植物。
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